本發(fā)明涉及分子標(biāo)記及其應(yīng)用。具體地，本發(fā)明涉及水稻直鏈淀粉含量性狀相關(guān)的分子標(biāo)記，用于檢測該分子標(biāo)記的引物對和試劑盒，前述分子標(biāo)記、引物對、試劑盒在水稻育種中的用途，檢測水稻直鏈淀粉含量性狀的方法以及水稻輔助育種方法。
背景技術(shù)：
：水稻(Oryzasativa)是我國最重要的糧食作物之一，水稻生產(chǎn)水平的提高一直是關(guān)系我國農(nóng)業(yè)發(fā)展和民生安定的重大問題。隨著經(jīng)濟高速發(fā)展，人們生活水平不斷提高，我國水稻生產(chǎn)必須在兼顧產(chǎn)量的同時進一步培育口味、外形更為優(yōu)質(zhì)的新品種。傳統(tǒng)育種技術(shù)在水稻遺傳改良方面取得了顯著成就，但其選擇效率較低、周期長等因素，已不能滿足當(dāng)前水稻生產(chǎn)對優(yōu)良品種的需求。隨著分子生物學(xué)的發(fā)展，分子標(biāo)記技術(shù)的出現(xiàn)，為水稻的遺傳研究及育種開辟了新的思路和手段。開發(fā)具有我國特色的重要性狀基因的分子標(biāo)記并進行輔助選擇育種研究，將對提高我國水稻育種水平起到促進作用。在我國，稻米品質(zhì)的指標(biāo)體系主要包括碾磨品質(zhì)、外觀品質(zhì)、蒸煮品質(zhì)和營養(yǎng)品質(zhì)。在眾多品質(zhì)研究中，水稻糯性是很重要的一個方面，是稻米品質(zhì)遺傳研究最早和最集中的形狀，同時也使影響稻米蒸煮品質(zhì)的重要因素。如美國，日本，澳大利亞等國家對糯性的研究作了大量的工作。糯性影響著水稻的品質(zhì)和口感，水稻直鏈淀粉含量是影響稻米糯性最主要的因素，除糯米的直鏈淀粉小于2％外，一般稻米的直鏈淀粉含量變異于6％-34％之間。一般認(rèn)為水稻直鏈淀粉是影響米飯質(zhì)地的最重要的因素。直鏈淀粉越高，米飯硬，粘性小，飯粒干燥蓬松，色澤較暗；相反，米飯軟，粘性大，飯粒光澤好。已有研究表明，水稻糯性基因位于第6號染色體上，且水稻糯性wx基因相對于非糯性Wx基因為隱性，在育種過程中當(dāng)兩者處于雜合狀態(tài)時從外觀上無法區(qū)別，因而，如果有與水稻糯性性狀密切相關(guān)的分子標(biāo)記，將能夠快速識別糯性基因是否存在，從而可以加快水稻糯性育種進程，為糯性改良提供準(zhǔn)確依據(jù)。然而，現(xiàn)階段與水稻糯性基因緊密連鎖的分子標(biāo)記，仍有待挖掘。技術(shù)實現(xiàn)要素：本發(fā)明旨在至少解決現(xiàn)有技術(shù)中存在的技術(shù)問題之一。為此，本發(fā)明的一個目的在于提出一種與水稻直鏈淀粉含量性狀相關(guān)，能夠有效用于水稻選育的分子標(biāo)記。根據(jù)本發(fā)明的一個方面，本發(fā)明提供了一種水稻直鏈淀粉含量性狀相關(guān)的分子標(biāo)記。根據(jù)本發(fā)明的實施例，所述分子標(biāo)記表現(xiàn)為SEQIDNO：1所示核苷酸序列的插入/缺失長度多態(tài)性。根據(jù)本發(fā)明的實施例，SEQIDNO：1所示核苷酸序列如下(254bp)：ATCCACAGTAACATGGCTTCTACGTGGCGAGTATAGCCGCTAACTAAGTAGAAGAATTGTTCGTGACCTAACTGAACCGCTCGGTAACAGTCTAACAGAATTACTTCATTGTCCCCCCTAAAAGAAAACCTAAGGCCTTGTTTAGATCCCAAAAAATTTTGGTCAAAAACATTACATCAAATGTTTGGACACATATATGGGACATTAAATGTGGAAAAAAAAACAATTGCACAGTTTACATGTAGATTACAAGA(SEQIDNO：1)。