本發(fā)明屬于植物分子生物學(xué)領(lǐng)域，尤其是農(nóng)業(yè)生物技術(shù)研究中的轉(zhuǎn)基因農(nóng)作物育種領(lǐng)域，特別是涉及具有草甘膦抗性的棉花轉(zhuǎn)化事件。

背景技術(shù)：

全球人口在迅速增長，據(jù)估計到2025年全球人口將由2014年的70億增加到85億，全球糧食安全面臨巨大挑戰(zhàn)。事實上，通過常規(guī)的品種改良和栽培技術(shù)改進，特別是殺蟲劑的使用，糧食生產(chǎn)在過去幾十年已經(jīng)顯著提高。上世紀60年代興起的細胞遺傳學(xué)和細胞生物學(xué)技術(shù)引發(fā)了“綠色革命”，使糧食作物的產(chǎn)量顯著提高、抗病性和抗蟲性明顯增強。然而，這些技術(shù)的廣泛采用也同時給環(huán)境和人類健康帶來一些新的問題，如農(nóng)藥和化肥的使用導(dǎo)致土壤侵蝕加劇。同時，在這些技術(shù)使用20年后，對糧食增產(chǎn)的貢獻也明顯減少。為克服這些問題，來自于政府、大學(xué)、研究機構(gòu)及公司的科學(xué)家們正在尋求新的技術(shù)和方法。隨著充足DNA技術(shù)的發(fā)展，到上世紀80年代科學(xué)家們已經(jīng)開發(fā)出一些新的現(xiàn)代育種技術(shù)和方法，其中利用農(nóng)桿菌介導(dǎo)轉(zhuǎn)化和基因槍轉(zhuǎn)化的轉(zhuǎn)基因技術(shù)是最為成功的一項。

自1996年世界第一個轉(zhuǎn)基因作物的商業(yè)化被批準開始，全球轉(zhuǎn)基因作物的種植面積增加了106倍，2014年全球轉(zhuǎn)基因作物種植面積為創(chuàng)紀錄的1.815億公頃。種植轉(zhuǎn)基因作物的國家也增加到28個。其中美國、阿根廷、巴西、加拿大和中國是主要轉(zhuǎn)基因作物種植國家。就轉(zhuǎn)基因性狀而言，目前通過轉(zhuǎn)基因技術(shù)導(dǎo)入并商業(yè)化開發(fā)的最重要性狀當屬抗除草劑，2014年抗除草劑的轉(zhuǎn)基因作物(主要包括大豆、玉米、棉花、油菜)種植面積約為10160萬公頃，約占全球轉(zhuǎn)基因作物種植面積的56％；其次是抗蟲性，抗蟲轉(zhuǎn)基因作物(主要是玉米、棉花和其他作物)面積約為2722萬公頃，約占15％；復(fù)合性狀轉(zhuǎn)基因作物約占28％。Klumper和Qaim(2014)利用在世界各地進行的農(nóng)場調(diào)查或者田間試驗得出的原始數(shù)據(jù)對過去20年147項已知轉(zhuǎn)基因作物研究進行了綜合分析，并且報告了轉(zhuǎn)基因大豆、玉米或者棉花在作物產(chǎn)量、農(nóng)藥的使用和農(nóng)民利潤方面的影響。該綜合分析的結(jié)論是“轉(zhuǎn)基因技術(shù)的采用使化學(xué)農(nóng)藥的使用減少了37％，作物產(chǎn)量增加22％，農(nóng)民利潤增加68％。

棉花是全球最重要的植物纖維作物，主要種植于熱帶或亞熱帶的干旱地區(qū)。草害嚴重威脅著棉花的品質(zhì)和產(chǎn)量。除草劑的推廣使用，可大幅度減少棉田管理用工，降低勞動強度。目前推廣的棉花品種對除草劑不具有抗性，經(jīng)常出現(xiàn)藥害現(xiàn)象，對棉花植株造成一定的損傷，培育抗除草劑作物品種是防止除草劑藥害最有效的途徑。因此，本領(lǐng)域持續(xù)需要培育更多的防止除草劑藥害的抗除草劑作物品種。

