本發(fā)明涉及一種在藥物非臨床研究(安全性評(píng)價(jià))中，利用細(xì)胞核大小形態(tài)測(cè)量方法在犬睪丸粗線期、細(xì)線期和精子細(xì)胞中的鑒定及生殖毒性的評(píng)價(jià)，該技術(shù)根據(jù)測(cè)量睪丸生精細(xì)胞細(xì)胞核的面積和周長(zhǎng)判定精母細(xì)胞處于細(xì)胞周期的不同階段，繼而根據(jù)精母細(xì)胞的各期細(xì)胞數(shù)目和比例判斷精母細(xì)胞的發(fā)育情況，判斷藥物在雄性犬及其他雄性動(dòng)物體內(nèi)對(duì)生精細(xì)胞的影響。具有快速、準(zhǔn)確、節(jié)省人力物力的巨大優(yōu)勢(shì)。本發(fā)明為非臨床安全性評(píng)價(jià)中對(duì)犬及其他雄性動(dòng)物的生殖系統(tǒng)的毒性評(píng)價(jià)提供重要的評(píng)價(jià)依據(jù)。

背景技術(shù)：

藥物非臨床生殖毒性試驗(yàn)是研究藥物對(duì)雌雄生命生殖系統(tǒng)及其功能活動(dòng)毒副現(xiàn)象和作用機(jī)制的具體方法和技術(shù)。它包括對(duì)動(dòng)物的精卵形成、交配、排卵、射精、合子形成、著床、妊娠、分娩和哺乳過(guò)程，即從生殖細(xì)胞分化到整個(gè)細(xì)胞發(fā)育，從胚胎細(xì)胞發(fā)育到個(gè)體器官形成，從親體繁殖能力到后代生殖功能，其間涉及的親子代生殖系統(tǒng)器官結(jié)構(gòu)、生理和生化功能、遺傳和生殖特征，諸如此類方面的毒理學(xué)試驗(yàn)。

生殖系統(tǒng)除了包含在《藥物生殖毒性研究技術(shù)指導(dǎo)原則》所提及的睪丸、附睪外，其他組織如輸精管、陰莖、精囊腺、前列腺、提肛肌、提睪肌和肛門括約肌等雄性生殖器官。精子細(xì)胞發(fā)育過(guò)程也是藥物常常能夠影響機(jī)體的一部分，然而在長(zhǎng)期毒性試驗(yàn)中一般不會(huì)被重點(diǎn)檢查，甚至不檢查。由于生殖器官概念擴(kuò)大化，并且性器官的病理學(xué)檢查及精子細(xì)胞的發(fā)育，在某種意義上，也是評(píng)價(jià)藥物生殖發(fā)育毒性較為靈敏的指標(biāo)。

分析國(guó)內(nèi)外文獻(xiàn)資料中藥物致男性生殖系統(tǒng)損害的情況，探索藥物性 男性生殖系統(tǒng)損害的發(fā)生規(guī)律。方法：通過(guò)檢索PubMed、中國(guó)生物醫(yī)學(xué)文獻(xiàn)數(shù)據(jù)庫(kù)和中國(guó)醫(yī)院知識(shí)倉(cāng)庫(kù)期刊全文數(shù)據(jù)庫(kù)，獲得藥物性男性生殖系統(tǒng)損害病例，對(duì)檢索到的符合條件的藥物性男性生殖系統(tǒng)損害資料進(jìn)行計(jì)量統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。結(jié)果：共檢索出117例藥物性男性生殖系統(tǒng)損害病例報(bào)告，致男性生殖系統(tǒng)損害居前3位的藥物是心腦血管系統(tǒng)藥物、抗感染藥物和消化系統(tǒng)藥物，共占68.38％；藥物性男性生殖系統(tǒng)損害主要表現(xiàn)為性功能障礙、陰莖異常勃起、乳房發(fā)育和溢乳，共占60.68％。

精母細(xì)胞(spermatocyte)在睪丸的精子管內(nèi)的二倍體細(xì)胞，經(jīng)成熟分裂(減數(shù)分裂)形成單倍體精細(xì)胞。在精原細(xì)胞有絲分裂增殖過(guò)程中產(chǎn)生的某些能最終分化成成熟精子的細(xì)胞，分為初級(jí)精母細(xì)胞(Primary spermatocyte)和次級(jí)精母細(xì)胞(secondary spermatocyte)兩種。各種精母細(xì)胞又處于細(xì)胞周期的不同階段，因此在切片上可看到不同形態(tài)的精母細(xì)胞。

