本發(fā)明涉及干細胞
技術領域：
，尤其涉及一種具有治療視網膜退行性病變功能的視網膜祖細胞及其制劑。
背景技術：
：視網膜退行性病變是一種以視網膜感光細胞和色素上皮細胞凋亡和壞死為主要特點的一類視網膜疾病，主要包括萎縮性年齡相關性黃斑變性(Age-relatedmaculardegeneration，AMD)、視網膜色素變性(RetinitisPigmentosa，RP)及視網膜萎縮等。視網膜退行性病變是目前主要的致盲疾病之一，多數具有遺傳傾向性，發(fā)病初期視網膜細胞出現(xiàn)功能紊亂，隨著疾病的進展逐漸出現(xiàn)視網膜神經上皮和色素上皮的凋亡萎縮，視力出現(xiàn)不可逆性下降，嚴重者失明。因其發(fā)病機制主要為細胞凋亡，目前該類疾病尚無有效的預防和治療方法，多年來各國科學家努力探索嘗試各種方法治療視網膜退行性病變，到目前為止方法有以下三種：1、基因治療方式：主要指利用病毒或非病毒載體將目的基因或功能基因轉運到眼內，使載體遺傳信息與受體遺傳信息進行重新整合，從而從基因水平修復錯配、突變等基因，達到治療目的。目前雖然取得一些成績，不過外源載體的問題一直沒有解決，離臨床應用還有很長的路程。2、神經營養(yǎng)因子注射法：試驗證明神經營養(yǎng)因子可以推遲或控制感光細胞的凋亡，從而達到治療視網膜退行性病變的目的。但是，絕大多數的營養(yǎng)因子只有通過眼內注射起到治療作用，而由于該方法不能長效供應營養(yǎng)，需要多次注射，易造成感染和視網膜脫離等并發(fā)癥，其風險遠遠大于所獲得的收益，所以該類方法仍需要進一步探索和研究。3、細胞治療方式：將細胞通過各種途徑運輸到眼內，通過細胞持續(xù)釋放神經保護因子或細胞替代等方式治療視網膜退行性病變，是目前公認的最有可能實現(xiàn)臨床治療的方法。常用于治療的細胞主要有：(1)胚胎干細胞(ES)：它具有分化成多種細胞的能力，但是這種細胞存在倫理、免疫排斥和畸胎瘤等問題，不適合臨床應用。(2)多能誘導干細胞(iPS)：指將正常的成熟細 胞在體外重編程為多能誘導干細胞，從理論上具有多向分化能力，但是它存在病毒整合和表達異常等問題。(3)間充質干細胞(MSC)：這種細胞具有有限的分化能力，取材方便，可以自體治療。但是由于它有限的分化能力，因此在視網膜疾病治療中的成功率并不高。(4)視網膜祖細胞(RPC)：這種細胞能夠專一性的分化為視網膜各層細胞，體外可以增殖傳代。使用這種細胞治療的主要問題是存在個體免疫排斥現(xiàn)象，但是由于眼球具有免疫豁免性，可以有效避免免疫排斥問題，因此RPC將成為理想的細胞治療產品。視網膜祖細胞(RPC)屬于一種神經干細胞，能夠表達多種神經營養(yǎng)和抗凋亡因子。根據目前的研究進展，在玻璃體腔內注射視網膜祖細胞是最可能安全長效治療視網膜退行性疾病的方法。但是，注射所采用的視網膜祖細胞應當具有優(yōu)良的品質，未經鑒定的視網膜祖細胞注射入玻璃體腔治療失敗的風險較高，嚴重時會導致并發(fā)癥的產生。因此，鑒定具有治療視網膜退行性病變功能的視網膜祖細胞具有十分重要的意義。技術實現(xiàn)要素：有鑒于此，本發(fā)明要解決的技術問題在于提供一種具有治療視網膜退行性病變功能的視網膜祖細胞及其制劑。采用本發(fā)明提供的視網膜祖細胞能夠有效的治療視網膜退行性病變。本發(fā)明提供了保藏編號為CGMCCNO.10419的視網膜祖細胞。本發(fā)明提供的保藏編號為CGMCCNO.10419的視網膜祖細胞能夠保持良好的增殖能力和干細胞特性，將其用于治療視網膜退行性病變能夠起到良好的療效。