及下式(6s)-4，5，6，7-四氫-3H-咪唑[4，5-c]并吡啶-6-甲酰-Lys-Lys，涉及它的制備方法，涉及它治療缺血性中風(fēng)的作用，因而本發(fā)明涉及它在制備缺血性中風(fēng)藥物中的應(yīng)用。本發(fā)明屬于生物醫(yī)藥領(lǐng)域。

背景技術(shù)：

缺血性中風(fēng)是一類較常見且危害嚴(yán)重的腦血管疾病，特點是發(fā)病率高、病死率高、致殘率高和復(fù)發(fā)率高。目前臨床治療缺血性中風(fēng)面臨沒有有效藥物的現(xiàn)實，尤其中風(fēng)面4h以上的患者非死即殘。發(fā)明對中風(fēng)面4h以上的患者有效的藥物是臨床的重要需求。發(fā)明人曾經(jīng)公開式II的咪唑啉化合物在中風(fēng)面24h的大鼠缺血性中風(fēng)模型上，顯示優(yōu)秀療效。即連續(xù)靜脈注射6天式II的咪唑啉化合物，每天1次，首次劑量為5μmol/kg，后5次的劑量為2μmol/kg具有優(yōu)秀療效。式中aa₁和aa₂可為同時存在，aa₁存在但aa₂不存在，或同時不存在；當(dāng)aa₁和aa₂同時存在時，aa₁為R(Arg)，且aa₂為G(Gly)，A(Ala)或Q(Gln)；當(dāng)aa₁存在但aa₂不存在時，aa₁為R(Arg)；aa₃可為S(Ser)，V(Val)或F(Phe)。由于式II的取代咪唑啉結(jié)構(gòu)單元比較復(fù)雜需要簡化。

發(fā)明人在經(jīng)過3年實驗研究，發(fā)現(xiàn)用4，5，6，7-四氫-3H-咪唑[4，5-c]并吡啶-6-甲?；媸絀I的取代咪唑啉結(jié)構(gòu)單元可以獲得結(jié)構(gòu)簡單和療效好意想不到的雙重技術(shù)效果。按照這個發(fā)現(xiàn)，發(fā)明人提出了本發(fā)明。

技術(shù)實現(xiàn)要素：

本發(fā)明的第一個內(nèi)容是提供下式的(6s)-4，5，6，7-四氫-3H-咪唑[4，5-c]并吡啶-6-甲酰-Lys-Lys。

本發(fā)明的第二個內(nèi)容是提供上式的(6s)-4，5，6，7-四氫-3H-咪唑[4，5-c]并吡啶-6-甲酰-Lys-Lys的合成方法，該方法包括：

(1)在稀硫酸存在下，甲醛與L-組氨酸在60℃下反應(yīng)，生成(6s)-4，5，6，7-四氫-3H-咪唑[4，5-c]并吡啶-6-羧酸；

(2)在DCC和HOBt存在下(6s)-3，5-二-Boc-4，5，6，7-四氫-3H-咪唑并[4，5-c]吡啶-6-羧酸在無水四氫呋喃中與Lys(Boc)-OBzl縮合為(6s)-3，5-二-Boc-4，5，6，7-四氫-3H-咪唑并[4，5-c]吡啶-6-甲酰-L-Lys(Boc)-OBzl。

(3)在Pd/C存在下(6s)-3，5-二-Boc-4，5，6，7-四氫-3H-咪唑并[4，5-c]吡啶-6-甲酰-L-Lys(Boc)-OBzl在甲醇溶液中脫去OBzl生成(6s)-3，5-二-Boc-4，5，6，7-四氫-3H-咪唑并[4，5-c]吡啶-6-甲酰-L-Lys(Boc)；

(4)在DCC和HOBt存在下(6s)-3，5-二-Boc-4，5，6，7-四氫-3H-咪唑并[4，5-c]吡啶-6-甲酰-L-Lys(Boc)在無水四氫呋喃中與Lys(Boc)-OBzl縮合為(6s)-3，5-二-Boc-4，5，6，7-四氫-3H-咪唑并[4，5-c]吡啶-6-甲酰-L-Lys(Boc)-Lys(Boc)-OBzl。

