本發(fā)明涉及生物
技術(shù)領(lǐng)域：
，具體地，涉及構(gòu)建測序文庫的方法及設(shè)備，以及測序的方法及系統(tǒng)。
背景技術(shù)：
：隨著高通量測序技術(shù)的應(yīng)用和發(fā)展，第二代測序平臺日趨成熟、穩(wěn)定，存在的主要問題是文庫制備步驟繁瑣、成本居高不下，所以第二代基因測序還無法滿足市場的要求，走入千家萬戶。解決這個問題的關(guān)鍵在于減少起始樣本的投入量和簡化文庫制備步驟。傳統(tǒng)從總RNA中構(gòu)建cDNA文庫需要依賴oligo(dT)，從而將信息RNA捕獲出來。這些信息再通過反轉(zhuǎn)錄合成一鏈和二鏈，加上接頭，再經(jīng)過PCR擴(kuò)增形成適用于高通量測序的cDNA文庫。目前存在的方法有一個局限在于開始投入的RNA產(chǎn)量需要達(dá)到數(shù)百ng到μg之間，以滿足在多種酶反應(yīng)過程中和在PCR擴(kuò)增前一系列純化回收步驟導(dǎo)致的丟失。因而，目前關(guān)于從總RNA中構(gòu)建cDNA文庫的相關(guān)研究仍有待深入。技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：本發(fā)明旨在至少在一定程度上解決相關(guān)技術(shù)中的技術(shù)問題之一。為此，本發(fā)明的一個目的在于提出一種從非常低的RNA投入量構(gòu)建cDNA文庫適用于高通量測序的構(gòu)建測序文庫的方法。在本發(fā)明的第一方面，本發(fā)明提供了一種構(gòu)建測序文庫的方法。根據(jù)本發(fā)明的實(shí)施例，該方法包括：(1)將mRNA打斷，以便獲得片段化mRNA；(2)將所述片段化mRNA去磷酸化，以便獲得去磷酸化mRNA；(3)將所述去磷酸化mRNA連接3’端接頭，以便獲得連接產(chǎn)物；(4)將所述連接產(chǎn)物進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄，以便獲得cDNA；(5)從所述cDNA分離單鏈DNA；以及(6)將所述單鏈DNA進(jìn)行環(huán)化，以便獲得環(huán)狀DNA，所述環(huán)狀DNA構(gòu)成所述測序文庫。發(fā)明人發(fā)現(xiàn)，利用本發(fā)明的該方法，能夠快速有效的構(gòu)建測序文庫，且該方法能夠有效減少樣品提取的數(shù)量和切膠和膠純化回收步驟，可以利用非常微量的RNA用于構(gòu)建文庫，RNA的起始量只需要pg級別就能滿足要求；在單管中利用連續(xù)反應(yīng)無縫銜接接頭連接和反轉(zhuǎn)錄，不僅能夠簡化純化步驟，還可以縮短文庫構(gòu)建的時間，提高效率； 另外，該方法無需進(jìn)行PCR，能夠有效避免PCR帶來的偏差(bias)問題，而且步驟簡單，利于實(shí)現(xiàn)高通量、自動化應(yīng)用。根據(jù)本發(fā)明的實(shí)施例，所述步驟(3)和所述步驟(4)是在同一容器中進(jìn)行的。根據(jù)本發(fā)明的實(shí)施例，所述步驟(1)的起始mRNA是采用去核糖體RNA方法從總RNA中分離純化獲得的。根據(jù)本發(fā)明的一些實(shí)施例，所述去核糖體RNA方法包括：將所述總RNA與oligoDNA進(jìn)行退火處理，將所述退火處理得到的產(chǎn)物進(jìn)行RNaseH酶消化，將所述RNaseH酶消化得到的產(chǎn)物進(jìn)行DNaseI酶消化，以及將所述DNaseI酶消化得到的產(chǎn)物進(jìn)行磁珠純化，以便獲得所述mRNA，其中，所述OligoDNA是可與rRNA雜交的寡核苷酸單鏈片段，其長度為45-60bp，優(yōu)選為45-55bp。