技術(shù)實現(xiàn)要素：

本發(fā)明人通過轉(zhuǎn)基因方法獲得了一種轉(zhuǎn)化事件，發(fā)明人將其命名為aQ51-1。該轉(zhuǎn)化事件具有穩(wěn)定的高抗草甘膦性狀。其代表性陸地棉(Gossypium hirsutum)種子已于2015年05月28日保藏于中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心(CGMCC，地址：北京市朝陽區(qū)北辰西路1號院中國科學(xué)院微生物研究所郵政編碼：100101)，保藏編號為：CGMCC No10490。

本發(fā)明第一方面提供了一種棉花轉(zhuǎn)化事件aQ51-1，其特征在于其DNA序列如SEQ ID No：25所示，其由第1154-9044bp的T-DNA插入序列、第1-1153bp的上游側(cè)翼棉花基因組序列和第9045-10295bp的下游側(cè)翼棉花基因組序列構(gòu)成。

本發(fā)明第二方面提供了一個DNA序列，所述DNA序列包含本發(fā)明第一方面所述的T-DNA插入序列(即SEQ ID No：25第1154-9044bp)和所述側(cè)翼棉花基因組序列(即SEQ ID No：25第1-1153bp的上游側(cè)翼棉花基因組序列和第9045-10295bp的下游側(cè)翼棉花基因組序列)。

本發(fā)明第三方面提供一種重組載體，所述重組載體含有本發(fā)明第一方面所述的T-DNA插入序列(即SEQ ID No：25第1154-9044bp)。在一個實施方案中，所述載體為圖2中的pBI121-BHR4-BHR5載體。

本發(fā)明第四方面提供了一種重組細胞，其含有本發(fā)明第三方面所述的重組載體。所述重組細胞優(yōu)選細菌。在一個實施方案中，所述重組細胞為含有本發(fā)明第三方面所述的重組載體的重組農(nóng)桿菌細胞。

本發(fā)明第五方面提供了用于檢測本發(fā)明第一方面所述的棉花轉(zhuǎn)化事件的引物對，其由特異性識別本發(fā)明第一方面所述的任一側(cè)的側(cè)翼序列的第一引物和特異性識別本發(fā)明第一方面所述的T-DNA插入序列的第二引物組成。在一些實施方案中，所述第一引物的序列為SEQ ID NO：26，所述第二引物的序列為SEQ ID NO:27。在另一些實施方案中，所述第一引物的序列為SEQ ID NO:28，所述第二引物的序列為SEQ ID NO:29。

本發(fā)明第六方面提供了一種鑒定棉花生物樣品中轉(zhuǎn)化事件aQ51-1的方法，其包括：

(a)從待鑒定的棉花生物樣品提取DNA樣品；

(b)以提取的DNA樣品為模板，使用本發(fā)明第五方面所述的引物對進行PCR擴增；

(c)檢測PCR擴增產(chǎn)物，如果擴增產(chǎn)物長度與SEQ ID NO：25上所述PCR引物對的序列之間的理論長度一致，則表明所述棉花生物樣品中aQ51-1轉(zhuǎn)化事件的存在。

本發(fā)明第七方面提供了本發(fā)明第一方面所述棉花轉(zhuǎn)化事件向不同棉花育種材料中轉(zhuǎn)移的方法，所述方法包括：

將含有本發(fā)明第一方面所述的轉(zhuǎn)化事件的棉花材料與其他棉花育種材料進行雜交后，進一步進行回交，獲得含有本發(fā)明第一方面所述的轉(zhuǎn)化事件的新材料；

在雜交及回交過程中，利用本發(fā)明第六方面所述的方法在后代群體中進行篩選鑒定，確認本發(fā)明第一方面所述的轉(zhuǎn)化事件的存在。

本發(fā)明第八方面提供了本發(fā)明第一方面所述的轉(zhuǎn)化事件、本發(fā)明第二方面所述的DNA分子、本發(fā)明第三方面所述的重組載體或本發(fā)明第四方面所述的重組細胞、本發(fā)明第六和第七方面所述的方法用于提高棉花抗草甘膦性狀、進行植物育種以及用作分子標記的用途。