根據(jù)本發(fā)明的實施例，具有SEQIDNO：1所示核苷酸序列且在所述分子標(biāo)記位點純合的個體，表現(xiàn)為直鏈淀粉含量低于14％；缺失SEQIDNO：1所示核苷酸序列且在所述分子標(biāo)記位點純合的個體，表現(xiàn)為直鏈淀粉含量高于22％；具有SEQIDNO：1所示核苷酸序列且在所述分子標(biāo)記位點雜合的個體，表現(xiàn)為直鏈淀粉含量在14％-22％之間。發(fā)明人發(fā)現(xiàn)，通過檢測水稻基因組DNA是否具有上述分子標(biāo)記，能夠有效地確定其直鏈淀粉含量。具體地，如前所述，不具有所述分子標(biāo)記且在所述分子標(biāo)記位點純合的水稻種子直鏈淀粉含量高于22％，具有該分子標(biāo)記且在所述分子標(biāo)記位點純合的水稻種子直鏈淀粉含量低于14％，具有該分子標(biāo)記且在所述分子標(biāo)記位點雜合的水稻種子直鏈淀粉含量在14％-22％之間，從而，檢測到待測水稻不具有該分子標(biāo)記時，則能夠確定其種子直鏈淀粉含量高于22％，而當(dāng)檢測到待測水稻具有該分子標(biāo)記時，則能夠確定其種子直鏈淀粉含量低于14％(在該分子標(biāo)記位點純合)或直鏈淀粉含量在14％-22％之間(在該分子標(biāo)記位點雜合)。進一步，當(dāng)采用針對該分子標(biāo)記的特異性引物對待測水稻基因組DNA進行PCR擴增和凝膠電泳檢測時，通過目的條帶的條數(shù)和長度，能夠有效地確定待測水稻的直鏈淀粉含量，具體地，當(dāng)目的條帶為一條，且所述目的條帶長約850bp時，可以確定所述待測水稻直鏈淀粉含量低于14％；當(dāng)目的條帶為一條，且所述目的條帶長約600bp時，可以確定所述待測水稻直鏈淀粉含量高于22％；當(dāng)目的條帶為兩條，且所述目的條帶的長度分別為約600bp和850bp時，可以確定所述待測水稻直鏈淀粉含量在14％-22％之間。由此，發(fā)明人確定，本發(fā)明的分子標(biāo)記與水稻的直鏈淀粉含量緊密相關(guān)，能夠有效用于水稻的分子標(biāo)記輔助育種。進而能夠根據(jù)實際育種中對直鏈淀粉含量的需求，對水稻育種材料進行早期選擇，進一步有效提高育種的效率和準(zhǔn)確性，提高水稻繁殖群體的遺傳水平，從而能夠準(zhǔn)確、高效地選育出水稻優(yōu) 良品種。例如，利用該分子標(biāo)記的特異性引物對待測水稻植株進行擴增、凝膠電泳，選擇擴增產(chǎn)物目的條帶為一條且長約850bp的水稻，即可容易地篩選獲得直鏈淀粉含量低于14％的水稻植株，從而可以直接應(yīng)用于分子育種實踐。此外，根據(jù)本發(fā)明的一些實施例，利用本發(fā)明的分子標(biāo)記進行水稻分子標(biāo)記輔助育種，具有早期篩選、節(jié)省時間、成本低廉、準(zhǔn)確性高的優(yōu)點。根據(jù)本發(fā)明的另一方面，本發(fā)明還提供了一種用于檢測前面所述的本發(fā)明的分子標(biāo)記的引物對。根據(jù)本發(fā)明的實施例，所述引物對具有SEQIDNO：2-3所示的核苷酸序列。具體地，本發(fā)明的引物對的序列如下所示：5’-CCAAGGCTACAGTGCCTTCT-3’(SEQIDNO：2)；5’-CTGTAAACTGCGAGACGAAT-3’(SEQIDNO：3)。根據(jù)本發(fā)明的實施例，利用所述引物對對待測水稻基因組DNA進行PCR擴增，并檢測擴增片段的長度，當(dāng)所述擴增片段長850bp時，所述待測水稻具有SEQIDNO：1所示核苷酸序列的插入，表現(xiàn)為直鏈淀粉含量低于14％；當(dāng)所述擴增片段長600bp時，所述待測水稻缺失SEQIDNO：1所示核苷酸序列，表現(xiàn)為直鏈淀粉含量高于22％；當(dāng)所述擴增片段為600bp和850bp兩種時，所述待測水稻的所述分子標(biāo)記位點雜合，表現(xiàn)為直鏈淀粉含量在14％-22％之間。