(5)將步驟(4)所制備的化合物脫去保護(hù)基，得到上式所示的化合物。

其中所述HOBt是N-羥基苯并三氮唑的縮略術(shù)語，DCC是二環(huán)己基羰二亞胺的縮略術(shù)語，Boc為叔丁氧羰基的縮略術(shù)語，Pd/C為鈀/碳。

本發(fā)明的第三個內(nèi)容是評價上式的(6s)-4，5，6，7-四氫-3H-咪唑[4，5-c]并吡啶-6-甲酰-Lys-Lys治療缺血性中風(fēng)的活性。

附圖說明

圖1(6s)-4，5，6，7-四氫-3H-咪唑[4，5-c]并吡啶-6-甲酰-Lys-Lys的合成路線.(i)H₂SO₄，HCHO，60℃；(ii)1N NaOH，(Boc)₂O；(iii)DCC，HOBt，NMM；(iv)H₂，Pd/C；(v)4N氯化氫-乙酸乙酯溶液；(vi)TFA/TFSA。

具體實施方式

為了進(jìn)一步闡述本發(fā)明，下面給出一系列實施例。這些實施例完全是例證性的，它們僅用來對本發(fā)明進(jìn)行具體描述，不應(yīng)當(dāng)理解為對本發(fā)明的限制。

實施例1制備(6s)-4，5，6，7-四氫-3H-咪唑并[4，5-c]吡啶-6-羧酸(1)

將10g(64.5mmol)L-His用80mL蒸餾水和20mL甲醛混合溶液溶解，然后往里滴加1mL濃H₂SO₄，60℃微波反應(yīng)5小時，冷卻到室溫，往反應(yīng)化合物中冰浴下滴加濃氨水調(diào)pH至7，有大量沉淀析出。過濾，得10.5g(97％)標(biāo)題化合物，為無色固體。ESI-MS(m/z)167[M+H]⁺。

實施例2制備(6s)-3，5-二-Boc-4，5，6，7-四氫-3H-咪唑并[4，5-c]吡啶-6-羧酸(2)

冰浴下將1.67g(10mmol)(6s)-4，5，6，7-四氫-3H-咪唑并[4，5-c]吡啶-6-羧酸溶于5ml2N氫氧化鈉水溶液。往該反應(yīng)液中加5.23g(24mmol)(Boc)₂O與10mL二氧六環(huán)的溶液。室溫攪拌，TLC(CH₂Cl₂∶MeOH＝15∶1)監(jiān)控反應(yīng)原料點消失。反應(yīng)完成后，過濾，濾液減壓濃縮除去二氧六環(huán)。殘留的水層用飽和KHSO₄水溶液酸化至pH值至2，用乙酸乙酯萃取三次，合并乙酸乙酯層，并用少量水反洗，乙酸乙酯層用無水Na₂SO₄干燥，過濾，減壓濃縮得到的淡黃色固體用乙酸乙酯浸泡磨洗，過濾，得1.55g(42％)標(biāo)題化合物，為無色固體。ESI-MS(m/z)367[M+H]⁺。

實施例3制備(6s)-3，5-二-Boc-4，5，6，7-四氫-3H-咪唑[4，5-c]并吡啶-6-甲酰-Lys(Boc)-OBzl(3)

冰浴和攪拌下3.67g(10.0mmol)(6s)-3，5-二(Boc)-4，5，6，7-四氫-3H-咪唑并[4，5-c]吡啶-6-羧酸，1.48g(11.0mmol)HOBt和2.47g(12.0mmol)DCC加50ml無水THF溶解，反應(yīng)液活化30分鐘。然后將3.91g(10.5mmol)Tos·Lys(Boc)-OBzl與50mL無水THF并用1.0mL NMM調(diào)節(jié)pH至9的懸浮液滴加到活化的反應(yīng)液中。撤去冰浴，室溫攪拌12小時，濾除二環(huán)己基脲(DCU)。濾液減壓濃縮至干，殘留物用乙酸乙酯溶解，再濾除DCU。濾液層依次用飽和NaHCO₃溶液洗3次，飽和NaCl溶液洗3次，飽和KHSO₄溶液洗3次，飽和NaCl溶液洗3次，飽和NaHCO₃溶液洗3次，飽和NaCl溶液洗3次，乙酸乙酯層用無水Na₂SO₄干燥，過濾、濾液減壓濃縮，殘留物經(jīng)柱層析(石油醚/丙酮體系8∶1-2∶1)純化得3.97g(58％)標(biāo)題化合物，為無色固體，ESI-MS(m/z)686[M+H]⁺。