由此，能夠高效地分離獲得mRNA。根據(jù)本發(fā)明的實(shí)施例，所述步驟(5)是通過以下步驟進(jìn)行的：(a)向反轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物中加入1MNaOH，在PCR儀上反應(yīng)98℃20min，然后向得到的混合物中加入1MHCl；(b)向步驟(a)中所得到的混合物中加入水，然后進(jìn)行乙醇沉淀，并用1×TE重懸。根據(jù)本發(fā)明的實(shí)施例，所述步驟(4)的反轉(zhuǎn)錄是采用攜帶生物素的引物進(jìn)行的。根據(jù)本發(fā)明的實(shí)施例，所述步驟(6)進(jìn)一步包括：將所述單鏈DNA進(jìn)行單鏈環(huán)化反應(yīng)，以便獲得單鏈環(huán)化反應(yīng)產(chǎn)物；利用鏈霉素磁珠對所述單鏈環(huán)化反應(yīng)產(chǎn)物進(jìn)行篩選，以便獲得所述環(huán)狀DNA。在本發(fā)明的第二方面，本發(fā)明提供了一種測序方法。根據(jù)本發(fā)明的實(shí)施例，該方法包括：通過前面所述的方法構(gòu)建測序文庫；以及對所述測序文庫進(jìn)行測序。發(fā)明人發(fā)現(xiàn)，利用本發(fā)明的該方法，能夠快速、有效的進(jìn)行測序，且通過前面所述的方法構(gòu)建測序文庫能夠有效減少樣品提取的數(shù)量和切膠和膠純化回收步驟，可以利用非常微量的RNA用于構(gòu)建文庫，RNA的起始量只需要pg級別就能滿足要求；在單管中利用連續(xù)反應(yīng)無縫銜接接頭連接和反轉(zhuǎn)錄，不僅能夠簡化純化步驟，還可以縮短文庫構(gòu)建的時間，提高效率；另外，該方法無需進(jìn)行PCR，能夠有效避免PCR帶來的偏差(bias)問題，而且步驟簡單，利于實(shí)現(xiàn)高通量、自動化應(yīng)用。在本發(fā)明的第三方面，本發(fā)明提供了一種構(gòu)建測序文庫的設(shè)備。根據(jù)本發(fā)明的實(shí)施例，該設(shè)備包括：片段化裝置，所述片段化裝置用于將mRNA打斷，以便獲得片段化mRNA；去磷酸化裝置，所述去磷酸化裝置用于將所述片段化mRNA去磷酸化，以便獲得去磷酸化mRNA；接頭連接裝置，所述接頭連接裝置用于將所述去磷酸化mRNA連接3’端接頭，以便獲得連接產(chǎn)物；反轉(zhuǎn)錄裝置，所述反轉(zhuǎn)錄裝置用于將所述連接產(chǎn)物進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄，以便獲得cDNA；分離裝置，所述分離裝置用于從所述cDNA分離單鏈DNA；以及環(huán)化裝置，所述環(huán)化裝置用于將所述單鏈DNA進(jìn)行單鏈環(huán)化，以便獲得環(huán)狀DNA，所述環(huán)狀DNA構(gòu) 成所述測序文庫。利用本發(fā)明的該設(shè)備，能夠有效實(shí)施前面所述的構(gòu)建測序文庫的方法，可以利用非常微量的RNA用于構(gòu)建文庫，RNA的起始量只需要pg級別就能滿足要求；不需要復(fù)雜的純化裝置，且不需進(jìn)行PCR，不僅設(shè)備簡單，成本低廉，且能夠縮短文庫構(gòu)建的時間，大大提高效率。根據(jù)本發(fā)明的實(shí)施例，進(jìn)一步包括：提取裝置，所述提取裝置用于利用去核糖體RNA方法從總RNA中分離純化所述mRNA。