根據(jù)本發(fā)明的實施例，利用凝膠電泳優(yōu)選瓊脂糖凝膠電泳，檢測所述擴增片段的長度。發(fā)明人驚奇地發(fā)現(xiàn)，利用本發(fā)明的引物對能夠有效地對待測水稻的上述與直鏈淀粉含量性狀相關(guān)的分子標(biāo)記所在的片段進行PCR擴增，進而通過測序或電泳能夠有效實現(xiàn)對該分子標(biāo)記的檢測，確定待測水稻是否具有該分子標(biāo)記。例如，通過電泳檢測時，根據(jù)擴增產(chǎn)物目的條帶的數(shù)量和長度，即能夠有效確定待測水稻的直鏈淀粉含量。具體地，利用上述引物對，對待測水稻基因組DNA進行PCR擴增和凝膠電泳檢測時，當(dāng)目的條帶為一條，且所述目的條帶長約600bp時，可以確定所述待測水稻直鏈淀粉含量高于22％；當(dāng)目的條帶為一條，且所述目的條帶長約850bp時，可以確定所述待測水稻直鏈淀粉含量低于14％；當(dāng)目的條帶為兩條，且所述目的條帶的長度分別為約600bp和850bp時，可以確定所述待測水稻直鏈淀粉含量在14％-22％之間。而600bp的擴增產(chǎn)物與850bp的擴增產(chǎn)物相比缺失的序列即為本發(fā)明的分子標(biāo)記，因而本發(fā)明的分子標(biāo)記序列位于850bp的擴增產(chǎn)物中。由此，用于檢測前面所述的本發(fā)明的分子標(biāo)記的引物對，能夠有效用于水稻的分子標(biāo)記輔助育種，進而能夠輔助早期實現(xiàn)短時間、低成本、高準(zhǔn)確性地選育水稻優(yōu)良品種。需要說明的是，本領(lǐng)域技術(shù)人員熟知，在上述SEQIDNO：2和SEQIDNO：3所示序列中，可在其5’端或3’端分別增加1～10個堿基，所增加的堿基類型可根據(jù)水稻基因組DNA 上與SEQIDNO：2和SEQIDNO：3相匹配區(qū)域的堿基類型并依據(jù)堿基配對原則來確定，由此得到的引物對與SEQIDNO：2和SEQIDNO：3的擴增產(chǎn)物基本相同(上游和下游引物之間的DNA序列相同)。因此，在SEQIDNO：2和SEQIDNO：3的5’端或3’端分別增加1～10個堿基并能擴增得到基本相同DNA片段的引物對，均包括在本發(fā)明的引物對中。根據(jù)本發(fā)明的又一方面，本發(fā)明還提供了一種用于檢測前面所述的分子標(biāo)記的試劑盒。根據(jù)本發(fā)明的實施例，該試劑盒包含：前面所述的用于檢測本發(fā)明的分子標(biāo)記的引物對。即本發(fā)明的試劑盒中包含具有SEQIDNO：2-3所示的核苷酸序列的引物對。根據(jù)本發(fā)明的實施例，利用本發(fā)明的試劑盒中所包含的引物對，能夠有效實現(xiàn)對待測水稻的上述與直鏈淀粉含量性狀相關(guān)的分子標(biāo)記的檢測，確定待測水稻是否具有該分子標(biāo)記，進而能夠有效確定待測水稻的直鏈淀粉含量。具體地，例如利用上述引物對對待測水稻基因組DNA進行PCR擴增和凝膠電泳檢測時，當(dāng)目的條帶為一條，且所述目的條帶長約600bp時，可以確定所述待測水稻的直鏈淀粉含量高于22％；當(dāng)目的條帶為一條，且所述目的條帶長約850bp時，可以確定所述待測水稻的直鏈淀粉含量低于14％；當(dāng)目的條帶為兩條，且所述目的條帶的長度分別為約600bp和850bp時，可以確定所述待測水稻的直鏈淀粉含量在14％-22％之間。由此，本發(fā)明的用于檢測前面所述的本發(fā)明的分子標(biāo)記的試劑盒，能夠有效用于水稻的分子標(biāo)記輔助育種，進而能夠輔助早期實現(xiàn)短時間、低成本、高準(zhǔn)確性地選育水稻優(yōu)良品種。