本發(fā)明涉及Gly-Phe-Pro，涉及它的制備方法，涉及它的鎮(zhèn)痛作用，涉及它的抗炎作用，涉及它的抗腫瘤活性，涉及它的抗血栓活性及涉及它的溶血栓活性，因而本發(fā)明涉及它作為鎮(zhèn)痛抗炎藥物，抗腫瘤藥物，抗血栓藥物和溶血栓藥物的應用。本發(fā)明屬于生物醫(yī)藥領域。

背景技術：

發(fā)明抗腫瘤、抗血栓、溶血栓、抗凝血、鎮(zhèn)痛、抗炎作用寡肽是發(fā)明人長期關注的領域。雖然發(fā)明人發(fā)明公開過一系列具有這些活性的寡肽，但是集這些活性為一體的寡肽一直沒有得到。經(jīng)過近10年的序列設計和近5年的實驗研究，發(fā)明人發(fā)現(xiàn)Gly-Phe-Pro是集鎮(zhèn)痛作用，抗炎作用，抗腫瘤作用抗血栓作用和溶血栓作用為一體的寡肽。

技術實現(xiàn)要素：

本發(fā)明的第一個內(nèi)容是提供Gly-Phe-Pro。

本發(fā)明的第二個內(nèi)容是提供Gly-Phe-Pro的合成方法，該方法包括：

(1)在DCC、HOBt的催化下按標準方法制備Boc-Gly-Phe-OBzl；

(2)Boc-Gly-Phe-OBzl在H₂Pd/C催化下氫解轉化成Boc-Gly-Phe；

(3)在DCC、HOBt的催化下制備Boc-Gly-Phe-Pro-OBzl；

(4)Boc-Gly-Phe-Pro-OBzl在H₂Pd/C催化下氫解轉化成Boc-Gly-Phe-Pro

(5)Boc-Gly-Phe-Pro在4N的氯化氫-乙酸乙酯溶液中，0℃脫Boc，中轉化成Gly-Phe-Pro

本發(fā)明的第三個內(nèi)容是評價Gly-Phe-Pro的鎮(zhèn)痛作用。

本發(fā)明的第四個內(nèi)容是評價Gly-Phe-Pro抗炎作用。

本發(fā)明的第五個內(nèi)容是評價Gly-Phe-Pro抗腫瘤作用。

本發(fā)明的第六個內(nèi)容是評價Gly-Phe-Pro抗血栓作用。

本發(fā)明的第七個內(nèi)容是評價Gly-Phe-Pro溶血栓作用。

附圖說明

圖1.Gly-Phe-Pro的合成路線.i)二環(huán)己基碳二亞胺(DCC)，1-羥基苯并三唑(HOBt)，N-甲基嗎啉(NMM)，四氫呋喃(THF)；ii)H₂，Pd/C；iii)4N氯化氫的乙酸乙酯溶液，0℃。

具體實施方式

為了進一步闡述本發(fā)明，下面給出一系列實施例。這些實施例完全是例證性的，它們僅用來對本發(fā)明進行具體描述，不應當理解為對本發(fā)明的限制。

實施例1制備Boc-Gly-Phe-OBzl

冰浴下1.75g(10mmol)Boc-Gly溶解于少量無水四氫呋喃(THF)中，加入1.36g(10mmol)HOBt，加入2.47g(12mmol)DCC于少量的無水THF中，活化30分鐘，加入2.55g(10mmol)Phe-OBzl，用NMM調(diào)節(jié)pH＝9，反應結束后濾除去二環(huán)己基脲(DCU)。濾液減壓濃縮，殘留物用乙酸乙酯溶解，再次過濾DCU，濾液用NaHCO₃飽和溶液洗3遍，用NaCl飽和溶液洗3遍，5％的KHSO₄溶液洗3遍，NaCl飽和溶液萃洗3遍，5％的NaHCO₃溶液萃洗3遍，NaCl飽和溶液萃洗3遍，乙酸乙酯層用無水Na₂SO₄干燥2小時，濾除Na₂SO₄，濾液減壓濃縮，得到3.45g(83.7％)標題化合物，為無色油狀物。ESI⁺-MS(m/e)：413[M+H]⁺。