在本發(fā)明的一些實(shí)施例中，提取裝置中設(shè)置有oligoDNA，所述OligoDNA是長度為45-60bp，優(yōu)選45-55bp的寡核苷酸單鏈片段，具有選自SEQIDNO.:1-195中至少之一所示的序列。根據(jù)本發(fā)明的實(shí)施例，所述分離裝置進(jìn)一步包括：熱解單元，所述熱解單元用于向反轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物中加入1MNaOH，在PCR儀上反應(yīng)98℃20min，然后向得到的混合物中加入1MHCl；以及沉淀單元，所述沉淀單元用于向所述熱解單元中所得到的混合物中加入水，然后進(jìn)行乙醇沉淀，并用1×TE重懸。根據(jù)本發(fā)明的實(shí)施例，所述反轉(zhuǎn)錄裝置中設(shè)置有攜帶生物素的引物，，用于進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)。根據(jù)本發(fā)明的實(shí)施例，所述環(huán)化裝置進(jìn)一步包括：環(huán)化反應(yīng)單元，所述環(huán)化反應(yīng)單元用于將所述單鏈DNA進(jìn)行單鏈環(huán)化反應(yīng)，以便獲得單鏈環(huán)化反應(yīng)產(chǎn)物；篩選單元，所述篩選單元用于利用鏈霉素磁珠對所述單鏈環(huán)化產(chǎn)物進(jìn)行篩選，以便獲得所述環(huán)狀DNA。在本發(fā)明的第四方面，本發(fā)明提供了一種測序系統(tǒng)。根據(jù)本發(fā)明的實(shí)施例，該系統(tǒng)包括：前面所述的構(gòu)建測序文庫的設(shè)備；以及測序設(shè)備。發(fā)明人發(fā)現(xiàn)，利用本發(fā)明的該系統(tǒng)能夠快速、有效的實(shí)施前面所述的測序方法，且通過前面所述的設(shè)備構(gòu)建測序文庫能夠有效減少樣品提取的數(shù)量和切膠和膠純化回收步驟，可以利用非常微量的RNA用于構(gòu)建文庫，RNA的起始量只需要pg級別就能滿足要求；還可以在單管中利用連續(xù)反應(yīng)無縫銜接接頭連接和反轉(zhuǎn)錄，不僅能夠簡化純化步驟，還可以縮短文庫構(gòu)建的時間，提高效率；另外，該系統(tǒng)無需進(jìn)行PCR，能夠有效避免PCR帶來的偏差(bias)問題，而且操作簡單，利于實(shí)現(xiàn)高通量、自動化應(yīng)用。附圖說明圖1顯示了根據(jù)本發(fā)明的實(shí)施例，構(gòu)建測序文庫的方法的流程示意圖；圖2顯示了根據(jù)本發(fā)明的實(shí)施例，構(gòu)建測序文庫的技術(shù)原理概要圖；圖3顯示了根據(jù)本發(fā)明的實(shí)施例，構(gòu)建測序文庫的設(shè)備的結(jié)構(gòu)示意圖；圖4顯示了根據(jù)本發(fā)明的實(shí)施例，構(gòu)建獲得的測序文庫的電泳結(jié)果圖；以及圖5顯示了根據(jù)本發(fā)明的實(shí)施例，構(gòu)建獲得的測序文庫的隨機(jī)性分布結(jié)果圖。具體實(shí)施方式下面詳細(xì)描述本發(fā)明的實(shí)施例。下面描述的實(shí)施例是示例性的，僅用于解釋本發(fā)明，而不能理解為對本發(fā)明的限制。實(shí)施例中未注明具體技術(shù)或條件的，按照本領(lǐng)域內(nèi)的文獻(xiàn)所描述的技術(shù)或條件或者按照產(chǎn)品說明書進(jìn)行。