實施例4制備(6s)-3，5-二-Boc-4，5，6，7-四氫-3H-咪唑[4，5-c]并吡啶-6-甲酰-L-Lys(Boc)(4)

稱取200mg(0.29mmol)(6s)-3，5-二-Boc-4，5，6，7-四氫-3H-咪唑[4，5-c]并吡啶-6-甲酰-L-Lys(Boc)-OBzl于50mL茄形瓶中，用10mL甲醇溶解后，加入20mg Pd/C，先用真空水泵抽走反應(yīng)瓶中的空氣，然后通入氫氣，如此反復(fù)三次，最后保持通氫氣狀態(tài)反應(yīng)12小時，利用TLC(石油醚∶丙酮＝3∶1)監(jiān)測至原料斑點消失后，減壓過濾，將濾液減壓濃縮至干得160mg(92％)標(biāo)題化合物，為無色固體，ESI/MS(m/e)：596 [M+H]⁺。

實施例5制備3，5-二-Boc-4，5，6，7-四氫-3H-咪唑[4，5-c]并吡啶-6-酰基-Lys(Boc)-Lys(Boc)-OBzl(5)

采用實施例3的方法從819mg(1.38mmol)(6s)-3，5-二-Boc-4，5，6，7-四氫-3H-咪唑[4，5-c]并吡啶-6-甲酰-L-Lys(Boc)和564mg(1.51mmol)HCl·K(Boc)-OBzl，純化得628mg(50％)標(biāo)題化合物，為無色固體。ESI-MS(m/e)：914[M+H]⁺；¹H-NMR(300MHz，DMSO-d₆)：δ/ppm＝8.06(s，1H)，7.41-7.30(m，4H)，5.13(s，2H)，4.80(m，1H)，4.47(m，1H)，4.22-4.14(m，2H)，2.91-2.81(m，5H)，1.66(m，1H)，1.57(s，9H)，1.44(s，9H)，1.37(s，9H)，1.31(s，9H)，1.29-1.09(m，7H)。

實施例6制備4，5，6，7-四氫-3H-咪唑[4，5-c]并吡啶-6-?；?Lys-Lys(6)

冰浴下向111mg(0.12mmol)3，5-二-Boc-4，5，6，7-四氫-3H-咪唑[4，5-c]并吡啶-6-?；?Lys(Boc)-Lys(Boc)-OBzl中加3mL TFA和1mL TFMSA，攪拌30min后TLC(CH₂Cl₂∶MeOH＝1∶1)顯示原料點消失，停止反應(yīng)。反應(yīng)物用無水乙醚反復(fù)洗滌，減壓濃縮至干，殘留物用水溶解，用氨水調(diào)pH值至8。得到的溶液先用Sephadex G10除鹽，然后用制備柱T3 Prep OBD^TM 5μm 30×150mm純化。得10mg(20％)標(biāo)題化合物，為白色固體。Mp：127.7-129.5℃；IR(KBr)：3049，2935，1661，1545，1427，1178，1048，834，761，638，577cm^-1；ESI-MS(m/e)：423[M+H]⁺；¹H-NMR(500MHz，DMSO-d₆)：δ/ppm＝7.772(m，1H)，8.532(m，1H)，8.285(m，1H)，7.784-7.745(m，3H)，4.378-4.352(m，2H)，4.262(m，1H)，4.226(m，1H)，4.137(m，1H)，3.447-3.400(m，2H)，3.304(m，1H)，2.822-2.731(m，3H)，1.739-1.683(m，2H)，1.602-1.502(m，6H)，1.357-1.343(m，4H)。