實施例2制備Boc-Gly-Phe

將4.12g(10mmol)Boc-Gly-Phe-OBzl用甲醇溶解，加入412mg的10％的Pd/C。連接三通，減壓抽除茄瓶中的空氣后，將反應瓶中充滿H₂.按該操作重復3次。反應20h后原料點消失。濾除Pd/C，旋干甲醇。得到3.02g(93.7％)標題化合物，為無色粉末。ESI⁺-MS(m/e)：323[M+H]⁺。

實施例3制備Boc-Gly-Phe-Pro-OBzl

按照實施例1的方法，3.22g(10mmol)Boc-Gly和2.05g(10mmol)Pro-OBzl得到標題化合物，為無色粉末。ESI⁺-MS(m/e)：511[M+H]⁺；¹H-NMR(300MHz，DMSO-d6)：δ/ppm＝8.15(m，1H)，7.30(d，9H)，6.88(s，1H)，5.09(s，2H)，4.69(m，1H)，4.39(m，1H)，3.67(m，2H)，3.47(s，2H)，2.90(m，2H)，1.98(m，4H)，1.36(s，9H)。

實施例4制備Boc-Gly-Phe-Pro

按照實施例2的方法，從4.19g(10mmol)Boc-Gly-Phe-Pro-OBzl得到3.95g(94.3％)標題化合物，為無色粉末.ESI⁺-MS(m/e)：420[M+H]⁺。

實施例5制備Gly-Phe-Pro

冰浴下，將4.19g(10mmol)Boc-Gly-Phe-Pro-OBzl用盡量少的乙酸乙酯溶解，攪 拌10min，加入40mL氯化氫-乙酸乙酯溶液(4N)反應4h，原料點消失。反應混合物減壓濃縮至干，殘留物加40mL干燥過的乙酸乙酯溶解，得到的溶液減壓濃縮至干。殘留物按該操作重復3次。殘留物加無水乙醚，用塑料鏟研磨，減壓濃縮除去乙醚。殘留物按該操作重復3次。得到最終得到2.97g(93.1％)標題化合物，為無色粉末。ESI-MS(m/e)：320[M+H]⁺；Mp 96～97℃.(c＝0.12，甲醇).¹H-NMR(300MHz，DMSO-d6)：δ/ppm＝7.21(m，5H)，4.70(m，1H)，4.25(m，1H)，3.60(m，2H)，3.28(m，2H)，2.85(m，2H)，2.07-1.57(m，4H)。

實施例6評價Gly-Phe-Pro的鎮(zhèn)痛活性

雄性ICR小鼠(20±2g)裝到小鼠固定器中，鼠尾暴露于固定器外，于鼠尾距離尾尖三分之一處標記，作為光感感受器的感應點，照射鼠尾距離尾尖三分之二的位置。測痛儀預熱30min，記時，將小鼠鼠尾遮住光感儀。燈閃爍時開始記時，鼠尾離開光感儀時停止記時，測得的時間即為小鼠產(chǎn)生痛感的時間，連續(xù)測定3次，每次測量間隔為5min，取平均值。未服藥小鼠產(chǎn)生痛感的時間為基礎痛感時間。服藥引起的小鼠產(chǎn)生痛感時間變化反映了藥物的鎮(zhèn)痛活性。小鼠，隨機分組，每組14只，測定基礎痛感時間后，小鼠或口服0.2mL Gly-Phe-Pro(GFP)的生理鹽水溶液，劑量為1μmol/kg或口服0.2mL生理鹽水或口服阿司匹林的生理鹽水溶液，劑量為1200μmol/kg。測量給藥后30，60，90，120，150和180min小鼠產(chǎn)生痛感的時間。數(shù)據(jù)用均值±SD秒表示，列如表1，用方差分析并進行t檢驗。數(shù)據(jù)表明，口服生理鹽水30，60，90，120，150和180min之后小鼠產(chǎn)生痛感的時間與口服生理鹽水之前的基礎痛感時間沒有顯著差異；口服1200μmol/kg阿司匹林60，90，120，150和180min之后小鼠產(chǎn)生痛感的時間顯著長于口服阿司匹林之前的基礎痛感時間；口服1μmol/kg Gly-Phe-Pro 30，60，90，120，150和180min之后小鼠產(chǎn)生痛感的時間顯著長于口服Gly-Phe-Pro之前的基礎痛感時間?？梢姡诜?μmol/kgArg-Leu-Val-Cys-Val60，90，120，150和180min之后的鎮(zhèn)痛活性與口服1200μmol/kg阿司匹林相當。而口服1μmol/kg Gly-Phe-Pro 30min之后的鎮(zhèn)痛活性比口服1200μmol/kg阿司匹林還強。