根據(jù)本發(fā)明的再一方面，本發(fā)明還提供了前面所述的本發(fā)明的分子標(biāo)記、引物對或試劑盒，在水稻選育中的用途。如前所述，通過能夠用于檢測本發(fā)明的與水稻直鏈淀粉含量性狀相關(guān)的分子標(biāo)記的試劑，例如前述的引物對或包含該引物對的試劑盒等，能夠有效地確定待測水稻是否具有上述分子標(biāo)記。例如當(dāng)采用針對該分子標(biāo)記的特異性引物對待測水稻基因組DNA進行PCR擴增和凝膠電泳檢測時，根據(jù)擴增產(chǎn)物目的條帶的數(shù)量和長度，能夠有效確定待測水稻的直鏈淀粉含量，從而能夠有效輔助水稻選育。進而，根據(jù)本發(fā)明的另一方面，本發(fā)明還提供了一種檢測水稻直鏈淀粉含量的方法。根據(jù)本發(fā)明的實施例，該方法對待測水稻進行前面所述的分子標(biāo)記的檢測，以便確定待測水稻的直鏈淀粉含量。具體地，可以通過能夠用于檢測本發(fā)明的與水稻直鏈淀粉含量性狀相關(guān)的分子標(biāo)記的試劑，例如前述的引物對或包含該引物對的試劑盒等，對待測水稻的基因組DNA進行PCR擴增、凝膠電泳，從而根據(jù)擴增產(chǎn)物目的條帶的數(shù)量和長度，能夠有效確定待測水稻的直鏈淀粉含量。其中，如前所述，利用上述引物對或試劑盒，對待測水稻植株進行PCR擴增和凝膠電泳檢測時，當(dāng)目的條帶為一條，且所述目的條帶長約600bp時，可以確定所述待測水稻的直鏈淀粉含量高于22％；當(dāng)目的條帶為一條，且所述目的條帶長約850bp時，可以確定所述待測水稻的直鏈淀粉含量低于14％；當(dāng)目的條帶為兩條，且所述目的條帶 的長度分別為約600bp和850bp時，可以確定所述待測水稻的直鏈淀粉含量在14％-22％之間。由此，本發(fā)明的檢測水稻直鏈淀粉含量的方法，能夠快速、高效、準(zhǔn)確地檢測水稻直鏈淀粉含量，進而能夠有效用于水稻的分子標(biāo)記輔助育種，從而能夠輔助早期實現(xiàn)短時間、低成本、高準(zhǔn)確性地選育水稻優(yōu)良品種。另外，根據(jù)本發(fā)明上述實施例的檢測水稻直鏈淀粉含量的方法還可以具有如下附加的技術(shù)特征：根據(jù)本發(fā)明的實施例，本發(fā)明的檢測水稻直鏈淀粉含量性狀的方法進一步包括：利用前面所述的引物對，或者試劑盒，對所述待測水稻基因組DNA進行PCR擴增；檢測擴增片段的長度；以及基于所述擴增片段的長度，確定所述待測水稻的直鏈淀粉含量，其中，當(dāng)所述擴增片段長850bp時，所述待測水稻為直鏈淀粉含量低于14％；當(dāng)所述擴增片段長600bp時，所述待測水稻為直鏈淀粉含量高于22％；當(dāng)所述擴增片段為600bp和850bp兩種時，所述待測水稻的所述分子標(biāo)記位點雜合，直鏈淀粉含量在14％-22％之間。由此，能夠高效準(zhǔn)確的檢測待測水稻是否具有本發(fā)明的分子標(biāo)記，進而能夠有效地基于檢測結(jié)果確定待測水稻的直鏈淀粉含量。根據(jù)本發(fā)明的實施例，提取獲得待測水稻的基因組DNA的方法不受特別限制，可以采用任何已知的基因組DNA提取方法或試劑盒進行。根據(jù)本發(fā)明的一些具體示例，采用十六烷基三甲基溴化銨法(CTAB法)抽提待測水稻的基因組DNA。由此，能夠有效獲得質(zhì)量好、純度高的基因組DNA，便于后續(xù)步驟進行。根據(jù)本發(fā)明的實施例，利用凝膠電泳優(yōu)選瓊脂糖凝膠電泳，檢測所述擴增片段的長度。由此，方便快捷。發(fā)明人發(fā)現(xiàn)，本發(fā)明的檢測水稻直鏈淀粉含量性狀的方法能夠有效用于水稻的分子標(biāo)記輔助育種，從而能夠輔助早期實現(xiàn)短時間、低成本、高準(zhǔn)確性地選育水稻優(yōu)良品種。