經檢測，其培養(yǎng)后的上清液中有25種細胞因子得到了高量表達，具體為：BDNF(腦源性神經營養(yǎng)因子)、GDF-15(生長分化因子-15)、FGF-4(成纖維細胞生長因子4)、FGF-7(成纖維細胞生長因子7)、NGF(神經生長因子)、GDNF(膠質細胞源性神經營養(yǎng)因子)、IGF-Ⅰ(胰島素樣生長因子-Ⅰ)、IGF-Ⅱ(胰島素樣生長因子-Ⅱ)、NT-3(神經營養(yǎng)因子-3)、NT-4(神經營養(yǎng)因子-4)、IGFBP-1(胰島素生長因子結合蛋白1)、IGFBP-2(胰島素生長因子結合蛋白2)、IGFBP-3(胰島素生長因子結合蛋白3)、IGFBP-4(胰島素生長因子結合蛋白4)、IGFBP-6(胰島素生長因子結合蛋白6)、OPG(骨保護素)、TGF-β1(轉 移生長因子-β1)、TGF-β3(轉移生長因子-β3)、PDGF-AA(血小板衍生生長因子-AA)、VEGF(血管內皮生長因子)、CNTF(睫狀神經營養(yǎng)因子)、TNF(腫瘤壞死因子)、HSP27(熱休克蛋白27)、HSP60(熱休克蛋白60)和HSP70(熱休克蛋白70)。本發(fā)明提供的保藏編號為CGMCCNO.10419的具有治療作用的視網膜祖細胞通過流式細胞學進行鑒定，其鑒定方法包括：將視網膜祖細胞培養(yǎng)至對數生長期后進行流式細胞學鑒定，鑒定結果符合鑒定標準的為具有治療視網膜退行性病變功能的視網膜祖細胞；流式細胞鑒定的鑒定抗體為Nestin、Pax6、Ki-67、Chx10、Sox2、CD38和HLA-DR；鑒定標準為：Nestin的表達量大于90％；Pax6的表達量大于70％；Ki-67的表達量大于60％；Chx10的表達量大于85％；Sox2的表達量大于50％；CD38的表達量小于5％；HLA-DR的表達量小于10％。本發(fā)明采用的視網膜祖細胞培養(yǎng)方法采用申請?zhí)枮?01210268933.X的方法進行，其中視網膜祖細胞的來源可以為自行制備，也可由購買獲得，本發(fā)明對此不做限定，其實施皆在本發(fā)明的保護范圍之內。Nestin(巢蛋白)，是一種中間絲類型的蛋白，能夠特異性的表達在神經上皮干細胞中，是神經干細胞的特征性標志物。由于視網膜祖細胞本質上是一種組織干細胞，而Nestin在干細胞分化過程中表達下降，因此，為了篩選到具有良好干性的視網膜祖細胞以用于治療視網膜退行性病變，Nestin需保持較高的表達量。人類配對盒基因(paired-boxgene6，Pax6)編碼一個轉錄因子，Pax6正常表達在眼部的各種組織中，在眼部器官發(fā)育中起到決定性作用。Pax6的缺失或突變能夠阻礙胚胎期細胞向神經外胚層細胞的發(fā)育，導致形成眼內發(fā)育異常，因此，具有治療視網膜退行性病變功能的視網膜祖細胞中Pax6的表達量不應過低。細胞增殖抗原標記物Ki-67，是一種細胞增殖相關基因，僅存在于細胞周期分裂期的一種結構與功能都和染色體密切關聯(lián)的大分子核抗原?，F(xiàn)有研究結果表明，細胞中Ki-67表達量升高與多種惡性腫瘤密切相關。但細胞中Ki-67表達過低則意味著細胞增殖不旺盛，活性較低。視網膜前體細胞標志物Chx10，是視網膜胚胎發(fā)育階段原始細胞表達的特異性標記，是視網膜早期發(fā)育階段的調控基因，表達于尚未分化的視網膜前體細胞中，因此，合格的用于治療視網膜退行性病變的視網膜祖細胞中Chx10的表達量應維持在較高的表達量。Sox2是一種干細胞相關的標志物，其對早期胚胎發(fā)育至關重要，且對晶狀體和視網膜的發(fā)育中發(fā)揮重要作用。其表達對視網膜祖細胞多能狀態(tài)的維持是不可或缺的。