表1Gly-Phe-Pro(GFP)的鎮(zhèn)痛活性

n＝14；a)與基礎痛感時間比p＞0.05；b)與基礎痛感時間比p＜0.05；c)與基礎痛感時間比p＜0.05。

實施例7評價Gly-Phe-Pro的抗炎活性

體重20±雄性小鼠口服1μmol/kgGly-Phe-Pro或1200μmol/kg阿司匹林或0.2mL/20g生理鹽水30分鐘后，往小白鼠的左耳外廓涂二甲苯(0.04mL)，2小時后將小白鼠頸椎脫臼處死。將小鼠的左，右耳剪下，用直徑7mm的打孔器在兩耳的相同位置，取圓形耳片，分別稱重，求出兩圓耳片的重量差作為腫脹度。(腫脹度＝左耳原片重量-右耳原片重量)以腫脹度表示化合物的活性。本實驗數(shù)據(jù)統(tǒng)計均采用t檢驗和方差分析，腫脹度以()表示。結果表明，Gly-Phe-Pro治療的鼠耳腫脹度與生理鹽水組相比具有顯著性差異，表明化合物具有確切的抗炎活性。

表2Gly-Phe-Pro的抗炎活性

n＝14；a)與生理鹽水比p＜0.01。

實施例8化合物Gly-Phe-Pro的體內(nèi)抗腫瘤活性評價

無菌條件下取接種于ICR小鼠7-10天的S180肉瘤，加入適量生理鹽水配制成瘤細胞懸液，細胞數(shù)為2×10⁷/mL，接種于健康雄性ICR小鼠前肢腋皮下，每只小鼠注射0.2mL。腫瘤接種24h后，小鼠每日腹腔注射0.2mL Gly-Phe-Pro的生理鹽水溶液，連續(xù)給藥10天，劑量為1μmol/kg；或小鼠每日腹腔注射0.2mL阿霉素的生理鹽水溶液，連續(xù)給藥10天，劑量為2μmol/kg；或小鼠每日腹腔注射0.2mL生理鹽水，連續(xù)給藥10天。實驗進行至第11天，稱小鼠體重，乙醚麻醉剖取各組小鼠的腫瘤，稱重并以瘤重表示化合物的活性，數(shù)據(jù)列入表3。結果表明1μmol/kgGly-Phe-Pro治療小鼠的瘤重明顯小于生理鹽水治療小鼠的瘤重，Gly-Phe-Pro顯示確切的抗腫瘤活性。

表3Gly-Phe-Pro對S180荷瘤小鼠的瘤重的影響

n＝12；a)與生理鹽水比p＜0.05。

實施例9評價Gly-Phe-Pro的抗栓活性

1)將聚乙烯管拉成一端為斜口的細管，定長為10.0cm，分別為右經(jīng)靜脈(管徑較粗)及左頸動脈(管徑較細)插管；中段聚乙烯管定長為8.0cm，血栓線壓在頸動脈插管方向，插管前需在管中充滿肝素。