根據(jù)本發(fā)明的又一方面，本發(fā)明還提供了一種水稻輔助育種方法。根據(jù)本發(fā)明的實施例，該方法包括通過前面所述的檢測水稻直鏈淀粉含量性狀的方法，檢測所述分子標(biāo)記，以便確定所述待測水稻的粒型。由此，利用本發(fā)明的水稻輔助育種方法，能夠有效確定水稻的直鏈淀粉含量，進而能夠?qū)崿F(xiàn)短時間、低成本、高準(zhǔn)確性地選育水稻優(yōu)良品種。需要說明的是，本發(fā)明的與水稻直鏈淀粉含量性狀相關(guān)的分子標(biāo)記及其應(yīng)用具有如下優(yōu)點：(1)本發(fā)明提供的水稻直鏈淀粉含量性狀相關(guān)的分子標(biāo)記不受水稻的生長階段的限制，可用于水稻的早期選育，可顯著促進水稻的育種進程；(2)檢測水稻如SEQIDNO：1所示的水稻直鏈淀粉含量性狀相關(guān)的分子標(biāo)記的方法， 準(zhǔn)確可靠，操作方便；(3)水稻如SEQIDNO：1所示的水稻直鏈淀粉含量性狀相關(guān)的分子標(biāo)記的檢出，為水稻生長性狀的標(biāo)記輔助選擇提供了科學(xué)依據(jù)。本發(fā)明的附加方面和優(yōu)點將在下面的描述中部分給出，部分將從下面的描述中變得明顯，或通過本發(fā)明的實踐了解到。附圖說明本發(fā)明的上述和/或附加的方面和優(yōu)點從結(jié)合下面附圖對實施例的描述中將變得明顯和容易理解，其中：圖1顯示了根據(jù)本發(fā)明一個實施例，利用具有SEQIDNO：2-3所示核苷酸序列的引物對親本和雜交F1代的DNA進行PCR擴增的擴增產(chǎn)物的電泳檢測結(jié)果圖；圖2顯示了根據(jù)本發(fā)明一個實施例，利用具有SEQIDNO：2-3所示核苷酸序列的引物對F2代水稻植株的DNA進行PCR擴增的部分?jǐn)U增產(chǎn)物的電泳檢測結(jié)果。具體實施方式下面詳細(xì)描述本發(fā)明的實施例。下面描述的實施例是示例性的，僅用于解釋本發(fā)明，而不能理解為對本發(fā)明的限制。實施例中未注明具體技術(shù)或條件的，按照本領(lǐng)域內(nèi)的文獻所描述的技術(shù)或條件(例如參考J.薩姆布魯克等著，黃培堂等譯的《分子克隆實驗指南》，第三版，科學(xué)出版社)或者按照產(chǎn)品說明書進行。所用試劑或儀器未注明生產(chǎn)廠商者，均為可以通過市購獲得的常規(guī)產(chǎn)品，例如可以采購自Illumina公司。實施例1：水稻F2代分離群體的構(gòu)建父本為香味秈稻R15，為新育成品種，未經(jīng)品種審定，暫無詳細(xì)信息。種子粒型長寬比大于4，直鏈淀粉含量22-23％。母本為秈稻溫敏不育系Y58S，該品種屬秈型兩用核不育系。株高65-85厘米，分蘗力較強。單株有效穗9-12穗，千粒重25克左右。不育株率100％，不育度100％。米質(zhì)檢測：糙米率79.3％，精米率70.9％，整精米率66.8％，粒長6.2毫米，長寬比2.9，堊白粒率5％，堊白度0.8％，透明度2級，堿消值7.0，膠稠度66毫米，直鏈淀粉含量13.7％，蛋白質(zhì)含量11.0％。一般每畝繁殖產(chǎn)量300公斤。父本(P1)：種子粒型長寬比大于4，直鏈淀粉含量高。母本(P2)：種子粒型長寬比小于4，直鏈淀粉含量低。父本和母本雜交得到F1，F(xiàn)1代自交產(chǎn)生F2代群體，共158個單株。在種子成熟期，對P1、P2及F2群體各單株的水稻種子的直鏈淀粉含量分別進行檢測， 以便確定各個體的直鏈淀粉含量，根據(jù)表型鑒定結(jié)果，計算分離比，使用MicrosoftExcel2003軟件進行數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析，使用SPSS17.0對結(jié)果進行卡方檢測。