CD38是一個定位于膜上的糖蛋白，催化環(huán)腺苷二磷酸核糖的合成和降解，現(xiàn)有技術中，常作為腫瘤相關標志物，研究表明，CD38的高表達與惡性腫瘤密切相關。因此，合格的用于治療視網膜退行性病變的視網膜祖細胞中CD38的表達量不應過高。HLA-DR是一種組織相容性抗原，目前常用于外周血B淋巴細胞及單核細胞的計數或鑒定淋巴瘤及白血病，研究表明，原發(fā)性視網膜色素變性患者的視網膜色素上皮細胞中HLA-DR抗原表達呈陽性，而健康人則無此種表現(xiàn)。因此，篩選用于治療視網膜退行性病變的視網膜細胞中HLA-DR的表達不應過高。視網膜祖細胞(RPC)屬于一種神經干細胞，將其用于治療視網膜退行性病變應具有穩(wěn)定的干細胞特性和旺盛的增殖力。本發(fā)明通過實驗證明，多種細胞因子中，本發(fā)明提供的鑒定方法中采用的因子Nestin、Pax6、Ki-67、Chx10、Sox2呈高表達，而CD38、HLA-DR呈低表達，如此鑒定得到的視網膜祖細胞能夠保持良好的增殖活性和干細胞特性，將其用于治療視網膜退行性病變能夠起到良好的療效。采用本發(fā)明提供的方法鑒定視網膜祖細胞，各因子的表達量檢測分別進行，即7種鑒定抗體分別與視網膜祖細胞混合后，進行流式細胞學鑒定。將采用本發(fā)明提供的方法鑒定得到的視網膜祖細胞保存于中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心，保藏編號為CGMCCNO.10419。在本發(fā)明的實施例中，流式細胞鑒定還采用鑒定抗體的同型對照抗體。同型對照抗體是指使用與鑒定抗體相同種屬來源、相同劑量及同種免疫球蛋白的相同亞型的抗體作為對照。設置同型對照抗體的主要目的是確定鑒定抗體的結合是特異性的，而不是與非特異性的受體或與其他蛋白的相互作 用。鑒定抗體Nestin、Pax6、Ki-67、Chx10、Sox2、CD38、HLA-DR及它們的同型對照抗體可為自制也可于市場購得，本發(fā)明對此不作限定，其實施皆在本發(fā)明的保護范圍之內。在本發(fā)明的實施例中，流式細胞鑒定包括：將視網膜祖細胞培養(yǎng)至對數生長期，經消化、稀釋后與鑒定抗體混合，孵育、洗滌、重懸后以流式細胞儀檢測。在一些實施例中，消化的酶為TrypLETM-Express、胰酶或膠原酶。作為優(yōu)選，消化的酶為TrypLETM-Express。在一些實施例中，稀釋采用生理鹽水、DPBS緩沖液或Hank’s液。作為優(yōu)選，稀釋采用DPBS緩沖液。在一些實施例中，洗滌采用DMEM培養(yǎng)基、MEM培養(yǎng)基或DMEM/F12培養(yǎng)基。作為優(yōu)選，洗滌采用DMEM/F12培養(yǎng)基。在一些實施例中，重懸采用生理鹽水、DPBS緩沖液或Hank’s液。作為優(yōu)選，重懸采用DPBS緩沖液。在一些實施例中，孵育的時間為15min，溫度為室溫，條件為避光。在一些實施例中，稀釋至視網膜祖細胞的密度為0.5×105個/mL。在一些實施例中，洗滌與重懸之間還包括離心的步驟。作為優(yōu)選，離心的時間為3min，轉速為500rpm～800rpm。在本發(fā)明的實施例中，流式細胞鑒定的具體步驟為：將視網膜祖細胞培養(yǎng)至對數生長期后，用TrypLETM-Express、胰酶或膠原酶消化視網膜祖細胞，以洗滌液A(生理鹽水、DPBS緩沖液或Hank’s液)稀釋按照0.5×105個/mL的密度將細胞分別與鑒定抗體及同型對照抗體混合，室溫避光孵育15min，然后加入1ml洗滌液(DMEM培養(yǎng)基、MEM培養(yǎng)基或DMEM/F12培養(yǎng)基)，然后離心500rpm～800rpm，離心3min。