所用試劑或儀器未注明生產(chǎn)廠商者，均為可以通過市購獲得的常規(guī)產(chǎn)品。在本發(fā)明的第一方面，本發(fā)明提供了一種構(gòu)建測序文庫的方法。根據(jù)本發(fā)明的實(shí)施例，參照圖1和圖2，該方法包括以下步驟：S100：將mRNA打斷，以便獲得片段化mRNA。根據(jù)本發(fā)明的實(shí)施例，該步驟中，起始mRNA是采用去核糖體RNA方法從總RNA中分離純化獲得的。在本發(fā)明的一些實(shí)施例中，去核糖體RNA方法包括以下步驟：將總RNA與oligoDNA進(jìn)行退火處理，將退火處理得到的產(chǎn)物進(jìn)行RNaseH酶消化，將RNaseH酶消化得到的產(chǎn)物進(jìn)行DNaseI酶消化，以及將DNaseI酶消化得到的產(chǎn)物進(jìn)行磁珠純化，以便獲得mRNA，其中，所述OligoDNA是可與rRNA雜交的寡核苷酸單鏈片段，其長度為45-60bp，優(yōu)選為45-55bp。由此，能夠高效的獲得mRNA，且步驟簡單，操作容易，有利于提高構(gòu)建測序文庫的效率。S200：將所述片段化mRNA去磷酸化，以便獲得去磷酸化mRNA。由此，能夠有效避免在后續(xù)步驟中片段化mRNA自身進(jìn)行連接，有利于減少樣品丟失及提高構(gòu)建文庫的效率。S300：將所述去磷酸化mRNA連接3’端接頭，以便獲得連接產(chǎn)物。S400：將所述連接產(chǎn)物進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄，以便獲得cDNA。根據(jù)本發(fā)明的實(shí)施例，所述反轉(zhuǎn)錄是采用攜帶生物素的引物進(jìn)行的。由此，能夠在后續(xù)步驟中達(dá)到高效純化cDNA的目的，進(jìn)而能夠進(jìn)一步減少樣品的損失，提高構(gòu)建測序文庫的效率。根據(jù)本發(fā)明的實(shí)施例，所述步驟S300和所述步驟S400是在同一容器中進(jìn)行的。由此，連續(xù)反應(yīng)無縫銜接接頭連接和反轉(zhuǎn)錄，不僅減少了切膠純化步驟，還大大縮短了構(gòu)建測序文庫的時間，有利于提高構(gòu)建測序文庫的效率。S500：從所述cDNA分離單鏈DNA。根據(jù)本發(fā)明的實(shí)施例，可以通過移除cDNA中的模板RNA，然后利用乙醇沉淀單鏈DNA的方法從所述cDNA分離單鏈DNA。根據(jù)本發(fā)明的一個具體示例，從所述cDNA分 離單鏈DNA是通過以下步驟進(jìn)行的：(a)向反轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物中加入1MNaOH，在PCR儀上反應(yīng)98℃20min，然后向得到的混合物中加入1MHCl；(b)向步驟(a)中所得到的混合物中加入水，然后進(jìn)行乙醇沉淀，并用1×TE重懸。S600：將所述單鏈DNA進(jìn)行環(huán)化，以便獲得環(huán)狀DNA，所述環(huán)狀DNA構(gòu)成所述測序文庫。根據(jù)本發(fā)明的實(shí)施例，所述步驟S600進(jìn)一步包括：將所述單鏈DNA進(jìn)行單鏈環(huán)化反應(yīng)，以便獲得單鏈環(huán)化反應(yīng)產(chǎn)物；利用鏈霉素磁珠對所述單鏈環(huán)化反應(yīng)產(chǎn)物進(jìn)行篩選，以便獲得所述環(huán)狀DNA。由此，能夠高效純化獲得環(huán)狀DNA，能夠有效減少樣品投入量。