性狀調(diào)查結(jié)果(見表1)：F2群體中有38株直鏈淀粉含量高于22％，胚乳非糯性，39株直鏈淀粉含量低于14％，81株直鏈淀粉含量在14％-22％之間，卡方檢測表明，直鏈淀粉含量的分離比約為1:2:1，符合孟德爾的一對基因的分離規(guī)律。因此，直鏈淀粉含量為隱性單基因控制的質(zhì)量性狀。表1水稻F2群體直鏈淀粉含量性狀分離比例χ20.05＝0.1026實施例2：基因組DNA的提取用CTAB法分別提取針對實施例1中的父母本、F1代、以及F2代個體的基因組DNA，具體方法如下：(1)稱取1.0g新鮮葉片，剪碎放入研缽，用液氮研磨后加入3mL1.5×CTAB，研磨成勻漿轉(zhuǎn)入15mL的離心管中，然后往研缽中加入1mL1.5×CTAB沖洗再轉(zhuǎn)入離心管中?；靹蚝笥?5℃水浴30min，期間不時緩慢搖勻。其中1.5×CTAB配方如下(1L)：CTAB15g1mol/L的Tris.Cl(pH為8.0)75mL0.5mol/L的EDTA30mLNaCl61.4g加去離子水定容至1L，使用前加入終濃度為0.2％(2ml)的巰基乙醇。(2)待冷卻至室溫，加入等體積氯仿/異戊醇(24：1)，輕輕混勻，至下層液變?yōu)樯罹G 色。(3)4200rpm離心10min，將上層水相移到新的15mL離心管，加2倍體積預(yù)冷的無水乙醇，混合靜止5min。于-20℃放置30min沉淀DNA。(4)4200rpm離心10min，棄掉上清，加入1mL75％乙醇洗滌沉淀1次，倒置離心管干燥DNA，加入200μLTE溶解DNA。(5)用0.8％的瓊脂糖凝膠檢測基因組DNA。(6)將得到的父母本以及F1代、F2代個體的基因組DNA存于-20℃?zhèn)溆?。實施?：基因定位和分子標(biāo)記開發(fā)(1)遺傳圖譜構(gòu)建針對實施例2中獲得的F2代個體的基因組DNA，基于RAD-seq的基因分型技術(shù)對F2群體的個體進行基因分型，獲得F2群體的基因型數(shù)據(jù)。用MapMaker3.0軟件(ConstructinggeneticmapswithMAPMAKER/EXP3.0，SLincoln,MDaly,ELander-Cambridge,MA:WhiteheadInstitute,1992，通過參照將其全文并入本文)進行遺傳連鎖圖譜繪制，得到遺傳連鎖圖。(2)基因定位由于父母本在直鏈淀粉含量上有明顯的差異(父本直鏈淀粉含量高，母本直鏈淀粉含量低)，對F2個體進行性狀分析，并根據(jù)性狀和marker之間的連鎖關(guān)系將直鏈淀粉含量基因定位在遺傳圖譜上。具體地，針對實施例1中獲得的F2群體，將F2群體的個體表型，與父本型性狀相似的記為a，與母本型性狀相似的記為b，性狀居于父本和母本之間的記為h。得到全部個體的表型數(shù)據(jù)，將個體的表型數(shù)據(jù)與之前得到的基因型數(shù)據(jù)進行比較，從而將水稻糯性基因定位在遺傳連鎖圖譜上。結(jié)果顯示，水稻糯性基因定位在6號染色體1766194至1770656bp區(qū)間內(nèi)，長度約為4460bp。(3)分子標(biāo)記開發(fā)將母本Y58S進行全基因組重測序(10X)，然后根據(jù)RAD-seq的測序結(jié)果，利用SOAP軟件比對測序reads，然后用SOAPsv尋找與日本晴參考基因組片段差異較大的分子標(biāo)記(與日本晴參考基因組相比，是因為父本沒有做過重測序)便于用凝膠電泳區(qū)分鑒別。結(jié)果，選擇靠近直鏈淀粉含量基因所在區(qū)段的標(biāo)記R060174(SEQIDNO：1所示的核酸序列)作為候選。