用30μl洗滌液A(生理鹽水、DPBS緩沖液或Hank’s液)重懸上機檢測。保藏編號為CGMCCNO.10419的視網膜祖細胞能夠有效治療視網膜退行性病變。因此，本發(fā)明提供了保藏編號為CGMCCNO.10419的視網膜祖細胞在制備治療視網膜退行性疾病的制劑中的應用。作為優(yōu)選，視網膜退行性疾病由視網膜神經上皮細胞凋亡或色素上皮細胞凋亡引起。實驗表明：將該視網膜祖細胞注射入RCS大鼠玻璃體腔內，8周后，視網膜祖細胞注射組RCS大鼠視網膜感光細胞外核層細胞有所留存，而同時僅注射HBSS緩沖液的對照大鼠的視網膜外核層則完全萎縮。ERG實驗表明，注射本發(fā)明提供方法鑒定的視網膜祖細胞8W后，RCS大鼠的視網膜神經感光細胞傳導的電位變化較僅注射HBSS緩沖液組有顯著性改變。水迷宮實驗也表明，注射本發(fā)明提供方法鑒定的視網膜祖細胞后，大鼠視覺功能得到改善，但其運動能力并未發(fā)生改變。另外，經注射本發(fā)明提供方法鑒定的視網膜祖細胞后，玻璃體液中有25中細胞因子表達升高，主要是BDNF(腦源性神經營養(yǎng)因子)、GDF-15(生長分化因子-15)、FGF-4(成纖維細胞生長因子4)、FGF-7(成纖維細胞生長因子7)、NGF(神經生長因子)、GDNF(膠質細胞源性神經營養(yǎng)因子)、IGF-Ⅰ(胰島素樣生長因子-Ⅰ)、IGF-Ⅱ(胰島素樣生長因子-Ⅱ)、NT-3(神經營養(yǎng)因子-3)、NT-4(神經營養(yǎng)因子-4)、IGFBP-1(胰島素生長因子結合蛋白1)、IGFBP-2(胰島素生長因子結合蛋白2)、IGFBP-3(胰島素生長因子結合蛋白3)、IGFBP-4(胰島素生長因子結合蛋白4)、IGFBP-6(胰島素生長因子結合蛋白6)、OPG(骨保護素)、TGF-b1(轉移生長因子-β1)、TGF-b3(轉移生長因子-β3)、PDGF-AA(血小板衍生生長因子-AA)、VEGF(血管內皮生長因子)、CNTF(睫狀神經營養(yǎng)因子)、TNF(腫瘤壞死因子)、HSP27(熱休克蛋白27)、HSP60(熱休克蛋白60)和HSP70(熱休克蛋白70)。而體外培養(yǎng)本發(fā)明提供方法鑒定的視網膜祖細胞，其上清液中持續(xù)釋放的細胞因子與玻璃體也中高表達的因子具有一致性。而這些因子在現(xiàn)有技術的研究中，多具有治療視網膜退行性病變的功能，說明本發(fā)明提供方法鑒定的細胞注射入玻璃體腔內，能夠持續(xù)釋放這些具有治療視網膜退行性病變功能的細胞因子的表達，從而起到治療視網膜退行性病變的作用。而與注射細胞因子相比，注射本發(fā)明提供方法鑒定的視網膜祖細胞的釋放具有持續(xù)性。本發(fā)明還提供了一種治療視網膜退行性病變的制劑，包括：保藏編號為CGMCCNO.10419的視網膜祖細胞和平衡鹽溶液。在一些實施例中，制劑中細胞的密度為1×107個/mL～10×107個/mL。在一些實施例中，制劑中細胞的密度為3×107個/mL～5×107個/mL。作為優(yōu)選，制劑中細胞的密度為4×107個/mL。在一些實施例中，每只眼的用量為0.5×105個～3×106個保藏編號為CGMCCNO.10419的視網膜祖細胞。在一些實施例中，每只眼的用量為為0.5×106個～2×106個保藏編號為CGMCCNO.10419的視網膜祖細胞。作為優(yōu)選，每只眼的用量為1×106個保藏編號為CGMCCNO.10419的視網膜祖細胞。作為優(yōu)選，平衡鹽溶液為HBSS。