發(fā)明人發(fā)現(xiàn)，利用本發(fā)明的該方法，能夠快速有效的構(gòu)建測序文庫，且該方法能夠有效減少樣品提取的數(shù)量和切膠和膠純化回收步驟，可以利用非常微量的RNA用于構(gòu)建文庫，RNA的起始量只需要pg級別就能滿足要求；在單管中利用連續(xù)反應(yīng)無縫銜接接頭連接和反轉(zhuǎn)錄，不僅能夠簡化純化步驟，還可以縮短文庫構(gòu)建的時間，提高效率；另外，該方法無需進(jìn)行PCR，能夠有效避免PCR帶來的偏差(bias)問題，而且步驟簡單，利于實(shí)現(xiàn)高通量、自動化應(yīng)用。在本發(fā)明的第二方面，本發(fā)明提供了一種測序方法。根據(jù)本發(fā)明的實(shí)施例，該方法包括：通過前面所述的方法構(gòu)建測序文庫；以及對所述測序文庫進(jìn)行測序。發(fā)明人發(fā)現(xiàn)，利用本發(fā)明的該方法，能夠快速、有效的進(jìn)行測序，且通過前面所述的方法構(gòu)建測序文庫能夠有效減少樣品提取的數(shù)量和切膠和膠純化回收步驟，可以利用非常微量的RNA用于構(gòu)建文庫，RNA的起始量只需要pg級別就能滿足要求；在單管中利用連續(xù)反應(yīng)無縫銜接接頭連接和反轉(zhuǎn)錄，不僅能夠簡化純化步驟，還可以縮短文庫構(gòu)建的時間，提高效率；另外，該方法無需進(jìn)行PCR，能夠有效避免PCR帶來的偏差(bias)問題，而且步驟簡單，利于實(shí)現(xiàn)高通量、自動化應(yīng)用。在本發(fā)明的第三方面，本發(fā)明提供了一種構(gòu)建測序文庫的設(shè)備。根據(jù)本發(fā)明的實(shí)施例，參照圖3，該設(shè)備包括：片段化裝置100，所述片段化裝置100用于將mRNA打斷，以便獲得片段化mRNA。根據(jù)本發(fā)明的實(shí)施例，進(jìn)一步包括：提取裝置，所述提取裝置用于利用去核糖體RNA方法從總RNA中分離純化所述mRNA。在本發(fā)明的一些實(shí)施例中，提取裝置中設(shè)置有oligoDNA，所述OligoDNA是可與rRNA雜交的寡核苷酸單鏈片段，其長度為45-60bp，優(yōu)選為45-55bp。由此，能夠高效地分離純化獲得mRNA，有利于提高效率。去磷酸化裝置200，所述去磷酸化裝置200用于將所述片段化mRNA去磷酸化，以便 獲得去磷酸化mRNA。由此，能夠有效避免在后續(xù)步驟中片段化mRNA自身進(jìn)行連接，有利于減少樣品丟失及提高構(gòu)建文庫的效率。接頭連接裝置300，所述接頭連接裝置300用于將所述去磷酸化mRNA連接3’端接頭，以便獲得連接產(chǎn)物。反轉(zhuǎn)錄裝置400，所述反轉(zhuǎn)錄裝置400用于將所述連接產(chǎn)物進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄，以便獲得cDNA。根據(jù)本發(fā)明的實(shí)施例，所述反轉(zhuǎn)錄裝置中設(shè)置有攜帶生物素的引物。由此，能夠在后續(xù)步驟中達(dá)到高效純化cDNA的目的，進(jìn)而能夠進(jìn)一步減少樣品的損失，提高構(gòu)建測序文庫的效率。根據(jù)本發(fā)明的實(shí)施例，在本發(fā)明的設(shè)備中，所述接頭連接和所述反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)是在同一容器中進(jìn)行的。