粗線期(pachytene stage)：是指在減數(shù)第一次分裂前期中緊接偶線期的時(shí)期。在這一時(shí)期，已完成染色體聯(lián)會(huì)的兩條同源染色體互相緊靠，進(jìn)而纏繞在一起，基質(zhì)開始附著到染色絲上，成為一條短而粗的染色體。結(jié)果在這時(shí)期后外觀上是染色體數(shù)目減半(即假減數(shù))。不久，這些緊靠著的一對(duì)染色體各自明顯地發(fā)生縱裂，各自由兩條染色單體構(gòu)成，成為四重結(jié)構(gòu)。在同源染色單體之間常常發(fā)生交叉。在經(jīng)過(guò)固定的分裂圖像中，這個(gè)時(shí)期是所謂染色粒最常出現(xiàn)的時(shí)期。在著絲粒處發(fā)生的部分異常凝縮也可在這時(shí)期見(jiàn)到。這一時(shí)期的染色體稱為粗線期(pachynema)。從這一時(shí)期到下一個(gè)雙線期，可以看到燈刷染色體，而且可以非常清楚地看到核仁。

細(xì)線期(leptotene stage)：減數(shù)分裂前期I的一個(gè)時(shí)期，又稱凝集期(condensation stage)。此期在光學(xué)顯微鏡下可逐漸見(jiàn)到染色體，染色質(zhì)在凝集前已復(fù)制，但仍呈單條細(xì)線狀，看不到成雙的染色體。但在電子顯微鏡下，可觀察到此期的染色體是由兩條染色單體構(gòu)成的。對(duì)玉米細(xì)胞的減數(shù)分裂的研究發(fā)現(xiàn)，玉米細(xì)線染色體的端粒開始是分布在整個(gè)細(xì)胞核中，在鄰近細(xì)線期結(jié)束時(shí)，端粒定位到核膜的內(nèi)側(cè)。由于很多細(xì)線染色體 的端粒與核膜結(jié)合，使染色體裝配成花束狀，所以細(xì)線期又稱花束期。此期核的體積增大，核仁也較大，推測(cè)與RNA、蛋白質(zhì)合成有關(guān)。

精子細(xì)胞(spermatid，ST)：次級(jí)精母細(xì)胞完成第二次減數(shù)分裂后即形成精子細(xì)胞。早期精子細(xì)胞核呈圓形，染色質(zhì)高度濃縮，胞質(zhì)電子密度也很高。整個(gè)細(xì)胞成為電子密度極高的均勻球體。精子細(xì)胞各自分開，位于一個(gè)單獨(dú)的小腔穴中發(fā)育。中期的精子細(xì)胞，胞質(zhì)中出現(xiàn)大小的高爾基囊泡，并在核的一端相互融合形成泡狀結(jié)構(gòu)，即頂體囊，頂體形成的演變過(guò)程。頂體在形成過(guò)程中，電子密度逐漸增大。其中蛋白質(zhì)水解酶逐漸在其中濃縮。頂體囊與核之間有明顯的膜界限。晚期的精子細(xì)胞，頂體囊中的蛋白水解酶進(jìn)一步沉積濃縮，電子密度增大。頂體囊也逐漸向前伸長(zhǎng)，形成棘狀突起。

現(xiàn)有的藥物非臨床研究中，涉及雄性動(dòng)物生殖系統(tǒng)毒性的研究包括長(zhǎng)期毒性研究，生殖毒性研究，以及體內(nèi)外的精母細(xì)胞的染色體畸變研究。長(zhǎng)期毒性研究中雄性動(dòng)物的生殖毒性研究?jī)H表現(xiàn)為對(duì)生殖器官的組織病理學(xué)檢查，針對(duì)睪丸的也僅有極少的睪丸切片，缺少對(duì)睪丸及附睪整體的對(duì)精子細(xì)胞的發(fā)育和成熟的毒性評(píng)價(jià)。而生殖毒性研究?jī)H研究雄性動(dòng)物的交配力和精子的活力，缺少對(duì)精子細(xì)胞產(chǎn)生過(guò)程的評(píng)價(jià)。體內(nèi)外的精母細(xì)胞的染色體畸變研究?jī)H對(duì)藥物對(duì)精子生成過(guò)程中對(duì)染色體復(fù)制等的評(píng)價(jià)。