本發(fā)明提供了保藏編號為CGMCCNO.10419的視網膜祖細胞，并提供了該細胞在制備治療視網膜退行性病變中的應用，和包含該細胞的治療視網膜退行性病變的制劑。采用本發(fā)明提供的視網膜祖細胞能夠保持良好的增殖能力和干細胞特性，將其用于治療視網膜退行性病變能夠起到良好的療效。實驗表明，將保藏編號為CGMCCNO.10419的視網膜祖細胞注射入RCS大鼠眼睛玻璃體腔后，對外核層細胞有保護作用、視網膜神經感光細胞傳導的電位變化顯著高于僅注射HBSS緩沖液的對照組。水迷宮實驗也表明，注射后大鼠視覺功能得到改善。并且，所有注射了保藏編號為CGMCCNO.10419的視網膜祖細胞的大鼠皆未發(fā)現(xiàn)異常。附圖說明圖1a示B組HBSS注射8周后左眼視網膜組織石蠟切片，放大400倍；圖1b示C組視網膜祖細胞注射8周后左眼視網膜組織石蠟切片，放大400倍；圖2示細胞注射組與HBSS對照組的ERG百分比；其中，示細胞注射組ERG百分比；示HBSS組ERG百分比；*示具有顯著性差異(p<0.05)；圖3-a～圖3-e示體外培養(yǎng)視網膜祖細胞上清液中細胞因子的表達量變化圖；其中，示培養(yǎng)15天細胞上清液中因子的表達情況；示培養(yǎng)30天細胞上清液中因子的表達情況；示培養(yǎng)60天細胞上清液中因子的表達情況；圖4示細胞注射組與HBSS對照組的玻璃體液中因子表達情況；其中，柱1示HBSS組玻璃體液中因子表達情況；柱2示細胞注射組玻璃體液中因 子表達情況。生物保藏說明視網膜祖細胞，分類命名：人類視網膜祖細胞，于2015年04月08日保藏在保藏于中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心(CGMCC)，地址為：北京市朝陽區(qū)北辰西路1號院3號中國科學院微生物研究所。保藏編號為CGMCCNO.10419。具體實施方式本發(fā)明提供了一種具有治療視網膜退行性病變功能的視網膜祖細胞及其制劑，本領域技術人員可以借鑒本文內容，適當改進工藝參數實現(xiàn)。特別需要指出的是，所有類似的替換和改動對本領域技術人員來說是顯而易見的，它們都被視為包括在本發(fā)明。本發(fā)明的方法及應用已經通過較佳實施例進行了描述，相關人員明顯能在不脫離本
發(fā)明內容、精神和范圍內對本文的方法和應用進行改動或適當變更與組合，來實現(xiàn)和應用本發(fā)明技術。本發(fā)明采用的儀器皆為普通市售品，皆可于市場購得。下面結合實施例，進一步闡述本發(fā)明：實施例1視網膜祖細胞的培養(yǎng)視網膜祖細胞的成球培養(yǎng)：組織消毒后，取視網膜組織，用酶消化后，1000r離心3分鐘，取沉淀，用DMEM/F12基礎培養(yǎng)基(加入N-2添加物，濃度為1：100、表皮生長因子EGF、濃度為10ng/ml、堿性生長因子bFGF、濃度為10ng/ml、L-谷氨酰胺、濃度1：100)混勻沉淀計數、按照1-2×105/cm2接種于低吸附的T25培養(yǎng)瓶中，置于37℃，5％CO2恒溫培養(yǎng)箱內培養(yǎng)，次日細胞成球。海藻酸鈉凝膠的制備：以去離子水作為海藻酸鈉的溶劑，先稱取海藻酸鈉粉末，將粉末緩緩加入裝有少量溶劑(20ml)的離心管中，同時邊加粉末邊加剩余溶劑，最后用旋渦混合器震蕩5min后55℃水浴加熱過夜，次日高壓蒸汽滅菌，然后在超凈工作臺內灌裝于細胞培養(yǎng)瓶中，恢復到室溫既可以使用。視網膜祖細胞的三維空間培養(yǎng)：細胞成球后，收集細胞液離心，收集沉淀，用視網膜專用培養(yǎng)基混勻細胞，種植鋪有海藻酸鈉凝膠的細胞培養(yǎng)瓶中，細胞即能在海藻酸鈉凝膠的三維空間中快速生長和繁殖。