由此，連續(xù)反應(yīng)無縫銜接接頭連接和反轉(zhuǎn)錄，不僅減少了切膠純化步驟，還大大縮短了構(gòu)建測序文庫的時間，有利于提高構(gòu)建測序文庫的效率。分離裝置500，所述分離裝置500用于從所述cDNA分離單鏈DNA。根據(jù)本發(fā)明的實(shí)施例，所述分離裝置500進(jìn)一步包括：熱解單元，所述熱解單元用于向反轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物中加入1MNaOH，在PCR儀上反應(yīng)98℃20min，然后向得到的混合物中加入1MHCl；以及沉淀單元，所述沉淀單元用于向所述熱解單元中所得到的混合物中加入水，然后進(jìn)行乙醇沉淀，并用1×TE重懸。環(huán)化裝置600，所述環(huán)化裝置600用于將所述單鏈DNA進(jìn)行單鏈環(huán)化，以便獲得環(huán)狀DNA，所述環(huán)狀DNA構(gòu)成所述測序文庫。根據(jù)本發(fā)明的實(shí)施例，所述環(huán)化裝置600進(jìn)一步包括：環(huán)化反應(yīng)單元，所述環(huán)化反應(yīng)單元用于將所述單鏈DNA進(jìn)行單鏈環(huán)化反應(yīng)，以便獲得單鏈環(huán)化反應(yīng)產(chǎn)物；篩選單元，所述篩選單元用于利用鏈霉素磁珠對所述單鏈環(huán)化產(chǎn)物進(jìn)行篩選，以便獲得所述環(huán)狀DNA。由此，能夠高效純化獲得環(huán)狀DNA，能夠有效減少樣品投入量。利用本發(fā)明的該設(shè)備，能夠有效實(shí)施前面所述的構(gòu)建測序文庫的方法，可以利用非常微量的RNA用于構(gòu)建文庫，RNA的起始量只需要pg級別就能滿足要求；不需要復(fù)雜的純化裝置，且不需進(jìn)行PCR，不僅設(shè)備簡單，成本低廉，且能夠縮短文庫構(gòu)建的時間，大大提高效率。在本發(fā)明的第四方面，本發(fā)明提供了一種測序系統(tǒng)。根據(jù)本發(fā)明的實(shí)施例，該系統(tǒng)包括：前面所述的構(gòu)建測序文庫的設(shè)備；以及測序設(shè)備。發(fā)明人發(fā)現(xiàn)，利用本發(fā)明的該系統(tǒng)能夠快速、有效的實(shí)施前面所述的測序方法，且通過前面所述的設(shè)備構(gòu)建測序文庫能夠有效減少樣品提取的數(shù)量和切膠和膠純化回收步驟，可以利用非常微量的RNA用于構(gòu)建文 庫，RNA的起始量只需要pg級別就能滿足要求；還可以在單管中利用連續(xù)反應(yīng)無縫銜接接頭連接和反轉(zhuǎn)錄，不僅能夠簡化純化步驟，還可以縮短文庫構(gòu)建的時間，提高效率；另外，該系統(tǒng)無需進(jìn)行PCR，能夠有效避免PCR帶來的偏差(bias)問題，而且操作簡單，利于實(shí)現(xiàn)高通量、自動化應(yīng)用。總之，本發(fā)明提供了一種從非常低的RNA投入量構(gòu)建cDNA文庫適用于高通量測序的構(gòu)建測序文庫的方法，該方法是一種相對簡單和流線型克隆方案，相比較傳統(tǒng)克隆方案和已商業(yè)化的流線型方案導(dǎo)致重大的樣品丟失問題，本發(fā)明的方法通過減少樣品提取的數(shù)量和切膠回收步驟，盡可能最小化減少樣品的丟失，該方法涉及測序連接接頭和反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)在同一單管中完成，在這一單管中一個單獨(dú)的接頭連接上RNA的3’端，緊接著反轉(zhuǎn)錄形成帶有生物素(biotin)的cDNA；然后cDNA進(jìn)行環(huán)化，帶有biotin的cDNAs被篩選出來。