2)體重250±雄性大鼠口服1μmol/kg Gly-Phe-Pro或167μmol/kg阿司匹林或0.3mL/100g生理鹽水30分鐘后，腹腔注射20％的烏拉坦進行麻醉。仰臥位將大鼠固定于鼠板上，剪開頸部皮膚，分離右頸總動脈及左頸靜脈，血管下壓線，結扎遠心端，靜脈靠遠心端處剪一小口，進行靜脈端插管，注射肝素，系線固定，再用動脈夾夾住動脈近心端，靠近遠心端方向剪一小口，進行動脈端結扎，系線固定后松開動脈夾，建立體外循環(huán)旁路。循環(huán)15分鐘后先剪斷靜脈端觀察血液循環(huán)是否正常，若正常從動脈端取出血栓線，在紙上沾干浮血后稱重，以栓重表示化合物的活性，數(shù)據(jù)列入表4。結果表明，Gly-Phe-Pro治療大鼠的血栓重明顯小于生理鹽水治療大鼠的血栓重，Gly-Phe-Pro顯示確切的抗血栓活性。

表4Gly-Phe-Pro的抗栓活性

n＝12；a)與生理鹽水比p＜0.05。

實施例10評價Gly-Phe-Pro的溶栓活性

將大鼠靜息飼養(yǎng)一天，隨機分組，每組10只，禁食不禁水。

1)將體重250±雄性SD大鼠用20％烏拉坦溶液進行麻醉(6mL/kg腹腔)。麻醉后的大鼠固定于鼠板上，分離右側頸總動脈，于近心端夾動脈夾，近心端和遠心端分別傳入手術線，在遠心端插取血管，松開動脈夾取約1mL動脈血。迅速將動脈血注射入垂直的造栓管(長16mm，內(nèi)徑2.5mm，外徑5mm，管底用1mL EP管底座)中，(注意不可有氣泡)每個造栓管中注入0.1mL大鼠動脈血液，往管內(nèi)迅速插入血栓固定螺栓(長20mm，)，血液凝固40min，用針灸針取出血栓，稱取血栓重量。

2)旁路插管由三部分組成，其中中段為聚乙烯膠管，長60mm，內(nèi)徑3.5mm，兩端為相同的聚乙烯管，長100mm，內(nèi)徑1mm，外景2mm，該管的一段拉成尖管，另一端的外部套一段長7mm，外徑3.5mm的聚乙烯管。三段管的內(nèi)壁均為硅烷化。

3)將血栓包裹的血栓固定螺栓置于中段的聚乙烯膠管內(nèi)，膠管的兩端分別與兩根聚乙烯的加粗端相套，用注射器通過尖管端注滿肝素生理鹽水溶液。將充滿肝素鈉的生理鹽水溶液一端插入左側靜脈，另一端用注射器加入準確量的肝素鈉抗凝后，拔掉肝素鈉的注射器，插入動脈端。用頭皮針將生理鹽水(3mL/kg)或者尿激酶的生理鹽水溶液(20000IU/kg)或Gly-Phe-Pro的生理鹽水溶液(1μmol/kg)通過旁路管的中段，刺入遠離血栓固定螺栓的近靜脈處，打開動脈夾，使血流通過旁路管道從動脈流入靜脈的時刻為循環(huán)起始時間，緩慢的將注射器中的液體注入到血液中(約6min)，使生理鹽水，尿激酶，Gly-Phe-Pro通過血液循環(huán)，按靜脈-心臟-動脈的順序作用到血栓上。60min后取出附有血栓的螺栓，蘸去浮血，記錄重量。以血栓減重代表溶栓活性。數(shù)據(jù)列入表4。結果表明，Gly-Phe-Pro治療大鼠的血栓減重明顯大于生理鹽水治療大鼠的血栓減重，Gly-Phe-Pro顯示確切的溶血栓活性。

表5Gly-Phe-Pro的溶栓活性

n＝10；a)與生理鹽水比p＜0.01。