視網膜專用培養(yǎng)基由DMEM/F12基礎培養(yǎng)基、N-2添加物(濃度為1：100)、表皮生長因子EGF(濃度為10ng/ml)、堿性生長因子bFGF(濃度為10ng/ml)、L-谷氨酰胺(濃度1：100)、三碘甲狀腺氨酸T3(濃度為20ng/ml)、神經營養(yǎng)素NT4(濃度為20ng/ml)、神經生長因子NGF(濃度為20ng/ml)、神經營養(yǎng)物質-3NT-3(濃度為20ng/ml)組成。實施例2視網膜祖細胞的鑒定取實施例1培養(yǎng)的增殖旺盛的第五代視網膜祖細胞進行流式細胞儀鑒定：用TrypLETM-Express消化視網膜祖細胞，用DPBS重懸細胞后計數，按照0.5×105個細胞量將細胞平均分配到流式檢測管中，然后向其中加入鑒定抗體(Nestin/Pax6//Ki67/Chx10/Sox2/CD38/HLA-DR)及同型對照抗體室溫避光孵育15min，然后加入1mlDMEM/F12離心500-800rpm，離心3min。用30μLDPBS重懸上機檢測。鑒定抗體和同型對照抗體購自BD和Abcam。鑒定標準為：Nestin的表達量大于90％；Pax6的表達量大于70％；Ki-67的表達量大于60％；Chx10的表達量大于85％；Sox2的表達量大于50％；CD38的表達量小于5％；HLA-DR的表達量小于10％。符合鑒定標準的視網膜祖細胞即為具有治療視網膜退行性病變功能的視網膜祖細胞。保存于中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心，保藏編號為CGMCCNO.10419。實施例3視網膜祖細胞制劑的制備將保藏編號為CGMCCNO.10419的視網膜祖細胞懸浮于HBSS平衡鹽溶液，細胞濃度為4×107個/mL。實施例4視網膜祖細胞制劑的制備將保藏編號為CGMCCNO.10419的視網膜祖細胞懸浮于HBSS平衡鹽溶液，細胞濃度為1×107個/mL。實施例5視網膜祖細胞制劑的制備將保藏編號為CGMCCNO.10419的視網膜祖細胞懸浮于HBSS平衡鹽溶液，細胞濃度為10×107個/mL。實施例6保藏編號為CGMCCNO.10419的視網膜祖細胞對大鼠的治療作用以實施例3制得的視網膜祖細胞制劑驗證采用本發(fā)明提供方法鑒定的視網膜祖細胞對RCS大鼠視網膜退行性疾病的治療效果。實驗方法如下：實驗動物選用皇家外科學院(royalcollegesurgeons,RCS)大鼠，它是一種常染色體隱性遺傳的經典動物模型鼠，3周齡，體重250～300g，雌雄不限，共計30只。分組如下：A組：正常對照組，同種野生型含色素RCS大鼠(rdy+)6只，未進行任何處置。B組：實驗對照組，只進行HBSS(平衡鹽溶液)治療，左眼玻璃體腔內單次注射，10μl/只/次，12只。C組：實驗治療組，移植具有治療作用的視網膜祖細胞，左眼玻璃體腔內單次注射，10μl/只/次，12只。形態(tài)學檢測：B組和C組實驗動物分別于注射后8周取材，制備石蠟切片，HE染色觀察視網膜各層細胞變化。圖1-a示B組大鼠注射8周后視網膜組織石蠟切片，放大400倍；圖1-b示C組大鼠注射8周后視網膜組織石蠟切片，放大400倍。HE染色顯B組視網膜外核層完全萎縮，膠質化；而C組大鼠眼球同一部位經細胞治療后有留存的外核層細胞。多焦視覺電生理(multifocalvisualelectroretinogram,ERG)：分別于注射后和注射后2W,4W，8W進行暗適應ERG觀察視網膜神經感光細胞傳導的電位變化。如圖2所示，通過統(tǒng)計分析后，注射4W和8w后細胞注射組和HBSS組有顯著性差異。