本發(fā)明的方法靈敏度高，從人類全血血漿的臨床樣品分離非常微量的RNA用于構(gòu)建cDNA文庫的起始量只需要pg級別就能滿足要求；文庫制備流程簡單，整個RNA文庫制備只需要1.5天就能完成。不管從樣品投入量，時間上，成本上，此方法均優(yōu)于目前已商業(yè)化另外二大測序平臺(iontorrent和Illumina)的RNA文庫制備技術(shù)。實(shí)施例1：實(shí)驗(yàn)樣本來源：采用材料是人細(xì)胞的RNA標(biāo)準(zhǔn)品(UniversalHumanReferenceRNA)購自AgilentTechnologies。具體實(shí)驗(yàn)步驟：1、RNaseH純化mRNA1.1取100ng總RNA與oligoDNA退火，反應(yīng)體系如下所示：其中，OligoDNA為SEQIDNO.1-SEQIDNO.195所示各單條序列按等量的分子比例混合在一起形成的混合物。1.2在PCR儀上95℃反應(yīng)2min；梯度降溫，每隔1s降0.1℃至22℃；22℃反應(yīng)5min，迅速置于冰上。1.3RNaseH酶消化在37℃反應(yīng)30min。1.4DNaseI酶消化1.5反應(yīng)結(jié)束后，產(chǎn)物用RNAcleanXP磁珠純化，溶于10μl無核酸酶水中。2、mRNA片段化向上一步中的洗脫液中加入3.5μL的5×第一鏈緩沖液，94℃，10min，立即置于冰上。3、片段化mRNA去磷酸化將樣品置于PCR儀中反應(yīng)，反應(yīng)條件：37℃30min；65℃5min；4℃保持。反應(yīng)結(jié)束后，產(chǎn)物用RNAcleanXP磁珠純化，溶于10μl無核酸酶水中。4、3’接頭連接反應(yīng)在PCR儀上30℃反應(yīng)6h。其中，3’接頭具有如下所示的序列：5/rApp/GTCTCCAGTCGAAGCCCGATC/Amine/3(SEQIDNO.196)5phos/AAGTCGGAGGCCAAGCGGTCTTAGGAAGACAAGCTCXXXXXXXXXXGAT CGGGCTTCGACTGGAGAC(SEQIDNO.197，其中，XXXXXXXXXX代表不同的標(biāo)簽(barcode)序列)。5、反轉(zhuǎn)錄合成cDNA鏈混勻后在PCR儀上按照以下程序進(jìn)行反應(yīng)：在該步驟中，上述步驟中連接的3’接頭作為反轉(zhuǎn)錄引物。6、分離單鏈DNA移除模板RNA和乙醇沉淀cDNA產(chǎn)物，具體如下：往上步產(chǎn)物加入2μl1MNaOH，在PCR儀上反應(yīng)98℃20min(105℃熱蓋)，然后加入2μl1MHCL。補(bǔ)水至200μl再進(jìn)行乙醇沉淀，最后用15μl1×TE重懸，以便獲得單鏈DNA。7、單鏈環(huán)化連接反應(yīng)在PCR儀上60℃反應(yīng)2h。反應(yīng)結(jié)束后80℃反應(yīng)10min失活ssDNA連接酶。8、鏈霉素磁珠結(jié)合帶有生物素環(huán)化產(chǎn)物取30μl鏈霉親和素磁珠(StreptavidinBeads，濃度為10mg/ml))，加入120μl的1×結(jié) 合緩沖液(1×bindingbuffer，組成成分是110mMTris-HCl，200mMNaCl)，在不粘管中混勻后置于磁力架上靜止吸附，調(diào)整不粘管的方向，使得鏈霉親和素磁珠在1×bindingbuffer洗液中前后游動，棄上清液后，重復(fù)上述操作一次，取出不粘管加入30μl1×bindingbuffer懸浮，混勻后室溫待用。