常規(guī)的精母細(xì)胞的分類鑒定技術(shù)主要采用細(xì)胞核染色，觀察細(xì)胞核染色質(zhì)的形態(tài)，該種方法具有檢測(cè)準(zhǔn)確的技術(shù)優(yōu)點(diǎn)，但是缺點(diǎn)亦相當(dāng)明顯：精母細(xì)胞數(shù)量相當(dāng)龐大，人工對(duì)其分類，需要耗費(fèi)大量的人力物力進(jìn)行判定；耗時(shí)久且技術(shù)人員需要一定的知識(shí)水平及特定培訓(xùn)操作。

針對(duì)以上在生殖毒性毒性評(píng)價(jià)中的不足和技術(shù)缺陷，本發(fā)明為在藥物安全性評(píng)價(jià)中對(duì)雄性動(dòng)物生殖毒性評(píng)價(jià)的一種新的評(píng)價(jià)方法。利用長(zhǎng)期毒性研究中使用的睪丸切片，使用顯微圖像分析技術(shù)快速大量的測(cè)量精母細(xì)胞細(xì)胞核的周長(zhǎng)和面積，進(jìn)而推斷精母細(xì)胞的類型。該方法可代替人工進(jìn)行精母細(xì)胞分類，其判斷結(jié)果具有快速、準(zhǔn)確、節(jié)省人力物力的巨大優(yōu)勢(shì)。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

本發(fā)明為一種在雄性動(dòng)物生殖系統(tǒng)毒性中的評(píng)價(jià)方法。

本發(fā)明為利用顯微圖像分析系統(tǒng)對(duì)雄性動(dòng)物睪丸組織切片進(jìn)行分析，快速自動(dòng)化實(shí)現(xiàn)對(duì)精母細(xì)胞中細(xì)線期精母細(xì)胞、粗線期精母細(xì)胞及精子細(xì)胞的快速分類。

本發(fā)明所要解決的技術(shù)問(wèn)題在于先期準(zhǔn)確對(duì)精母細(xì)胞的不同時(shí)期的分類判斷。將已判斷的不同時(shí)期的精母細(xì)胞影像分類存放，并利用圖像分析系統(tǒng)測(cè)量細(xì)胞核的周長(zhǎng)和面積。確定了精母細(xì)胞中細(xì)線期精母細(xì)胞、粗線期精母細(xì)胞及精子細(xì)胞的細(xì)胞核面積及周長(zhǎng)標(biāo)準(zhǔn)數(shù)值，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)數(shù)值利用圖像分析系統(tǒng)自動(dòng)化實(shí)現(xiàn)對(duì)精母細(xì)胞中細(xì)線期精母細(xì)胞、粗線期精母細(xì)胞及精子細(xì)胞的快速分類。

附圖說(shuō)明

圖1是本發(fā)明是實(shí)驗(yàn)中細(xì)線期精母細(xì)胞細(xì)胞核面積分布圖；

圖2是本發(fā)明是實(shí)驗(yàn)中細(xì)線期精母細(xì)胞細(xì)胞核周長(zhǎng)分布圖；

圖3是本發(fā)明是實(shí)驗(yàn)中粗線期精母細(xì)胞細(xì)胞核面積分布圖；

圖4是本發(fā)明是實(shí)驗(yàn)中粗線期精母細(xì)胞細(xì)胞核周長(zhǎng)分布圖；

圖5是本發(fā)明是實(shí)驗(yàn)中精子細(xì)胞細(xì)胞核面積分布圖；

圖6是本發(fā)明是實(shí)驗(yàn)中精子細(xì)胞細(xì)胞核周長(zhǎng)分布圖。

具體實(shí)施方式

下面將結(jié)合實(shí)施例對(duì)本發(fā)明的實(shí)施方案進(jìn)行詳細(xì)描述，但是本領(lǐng)域技術(shù)人員將會(huì)理解，下列實(shí)施例僅用于說(shuō)明本發(fā)明，而不應(yīng)視為限定本發(fā)明的范圍。實(shí)施例中未注明具體條件這，按照常規(guī)條件或制造商建議的條件進(jìn)行。所用試劑或儀器未注明生產(chǎn)廠商者，均為可以通過(guò)市購(gòu)獲得的常規(guī)產(chǎn)品。