附圖說明

圖1示出了植物表達載體pBI121-BHR4-BHR5的構(gòu)建流程。

圖2示出了植物表達載體pBI121-BHR4-BHR5。

圖3示出了以受體材料冀棉14DNA為模板，使用序列分別為SEQ ID No:23和SEQ ID No:24的引物對，擴增得到大小為420bp左右的擴增產(chǎn)物，測序后與aQ51-1的旁側(cè)序列比對的結(jié)果。

圖4示出了利用引物對aQ51-1-RB5’(SEQ ID NO:26)/aQ51-1-RB3’(SEQ ID NO:27)、aQ51-1LB5’(SEQ ID NO:28)/aQ51-1LB3’(SEQ ID NO:29)分別擴增aQ51-1T1(1-9)、冀棉14-1、冀棉14-2的棉花樣品的結(jié)果。在圖中：M：marker，λDNA/HindIII+EcoRI；1-9：aQ51-1-RB5’/aQ51-1-RB3’擴增aQ51-1T1(1-9)；10：冀棉14-1；11：冀棉14-2；12：陰性對照，陽性擴增條帶1529bp；13-24：aQ51-1-RB5’/aQ51-1-RB3’擴增aQ51-1T1(13-9)；22：冀棉14-1；23：冀棉14-2；24：陰性對照，陽性擴增條帶880bp。更具體如下：M:Marker/DL2000；1:aQ51-1-1；2:aQ51-1-2；3:aQ51-1-3；4:aQ51-1-4；5:aQ51-1-5；6:aQ51-1-6；7:aQ51-1-7；8:aQ51-1-8；9:aQ51-1-9；10:J14；11:J14；12:ddH2O；13:aQ51-1-1；14:aQ51-1-2；15:aQ51-1-3；16:aQ51-1-4；17:aQ51-1-5；18:aQ51-1-6；19:aQ51-1-7；20:aQ51-1-8；21:aQ51-1-9；22:J14；23:J14；24:ddH2O。

具體實施方式

在本發(fā)明中，“轉(zhuǎn)化事件”是指將外源序列通過農(nóng)桿菌介導(dǎo)遺傳轉(zhuǎn)化方法(本領(lǐng)域技 術(shù)人員公知)轉(zhuǎn)化到棉花細胞中，并進一步獲得的轉(zhuǎn)基因棉花植株中外源序列在棉花基因組中的目標位置插入并整合的事件；“轉(zhuǎn)化事件”并不是一種植物細胞或植株，植物細胞或植株僅僅是轉(zhuǎn)化事件存在的載體；“轉(zhuǎn)化事件”的核心特征是外源序列在植物基因組中目標位置的插入所形成的外源插入序列和棉花基因組序列連接的一段特征DNA序列。

實施例

下面結(jié)合非限制性實施例對本發(fā)明進行進一步說明。

實施例1.植物表達載體構(gòu)建

根據(jù)公布的OK序列(Richards et al.,1987,Eur.J.Biochem.84,513-519；Kozak M,1986,Cell,44,283-92)及PS序列(郭三堆等，2000，中國農(nóng)業(yè)科技導(dǎo)報，2,21-26)合成OK-Pst I-Xho I-PS片段，兩端分別帶BamH I和Sac I酶切位點，在OK與PS之間以Pst I、Xho I兩酶切位點相連，兩個酶切位點間插入保護堿基便于后續(xù)的酶切構(gòu)建。以pBI121(購自北京華夏遠洋科技有限公司)為模板擴增Tnos片段，兩端分別帶Sac I和Hind III酶切位點，引物序列如SEQ ID No:1及SEQ ID No:2所示。利用BamH I和Sac I將OK-Pst I-Xho I-PS酶切并利用Hind III和Sac I將所述Tnos片段酶切，構(gòu)建到pUC57(購自金斯瑞生物科技有限責(zé)任公司)中，獲得重組質(zhì)粒OK-PS-Tnos-pUC57。人工合成BHR4片段，其序列如SEQ ID No:3所示，利用兩端的酶切位點將BHR4連入OK-PS-Tnos-pUC57中，獲得重組質(zhì)粒OK-BHR4-PS-Tnos-pUC57。以pCambia2300(購自北京鼎國昌盛生物技術(shù)有限責(zé)任公司)為模板擴增35S片段，兩端分別帶Xba I和BamH I酶切位點，引物序列如SEQ ID No:5及SEQ ID No:6所示。利用BamH I和HindIII將OK-BHR4-PS-Tnos-pUC57酶切并利用Xba I和BamH I將所述35S片段酶切，構(gòu)建到pBS(pBulescript，購自Fermentas公司)中，獲得重組質(zhì)粒35S-OK-PS-BHR4-Tnos-pBS。