向20μl環(huán)化產(chǎn)物加入20μl2×bindingbuffer(組成成分是220mMTris-HCl，400mMNaCl)混勻，然后轉(zhuǎn)移到上步驟含有30μl1×bindingbuffer懸浮的鏈霉親和素磁珠的不粘管中混勻，將此70μl混合物置于室溫下結(jié)合15-20min，中間輕輕彈勻一次。9、破壞鏈霉素與生物素作用，得到環(huán)化文庫將上述不粘管磁力架放置3-5min，棄去上清液，用100μl的1×TE洗滌2次，方法同鏈霉親和素磁珠的洗滌方法，然后加入50μl無離子滅菌水重懸磁珠進(jìn)行PCR反應(yīng)，PCR反應(yīng)條件如下：反應(yīng)結(jié)束后，吸取上清到新的1.5mLEP管，用ssDNAQubit進(jìn)行定量，并跑6％的變性膠驗(yàn)證文庫結(jié)果，構(gòu)建獲得的文庫的電泳結(jié)果見圖4，其中，泳道1為fermentas低范圍RNA梯(fermentaslowrangeRNAladder)，泳道2為構(gòu)建獲得的文庫，可以看到在300-600nt分布的smear(成片條帶)就是構(gòu)建獲得的單鏈環(huán)狀文庫。10、結(jié)果驗(yàn)證將上述制備獲得的文庫在CompleteGenomics測序平臺進(jìn)行常規(guī)數(shù)據(jù)分析，結(jié)果如下：將上述制備獲得的文庫與來自Rfam數(shù)據(jù)庫(人核糖體數(shù)據(jù)庫)的參考基因組進(jìn)行比對，核糖體RNA占的比例結(jié)果見表1：表1比對基因序列數(shù)目百分比總共序列數(shù)目8302538100.00％總共比對上的序列數(shù)21410.03％總共未比對上的序列數(shù)830039799.97％將上述制備獲得的文庫與來自人類基因組數(shù)據(jù)庫h19的參考基因組進(jìn)行比對，比對到 基因組的結(jié)果見表2：表2總共序列數(shù)總共比對序列數(shù)唯一匹配序列數(shù)8302538(100％)8253099(99.40％)7744826(93.28％)隨機(jī)性分布結(jié)果見圖5。上述結(jié)果表明，通過根據(jù)本發(fā)明實(shí)施例的上述方法，能夠成功地以少量起始樣品制備獲得符合要求的測序文庫。在本說明書的描述中，參考術(shù)語“一個實(shí)施例”、“一些實(shí)施例”、“示例”、“具體示例”、或“一些示例”等的描述意指結(jié)合該實(shí)施例或示例描述的具體特征、結(jié)構(gòu)、材料或者特點(diǎn)包含于本發(fā)明的至少一個實(shí)施例或示例中。在本說明書中，對上述術(shù)語的示意性表述不必須針對的是相同的實(shí)施例或示例。而且，描述的具體特征、結(jié)構(gòu)、材料或者特點(diǎn)可以在任一個或多個實(shí)施例或示例中以合適的方式結(jié)合。此外，在不相互矛盾的情況下，本領(lǐng)域的技術(shù)人員可以將本說明書中描述的不同實(shí)施例或示例以及不同實(shí)施例或示例的特征進(jìn)行結(jié)合和組合。盡管上面已經(jīng)示出和描述了本發(fā)明的實(shí)施例，可以理解的是，上述實(shí)施例是示例性的，不能理解為對本發(fā)明的限制，本領(lǐng)域的普通技術(shù)人員在本發(fā)明的范圍內(nèi)可以對上述實(shí)施例進(jìn)行變化、修改、替換和變型。當(dāng)前第1頁1 2 3