動物行為學-水迷宮檢測：注射后8w對三組動物進行水迷宮檢測，結果 如表1，行為學實驗說明玻璃體腔內移植RPC后，只改變了大鼠的視覺功能，未改變其運動能力。表1三組RCS行為觀察記錄結果組別例數潛伏期/s總時間/s路程/mm速度A組638.42±5.1552.42±5.0519662.35±2304.41364.23±20.67B組692.25±11.46**98.50±9.59**38963.91±4709.99*378.46±19.53C組655.96±19.18△65.96±16.05△23688.14±7146.14△334.77±22.49注：*示與A組比較具有顯著性差異(p<0.05)；**示與A組比較具有極顯著性差異(p<0.01)；△示與B組比較具有顯著性差異(p<0.05)。表1顯示，C組細胞移植組RCS鼠的運動路程和時間與B組對照組相比有顯著提高，這說明具有治療潛能的RPC移植后使RCS鼠的視功能改善。以上結果說明，本發(fā)明提供方法鑒定得到的視網膜祖細胞能夠具有治療視網膜退行性病變的功能。且C組大鼠在實驗過程中皆表現(xiàn)出良好的治療效果，未見產生任何不良反應，未見惡性腫瘤的產生，也未見產生任何的并發(fā)癥。采用本發(fā)明其他實施例制得的視網膜祖細胞制劑進行實驗的結果與此相似。實施例7保藏編號為CGMCCNO.10419的視網膜祖細胞體內外的表達情況1、體外培養(yǎng)：以實施例1提供的方法培養(yǎng)保藏編號為CGMCCNO.10419的視網膜祖細胞，分別于培養(yǎng)15天、30天、60天后檢測細胞上清液中因子的表達情況。檢測采用RAYBIOTEC芯片進行檢測，主要檢測包括炎性因子芯片、生長因子芯片、細胞因子芯片和凋亡因子芯片。結果如圖3所示。2、體內培養(yǎng)：取實施例4中B組和C組的注射后8W的RCS鼠，將玻璃體腔液裂解后取其裂解液，用RAYBIOTEC芯片進行檢測，主要檢測包括炎性因子芯片、生長因子芯片、細胞因子芯片和凋亡因子芯片。結果如圖4所示。結果表明，經過玻璃體腔移植RPC治療后，有25種因子高表達。主要是：BDNF(腦源性神經營養(yǎng)因子)、GDF-15(生長分化因子-15)、FGF-4(成纖維細胞生長因子4)、FGF-7(成纖維細胞生長因子7)、NGF(神經生長因子)、GDNF (膠質細胞源性神經營養(yǎng)因子)、IGF-Ⅰ(胰島素樣生長因子-Ⅰ)、IGF-Ⅱ(胰島素樣生長因子-Ⅱ)、NT-3(神經營養(yǎng)因子-3)、NT-4(神經營養(yǎng)因子-4)、IGFBP-1(胰島素生長因子結合蛋白1)、IGFBP-2(胰島素生長因子結合蛋白2)、IGFBP-3(胰島素生長因子結合蛋白3)、IGFBP-4(胰島素生長因子結合蛋白4)、IGFBP-6(胰島素生長因子結合蛋白6)、OPG(骨保護素)、TGF-β1(轉移生長因子-β1)、TGF-β3(轉移生長因子-β3)、PDGF-AA(血小板衍生生長因子-AA)、VEGF(血管內皮生長因子)、CNTF(睫狀神經營養(yǎng)因子)、TNF(腫瘤壞死因子)、HSP27(熱休克蛋白27)、HSP60(熱休克蛋白60)和HSP70(熱休克蛋白70)。而在體外培養(yǎng)的視網膜祖細胞中，這些因子也得到了高度的表達?？梢?，本發(fā)明提供方法鑒定的視網膜祖細胞能夠高度表達上述生長因子，因此，能夠具有治療視網膜退行性病變的功能。以上僅是本發(fā)明的優(yōu)選實施方式，應當指出，對于本
技術領域：
的普通技術人員來說，在不脫離本發(fā)明原理的前提下，還可以做出若干改進和潤飾，這些改進和潤飾也應視為本發(fā)明的保護范圍。當前第1頁1 2 3