合成35S改啟動子，其序列如SEQ ID No:7所示，利用兩端的酶切位點將35S改連入35S-OK-PS-BHR4-Tnos-pBS，獲得重組質(zhì)粒35S改-OK-PS-BHR4-Tnos-pBS。PCR擴增BHR5序列片段，其序列如SEQ ID No:8所示，引物序列如SEQ ID No:9及SEQ ID No:10所示。利用兩端的酶切位點將所述BHR5序列片段連入OK-PS-Tnos-pUC57中，獲得重組質(zhì)粒OK-BHR5-PS-Tnos-pUC57，利用Pst I和HindIII將OK-BHR5-PS-Tnos，構(gòu)建到35S改-OK-PS-BHR4-Tnos-pBS中，獲得重組質(zhì)粒35S改-OK-PS-BHR5-Tnos-pBS。

等量混合linker+和linker-(序列分別如SEQ ID No:11和SEQ ID No:12所示)，70℃保溫10分鐘，后緩慢降到室溫。利用Hind III和EcoR I，構(gòu)建到載體pBI121，獲得pBI121-2。利用Spe I和EcoR I將35S改-OK-PS-BHR5-Tnos構(gòu)建到pBI121-2，獲得pBI121-BHR5。利用Xba I和Kpn I將35S-OK-PS-BHR4-Tnos構(gòu)建到pBI121-BHR5，獲得 pBI121-BHR4-BHR5。構(gòu)建流程見圖1，合成的植物表達載體pBI121-BHR4-BHR5見圖2。

實施例2.陸地棉(Gossypium hirsutum)的遺傳轉(zhuǎn)化

利用農(nóng)桿菌介導(dǎo)的遺傳轉(zhuǎn)化方法，用實施例1中獲得的pBI121-BHR4-BHR5載體轉(zhuǎn)化冀棉14(國家棉花中期庫，獲取單位中國棉花研究所，統(tǒng)一編號：ZM-30270)下胚軸。

挑取含有pBI121-BHR4-BHR5載體的農(nóng)桿菌LBA4404(購自Biovector Science Lab,Inc)，接種至含卡那霉素(kanamycin，km)50mg/L、利福平(rifampicin，rif)50mg/L和鏈霉素(streptomycin，S/Sm)50mg/L的LB液體培養(yǎng)基(酵母提取物(Yeast extract)5g/L、胰蛋白胨(Tryptone)10g/L、氯化鈉(NaCl)10g/L)，28℃振蕩暗培養(yǎng)過夜到細菌生長對數(shù)期。以菌液：培養(yǎng)基1：50-1：100的比例用LB或體培養(yǎng)基稀釋菌液，再振蕩培養(yǎng)4-6h，將菌液稀釋至OD600值0.8-1.0。

轉(zhuǎn)基因受體材料為冀棉14，取生長3-4天的無菌苗下胚軸，切成0.6-0.8cm的段，浸染10-15min，取出下胚軸段，置共培養(yǎng)培養(yǎng)基(MSB(Murashige and Skoog鹽培養(yǎng)基)+KT(激動素)0.1mg/L+2,4-D(2，4-二氯苯氧乙酸)0.1mg/L)，22℃-25℃共培養(yǎng)2天。轉(zhuǎn)至愈傷誘導(dǎo)培養(yǎng)基(MSB+KT 0.1mg/L+2,4-D 0.1mg/L+Kan(卡那霉素)50mg/L)20-30天繼代一次，90天后轉(zhuǎn)接至愈傷增殖培養(yǎng)基(MSB+KT 0.1mg/L+2,4-D 0.05mg/L+Kan 50mg/L)，20-30天繼代一次，待長出胚性愈傷后，將胚性愈傷繼代至萌發(fā)培養(yǎng)基(MSB+KT 0.1mg/L+Kan 50mg/L)，40天左右挑取萌發(fā)的綠芽至生根培養(yǎng)基(SH(Schenk and Hildebrandt Medium)+Kan 50mg/L)進行篩選，進而獲得小苗和可嫁接抗性植株300株?？剐灾仓杲?jīng)過PCR鑒定后嫁接并移栽，獲得aQ系列棉花共219株。