實驗例1評價化合物6的抗血栓活性

將雄性SD大鼠(200±20g)，隨機(jī)分組，每組10只，飼養(yǎng)1天，停止喂食過夜。灌胃給予化合物6的生理鹽水溶液(劑量為1nmol/kg)或阿司匹林的生理鹽水溶液(劑量為167μmol/kg)或生理鹽水(劑量為10ml/kg)30min之后，大鼠用20％烏來糖的生理鹽水溶液麻醉，之后手術(shù)。分離大鼠的右頸動脈和左頸靜脈，將準(zhǔn)確稱重的絲線置于旁路插管，管的一端插入左靜脈，另一端管插入右側(cè)動脈并注射0.2mL肝素鈉抗凝。使得血流從右側(cè)動脈流經(jīng)旁路插管進(jìn)入左側(cè)靜脈，15min之后取出附有血栓的絲線稱量，計算血液循環(huán)前后絲線的重量，得到的血栓重以均值±SD mg表示并代表抗血栓活性，作t檢驗。數(shù)據(jù)列入表1。結(jié)果表明口服1nmol/kg化合物6能有效地抑制血栓形成，獲得了意想不到的技術(shù)效果。

表1 1nmol/kg化合物6的抗血栓活性

n＝10，a)與生理鹽水相比，p＜0.01，與阿司匹林相比，p＜0.01。

實驗例2評價化合物6的溶血栓活性

SD大鼠(雄性，200±20g)按1200mg/kg的劑量腹腔注射烏拉坦生理鹽水溶液進(jìn)行麻醉。麻醉大鼠后將其仰臥位固定，分離其右頸總動脈，近心端處夾住動脈夾，將近心端及遠(yuǎn)心端分別穿入手術(shù)線，遠(yuǎn)心端的手術(shù)線結(jié)扎，遠(yuǎn)心端插管，將動脈夾松開，取出約1mL動脈血，置于1mL離心管中。往垂直固定的橡膠管(長15mm，內(nèi)徑2.5mm，外徑5.0mm，管底用膠塞密封，para膜封緊)內(nèi)注入0.1mL大鼠動脈血，隨后在管內(nèi)迅速插入一支不銹鋼材質(zhì)的血栓的固定螺栓(血栓固定螺旋用直徑為0.2mm的不銹鋼絲繞成，螺旋部分長10mm，內(nèi)含15個螺圈，螺圈的直徑為1.0mm，托柄與螺旋相連，長約7.0mm，呈問號型)。血液凝固45min后，從玻璃管中小心取出被血栓包裹的血栓固定螺旋，精確稱其重量。

旁路插管由三部分構(gòu)成，中間段為長60.0mm，內(nèi)徑3.5mm的聚乙烯膠管；兩端均為長100.0mm，內(nèi)徑1.0mm，外徑2.0mm的相同的聚乙烯管，該管一端拉成尖管，長約10.0mm(用于插入大鼠頸動脈及靜脈)，外徑為1.0mm，其另一端的外部套一段長為7.0mm，外徑為3.5mm的聚乙烯管(用于插入中段的聚乙烯膠管內(nèi))，3段管的內(nèi)壁均需要硅烷化(1％的硅油乙醚溶液)。將血栓包裹的血栓固定螺旋置于中段聚乙烯膠管內(nèi)，膠管的另外兩端分別與兩根聚乙烯的加粗端相套，保證在循環(huán)的過程中不會漏血。用注射器通過尖管端將管中注滿肝素生理鹽水溶液(50IU/kg)，排除氣泡，備用。

分離大鼠的左頸外靜脈，近心端和遠(yuǎn)心端分別穿入手術(shù)線，結(jié)扎遠(yuǎn)心端的血管，在暴露的左頸外靜脈上剪一小口，將上述制備好的旁路管道尖管由小口插入左頸外靜脈開口處，同時遠(yuǎn)離旁路管中段(含精確稱量的血栓固定螺旋)內(nèi)血栓固定螺旋。用注射器通過另一端的尖管注入準(zhǔn)確量的肝素鈉的生理鹽水溶液(50IU/kg)，此時注射器不要撤離聚乙烯管，用動脈夾夾住注射器與聚乙烯管之間的軟管。在右頸總動脈的近 心端用動脈夾止血，結(jié)扎遠(yuǎn)心端，在離動脈夾不遠(yuǎn)處將右頸總動脈剪一小口，從聚乙烯管的尖部拔出注射器，將聚乙烯管的尖部插入動脈斜口的近心端。旁路管道的兩端均用4號手術(shù)縫線將動靜脈固定。