1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物：比格犬60只，體重范圍8-10kg，飼養(yǎng)條件：在普通環(huán)境動(dòng)物室中飼養(yǎng)，符合GB14925-2010國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)要求。

2 犬安樂(lè)處死，實(shí)驗(yàn)前按照30mg/kg體重肌肉注射30mg/ml的戊巴比妥鈉溶液，待犬處于深麻醉狀態(tài)后放血處死，取犬睪丸進(jìn)行固定染色。

3 染色試劑的配制

3.1 0.5％高碘酸氧化液

配方：高碘酸 0.5g

純凈水 定容至100mL

配法：將高碘酸加入適量的純凈水中，攪拌使溶解，然后加純凈水定容至100mL即可，此溶液置于冰箱內(nèi)冷藏保存。有效期為6個(gè)月。

3.2 0.5％偏重亞硫酸鈉液

配方：偏重亞硫酸鈉 0.5g

純凈水 定容至100mL

配法：將偏重亞硫酸鈉加入適量的純凈水中，攪拌使溶解，然后加純凈水定容至100mL即可。有效期為6個(gè)月。

3.3 Schiff液

配方：堿性品紅 1.0g

1mol/L鹽酸 20mL

偏重亞硫酸鈉 2.0g

純凈水 200mL

活性炭 2.0g

配法：先將純凈水煮沸，待溫度降至90℃，加入堿性品紅，攪拌均勻，再煮沸1min。待溫度降至50℃時(shí)過(guò)濾，然后緩慢加入鹽酸。降至25℃時(shí)加入偏重亞硫酸鈉，密封放置暗處過(guò)夜后，加入活性炭，搖勻后過(guò)濾，此時(shí)液體呈無(wú)色或淡黃色，放在棕色磨口瓶?jī)?nèi)，置于冰箱內(nèi)冷藏保存。有效期為6個(gè)月，如Schiff液變?yōu)榧t色即不能使用。

4 染色步驟

組織常規(guī)固定，采用10％中性緩沖福爾馬林

4.1 石蠟切片，常規(guī)脫蠟，用純凈水洗10s。

4.2 用0.5％高碘酸氧化液氧化10min～20min，用純凈水洗2次，每次10s。

4.3 用Schiff液密閉染色10min～20min。

4.4 用0.5％偏重亞硫酸鈉液滴洗2次，每次1min。

4.5 自來(lái)水沖洗2min。

4.6 用Harris蘇木精染液染細(xì)胞核2min～3min。

4.7 1％鹽酸乙醇分化1s，自來(lái)水沖洗返藍(lán)5min。

4.8 梯度乙醇脫水，TO透明劑I、II透明，中性樹膠或加拿大樹膠封片。

5 細(xì)胞核大小形態(tài)測(cè)量

采用顯微鏡型號(hào)：OLYMPUS BX3-CBH。

所用軟件：OLYMPUS自帶軟件cellSens Standard 1.7.1。

統(tǒng)計(jì)時(shí)使用的方法是：旋轉(zhuǎn)橢圓，兩點(diǎn)圓。

拍照時(shí)使用的倍數(shù)是1000倍。

6 結(jié)果

6.1 細(xì)線期

共檢測(cè)1102個(gè)細(xì)線期精母細(xì)胞，其細(xì)胞核平均面積48.56534±4.19138μm²，其95％可信限為40.18258～56.9481μm²。經(jīng)觀察1102個(gè)細(xì)線期精母細(xì)胞共有14個(gè)低于可信限，29個(gè)高于可信限，最低值30.28μm²，最高值65.35μm²。其細(xì)胞核平均周長(zhǎng)24.68043±1.06398μm，其95％可信限為22.55247～26.80839μm。經(jīng)觀察1102個(gè)細(xì)線期精母細(xì)胞共有14個(gè)低于可信限，29個(gè)高于可信限，最低值19.51μm，最高值28.66μm²。分布圖見(jiàn)圖1及圖2。