實施例3.轉(zhuǎn)基因材料的篩選鑒定

草甘膦耐受性棉花事件aQ51-1選自很多耐受草甘膦營養(yǎng)性和生殖性傷害的轉(zhuǎn)基因棉花事件。本發(fā)明中，aQ51-1是通過大量不同的包括pBI121-BHR4-BHR5的DNA構(gòu)建體轉(zhuǎn)化的219個T0事件(這些事件在實施例2中得到)中一個事件。通過一系列的分子分析和草甘膦耐受性篩選從許多事件中選擇aQ51-1事件。具體如下：

T0代棉花草甘膦耐受性篩選，在溫室大棚草甘膦耐受性測試中，對植物的營養(yǎng)性和生殖性進行評分，從而篩選事件。所有植物都在溫室大棚內(nèi)生長，隨后在8葉期噴灑Roundup(含草甘膦的抗除草劑，41％草甘膦異丙胺鹽水劑)，Roundup原液用量250g/畝。施用草甘膦7天后，評價植物受到的植物性傷害。具有良好營養(yǎng)性耐性的事件繼續(xù)生長至成熟，并觀察生殖性。具有良好的營養(yǎng)性及生殖性的轉(zhuǎn)化事件用來做進一步的試驗。

通過DNA印跡分析符合Roundup營養(yǎng)性和生殖性的耐受標準的事件的拷貝數(shù)。對 在T0代表現(xiàn)良好耐受性的單拷貝事件進一步進行田間耐受試驗。在2-4葉期、6-8葉期、封行期、60％結(jié)鈴期噴施Roundup(含草甘膦的抗除草劑，41％草甘膦異丙胺鹽水劑)，Roundup原液用量250g/畝。獲得具有良好的營養(yǎng)性及生殖性的轉(zhuǎn)化事件aQ51-1。

實施例4.旁側(cè)序列分析

樣品制備：用本領(lǐng)域常用的植物DNA提取方法提取含有aQ51-1轉(zhuǎn)化事件的棉花材料的基因組DNA，取2.5μg DNA，分別Hind III消化6-8小時，酒精沉淀純化后加適量水溶解。

連接接頭：根據(jù)載體酶切位點分析，分別設(shè)計合成兩對接頭：

GenomeWalker Adaptor+Hind III和GenomeWalker Adaptor–Hind III(序列分別如SEQ ID No:13和SEQ ID No:14所示)，其中SEQ ID No:14的5’端進行了磷酸化，3’端加氨基。

等量混合GenomeWalker Adaptor+Hind III和GenomeWalker Adaptor–Hind III，70℃保溫10分鐘，后緩慢降到室溫。取4μl消化純化的DNA加到含1.9μl GenomeWalker Adaptor(25μM)，1.6μl 10X連接緩沖液，0.5μl T4DNA連接酶(6單位/μl)，在16℃下過夜培養(yǎng)，停止反應(yīng)，在70℃下水浴5min，在每個管中，加入72μl TE(10/1,pH7.5)，在低速下振蕩5-10sec。

使用Clontech GenomeWalker^TM Universal試劑盒，利用引物AP1和GSP1-Hind III(序列分別如SEQ ID No:15和SEQ ID No:16所示)，以連接產(chǎn)物為模板，進行第一輪擴增：7個循環(huán):94℃25sec,72℃6min；32個循環(huán):94℃25sec，67℃6min；最后一個循環(huán)后再于67℃保溫7分鐘。PCR產(chǎn)物稀釋50倍后，用AP2和GSP2-Hind III(序列分別如SEQ ID No:17和SEQ ID No:18，所示)進行第二輪PCR擴增，PCR程序如下：5循環(huán):94℃25sec,72℃5min；20循環(huán):94℃25sec,67℃5min；最后一個循環(huán)后再于67℃保溫10分鐘。產(chǎn)物回收測序。