R060174的核苷酸序列如下(254bp)：ATCCACAGTAACATGGCTTCTACGTGGCGAGTATAGCCGCTAACTAAGTAGAAGAATTGTTCGTGACCTAACTGAACCGCTCGGTAACAGTCTAACAGAATTACTTCATTGTCCCCCCTAAAAGAAAACCTAAGGCCTTGTTTAGATCCCAAAAAATTTTGGTCAAAAACATTACATCAAATGTTTGGACACATATATGGGACATTAAATGTGGAAAAAAAAACAATTGCACAGTTTACATGTAGATTACAAGA(SEQIDNO：1)。實施例4：分子標(biāo)記的粒型相關(guān)性驗證對實施例3中確定的水稻粒型相關(guān)分子標(biāo)記R060174(SEQIDNO：1所示的核酸序列)進行驗證，具體如下：針對上述分子標(biāo)記設(shè)計引物，引物序列如下所示：正向引物：5’-CCAAGGCTACAGTGCCTTCT-3’(SEQIDNO：2)；反向引物：5’-CTGTAAACTGCGAGACGAAT-3’(SEQIDNO：3)。利用上述引物，通過PCR擴增和瓊脂糖凝膠電泳檢測來驗證該標(biāo)記的多態(tài)性和擴增穩(wěn)定性。具體地，以實施例2中提取的父本、母本、F1代、或F2代的基因組DNA為模板，利用上述擴增引物進行PCR擴增，其中，PCR反應(yīng)體系如下：無菌水20.2μl10*Buffer(含Mg2+)2.5μldNTPs(25mM)0.15μlTaq酶(5U/μl)0.15μl正向引物0.5μl反向引物0.5μl模板1.0μl總體積25μlPCR反應(yīng)程序如下：94℃預(yù)變性5分鐘；94℃變性30秒，60℃退火30秒，72℃延伸40秒，運行35個循環(huán)；最后72℃延伸3分鐘。PCR擴增產(chǎn)物經(jīng)純化后于4℃下保存。接著，將各PCR擴增產(chǎn)物取部分進行瓊脂糖凝膠電泳檢測，結(jié)果見圖1和圖2。如圖1所示，父本擴增產(chǎn)物約為600bp大小的擴增片段，母本擴增產(chǎn)物約為850bp大小的擴增片段， 雜交F1代則同時含有這兩個擴增片段。圖2中顯示了部分F2代個體的擴增產(chǎn)物的電泳檢測結(jié)果，直鏈淀粉含量高于22％的單株均擴增出600bp的條帶，直鏈淀粉含量低于14％的單株均擴增出850bp的條帶，直鏈淀粉含量在14％-22％之間的單株含有兩個擴增片段。由此，證明該分子標(biāo)記R060174(SEQIDNO：1所示的核酸序列)在父母本之間具有多態(tài)性，該分子標(biāo)記與水稻直鏈淀粉含量性狀緊密相關(guān)。然后，利用3730測序儀對各擴增產(chǎn)物進行測序，結(jié)果，父本及F2代中直鏈淀粉含量高于22％的單株擴增條帶大小約為600bp，與母本及F2代中直鏈淀粉含量低于14％的單株擴增條帶850bp相比缺失了一些序列，該序列即為分子標(biāo)記R060174(SEQIDNO：1所示的核酸序列)。該分子標(biāo)記的引物可以直接應(yīng)用于糯稻分子育種實踐，針對父本R15香稻的非糯性進行定向改良。在本說明書的描述中，參考術(shù)語“一個實施例”、“一些實施例”、“示例”、“具體示例”、或“一些示例”等的描述意指結(jié)合該實施例或示例描述的具體特征、結(jié)構(gòu)、材料或者特點包含于本發(fā)明的至少一個實施例或示例中。在本說明書中，對上述術(shù)語的示意性表述不一定指的是相同的實施例或示例。而且，描述的具體特征、結(jié)構(gòu)、材料或者特點可以在任何的一個或多個實施例或示例中以合適的方式結(jié)合。盡管已經(jīng)示出和描述了本發(fā)明的實施例，本領(lǐng)域的普通技術(shù)人員可以理解：在不脫離本發(fā)明的原理和宗旨的情況下可以對這些實施例進行多種變化、修改、替換和變型，本發(fā)明的范圍由權(quán)利要求及其等同物限定。當(dāng)前第1頁1 2 3