用頭皮針將生理鹽水(3mL/kg)或尿激酶的生理鹽水溶液(劑量為20000IU/kg)或化合物6的生理鹽水溶液(劑量為1nmol/kg)通過旁路管的中段(含精確稱量的血栓固定螺旋)，扎入遠(yuǎn)離血栓固定螺旋的近靜脈端，松開動脈夾，使血流通過旁路管道從動脈流向靜脈。將注射器中的溶液緩慢注入血液，通過血液循環(huán)，按靜脈-心臟-動脈的順序作用于螺旋的血栓上。血液循環(huán)1h之后，從旁路管道中取出固定血栓的螺旋，精確稱量。計算每只大鼠旁路管道中固定血栓的螺旋血液循環(huán)前后血栓的重量差，以均值±SD mg表示并代表溶血栓活性，作t檢驗。數(shù)據(jù)列入表2。結(jié)果表明1nmol/kg化合物6能有效地溶解形成的血栓，獲得了意想不到的技術(shù)效果。

表2 1nmol/kg化合物6的溶血栓活性

n＝10，a)與生理鹽水相比，p＜0.01，與尿激酶相比，p＜0.05。

實驗例3評價化合物6對缺血性中風(fēng)大鼠的治療作用

在雄性SD大鼠(體重300±20g)的頸部正中部豎直開約2cm長切口，沿胸鎖乳突肌內(nèi)側(cè)緣分離出右頸總動脈、頸外動脈及頸內(nèi)動脈。用無創(chuàng)動脈夾分別夾閉頸內(nèi)動脈開口處和頸總動脈近心端，結(jié)扎頸外動脈的遠(yuǎn)心端，在頸外動脈剪一小口，松開頸總動脈近心端的動脈夾，取10μL血，之后再用無創(chuàng)動脈夾夾閉頸總動脈的近心端。將取得的10μL血放置在1ml EP管中常溫放置30分鐘使血液凝固，然后轉(zhuǎn)移至-20℃冰箱中放置1小時，使血液凝塊結(jié)實。大鼠用10％水合氯醛腹腔注射麻醉，劑量為400mg/kg。取出血液凝塊，加入1mL生理鹽水，用鋼鏟把血液凝塊搗成大小均一的細(xì)小血栓塊，制備細(xì)小血栓的懸液并轉(zhuǎn)移至1mL注射器內(nèi)。松開頸總動脈近心端的動脈夾，將1mL血栓混懸液緩慢從大鼠頸外動脈向近心端經(jīng)過頸內(nèi)動脈注入大鼠的大腦，然后結(jié)扎頸外動脈近心端，打開頸內(nèi)動脈和頸總動脈處得動脈夾，恢復(fù)血流。等待蘇醒。大鼠蘇醒24小時后按Zealonga方法評定神經(jīng)功能缺損程度。0分表示無任何神經(jīng)功能缺失體征、1分表示未損傷側(cè)前肢不能伸展、2分表示向未損傷側(cè)行走、3分 表示向未損傷側(cè)轉(zhuǎn)圈成追尾狀行走、4分表示意識障礙無自主行走、5分表示死亡。按照得分平均分組。各組大鼠經(jīng)尾靜脈每天注射1次化合物6，劑量為1nmol/kg。連續(xù)注射6天，每天評分。結(jié)果列入表3。數(shù)據(jù)表明化合物6連續(xù)治療6天除可使1只腦缺血24小時的大鼠神經(jīng)生物學(xué)評分為2分外，還可將9只腦缺血24小時神經(jīng)生物學(xué)評分為2分、3分的大鼠改善為1分。因為不像已經(jīng)公開的化合物首次劑量需要5μmol/kg，后5次維持劑量需要2μmol/kg，化合物6的6次劑量均為1nmol/kg。這樣一來，首次劑量和維持劑量分別降低了5000倍和2000倍。

表3化合物6連續(xù)治療6天對腦缺血24小時大鼠神經(jīng)生物學(xué)評分的影響

n＝10