6.2 粗線期

共檢測(cè)1073個(gè)粗線期精母細(xì)胞，其細(xì)胞核平均面積18.00637±1.11821μm²，其95％可信限為15.76995～20.24279μm²。經(jīng)觀察1073個(gè)粗線期精母細(xì)胞共有32個(gè)低于可信限，16個(gè)高于可信限，最低值13.07μm²，最高值23.25μm²。其細(xì)胞核平均周長(zhǎng)15.03414±0.487038μm，其95％可信限為14.09338～16.008216μm。經(jīng)觀察1073個(gè)粗線期精母細(xì)胞共有32個(gè)低于可信限，16個(gè)高于可信限，最低值12.82μm，最高值17.09μm。分布圖見(jiàn)圖3及圖4。

6.3 精子細(xì)胞

共檢測(cè)1006個(gè)精子細(xì)胞，其細(xì)胞核平均面積5.95829±1.72775μm²，其95％可信限為2.50279～9.41379μm²。經(jīng)觀察1006個(gè)精子細(xì)胞共有0個(gè)低于可信限，35個(gè)高于可信限，最低值13.07μm²，最高值14.98μm²。其細(xì)胞核平均周長(zhǎng)8.56791±1.21269μm，其95％可信限為6.162538～10.99329μm。經(jīng)觀察1006個(gè)粗線期精母細(xì)胞共有0個(gè)低于可信限，35個(gè)高于可信限，最低值5.81μm，最高值13.72μm。分布圖見(jiàn)圖5及圖6。

6.4 比較分析

根據(jù)6.1-6.3項(xiàng)的測(cè)量結(jié)果總結(jié)至下表1，從下表可以看出3中類型的細(xì)胞核面積及周長(zhǎng)的均值及95％可信限均無(wú)交叉，從4.2及4.3項(xiàng)的測(cè)量結(jié)果來(lái)看個(gè)別精子細(xì)胞的細(xì)胞核面積及周長(zhǎng)的最大值與粗線期細(xì)胞的細(xì)胞核面積及周長(zhǎng)的最小值略有交叉，交叉數(shù)目較少且均屬于95％可信限范圍之外，可忽略不計(jì)。

表1不同類型的精母細(xì)胞細(xì)胞核面積及周長(zhǎng)

6.5 結(jié)論

根據(jù)6.1～6.4項(xiàng)的結(jié)果及分析，將粗線期細(xì)胞、細(xì)線期細(xì)胞及精子細(xì)胞的細(xì)胞核面積及周長(zhǎng)的95％可信限定位其參考范圍值。

表2不同類型的精母細(xì)胞細(xì)胞核面積及周長(zhǎng)參考范圍

6.6 結(jié)論驗(yàn)證

隨機(jī)選擇60只犬(未曾測(cè)量過(guò)的標(biāo)本)，通過(guò)計(jì)算機(jī)圖像處理系統(tǒng)測(cè)定細(xì)胞核面積及周長(zhǎng)，根據(jù)參考范圍判定其屬于細(xì)線期、粗線期及精子細(xì)胞類型。驗(yàn)證結(jié)果見(jiàn)下表3。

表3根據(jù)細(xì)胞核面積及細(xì)胞核周長(zhǎng)參考范圍的驗(yàn)證結(jié)果

根據(jù)6.6的驗(yàn)證結(jié)果證明本方法在粗線期及細(xì)線期的判定準(zhǔn)確率為100％，精子細(xì)胞的判斷準(zhǔn)確率為99.5％。該方法可代替人工進(jìn)行精母細(xì)胞分類，其判斷結(jié)果具有快速、準(zhǔn)確、節(jié)省人力物力的巨大優(yōu)勢(shì)。

根據(jù)以上的驗(yàn)證結(jié)果，本發(fā)明利用顯微圖像分析系統(tǒng)對(duì)雄性動(dòng)物睪丸組織切片進(jìn)行分析，快速自動(dòng)化實(shí)現(xiàn)對(duì)精母細(xì)胞中細(xì)線期精母細(xì)胞、粗線期精母細(xì)胞及精子細(xì)胞的快速分類。

本發(fā)明作為一種在雄性動(dòng)物生殖系統(tǒng)毒性中的評(píng)價(jià)方法具有快速準(zhǔn)確的判定藥物在雄性動(dòng)物的精母細(xì)胞的發(fā)育過(guò)程中的影響。可彌補(bǔ)當(dāng)前在雄性動(dòng)物生殖系統(tǒng)毒性評(píng)價(jià)方面的缺陷與不足。