對aQ51-1事件的左邊界(LB)端序列分析，共獲得2583bp的核苷酸序列(序列如SEQ ID No:19所示)，包括1bp-243bp為BHR5的部分序列，第244bp-717bp為PS-Tnos序列，第718bp-1332bp為BHR5表達盒到LB內(nèi)側(cè)的載體序列，第1333bp-2583bp為棉花DNA序列。

序列說明：

RB端序列分析，根據(jù)所獲得的棉花側(cè)翼序列，利用公布的二倍體棉花(Gossypium raimondii)D染色體組基因組序列(http://www.phytozome.net/cotton.php)進行對比分析，設(shè)計下游引物RBflank51’(SEQ ID NO:20)。以aQ51-1基因組DNA為模板，用RBflank51’和GSP2-NPTII31’(SEQ ID No:21所示)進行PCR擴增，PCR程序如下：35循環(huán):94℃25sec,67℃5min；最后一個循環(huán)后再于67℃保溫10分鐘。產(chǎn)物回收測序。

對aQ51-1事件的RB端序列分析，共獲得2438bp核苷酸序列(序列如SEQ ID No:22)， 包括，第1bp-1153bp為棉花DNA序列，第1154bp-1459bp為Pnos啟動子序列，第1460bp-1473bp是Pnos與NPTII之間的連接序列，1474bp-2268bp是NPTII序列，2269bp-2438bp是NPTII與Tnos之間的連接序列。

序列說明：

以受體材料冀棉14DNA為模板，分別在插入序列的RB和LB端側(cè)翼棉花基因組序列設(shè)計引物(序列分別如SEQ ID No:23和SEQ ID No:24所示)，得到大小為420bp左右的擴增產(chǎn)物，與aQ51-1的旁側(cè)序列比對發(fā)現(xiàn)，該事件通過插入序列替換原基因組序列上60bp堿基獲得的。比對結(jié)果見圖3。

根據(jù)以上結(jié)果，本領(lǐng)域技術(shù)人員可容易得出aQ51-1事件的特征DNA序列(SEQ ID NO:25)，如下所示，加下劃線部分示出的是T-DNA插入序列，未加下劃線部分示出的是插入序列的側(cè)翼棉花基因組DNA序列。

實施例5.轉(zhuǎn)化事件檢測

使用DNA引物對進行PCR擴增以檢測aQ51-1事件，所述引物對由特異性識別本發(fā)明T-DNA插入序列的第一引物和特異性識別所述插入序列任一側(cè)翼序列的第二引物組成。aQ51-1插入序列及鑒定引物如本文所述。例如，當?shù)谝灰餅閍Q51-1-RB5’(SEQ ID NO:26)時，第二引物為aQ51-1-RB3’(SEQ ID NO:27)；當?shù)谝灰餅閍Q51-1LB5’(SEQ ID NO:28)時，第二引物為aQ51-1LB3’(SEQ ID NO:30)。

利用上述引物對進行PCR鑒定使用本領(lǐng)域常用的方法。利用引物對aQ51-1-RB5’(SEQ ID NO:26)/aQ51-1-RB3’(SEQ ID NO:27)、aQ51-1LB5’(SEQ ID NO:28)/aQ51-1LB3’(SEQ ID NO:29)分別擴增aQ51-1T1(1-9)、冀棉14-1、冀棉14-2的棉花樣品的結(jié)果如圖4所示。

實施例6.染色體定位

根據(jù)所獲得的棉花側(cè)翼序列，利用公布的二倍體棉花(Gossypium raimondii)D染色體組基因組序列(http://www.phytozome.net/cotton.php)進行對比分析，可知aQ51-1事件中，與插入序列接合的棉花側(cè)翼DNA序列與D2染色體上的序列高度同源，因此可知，aQ51-1事件中外源DNA插入序列的整合位點位于受體四倍體棉花的D基因組第2組染色體上。其代表性棉花(Gossypium raimondii)種子已于2015年05月28日保藏于中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心(CGMCC，地址：北京市朝陽區(qū)北辰西路1號院中國科學(xué)院微生物研究所郵政編碼：100101)，保藏編號為：CGMCC No10490。

其他序列如下：