一種L-鳥氨酸的分離純化方法技術(shù)領(lǐng)域本發(fā)明涉及一種L-鳥氨酸的分離純化方法，屬于生物技術(shù)領(lǐng)域。

背景技術(shù)：
鳥氨酸是1877年，杰弗在喂養(yǎng)安息香酸的鳥類尿液的水解產(chǎn)物中發(fā)現(xiàn)的，因此得名。它是細(xì)菌細(xì)胞膜和多肽類抗生素的組成成分，可以作為氨基酸輸液原料。能促進(jìn)生長激素的分泌，以協(xié)助機(jī)體代謝過多的脂肪，與精氨酸配合使用具有很好的減肥效果。在動物體內(nèi)主要參與尿酸循環(huán)，對于體內(nèi)氨態(tài)氮的排出有重要作用。鳥氨酸是維持免疫系統(tǒng)和肝功正常不可缺少的，能解毒氨及幫助肝再生，除在醫(yī)藥上作為試劑與注射液外，還通常與精氨酸一起用作保肝、強(qiáng)身、解毒劑之類藥劑的原料。在皮膚和結(jié)締組織中含有高濃度的鳥氨酸對于愈合和修復(fù)損傷組織非常有益。鳥氨酸是由體內(nèi)的精氨酸合成的，反過來，它又是瓜氨酸、脯氨酸和谷氨酸的前體。鳥氨酸能將氨轉(zhuǎn)化為尿素與谷氨酰氨，因此補(bǔ)充鳥氨酸可為解毒途徑提供酶的作用物。當(dāng)身體制造尿素，精氨酸便會被新陳代謝掉，身體轉(zhuǎn)為制造鳥氨酸。用動物做的實(shí)驗(yàn)證明鳥氨酸和精氨酸能令身體生產(chǎn)更多合成代謝的、促進(jìn)生長的荷爾蒙，包括胰島素和生長荷爾蒙，來促進(jìn)肌肉生長。此外，鳥氨酸還用于配制恢復(fù)疲勞的發(fā)泡飲料。在生物體內(nèi)，鳥氨酸能在尿素循環(huán)(Krebs.Henseleit循環(huán))中起作用。尿素循環(huán)分為4步，能夠?qū)⑸矬w內(nèi)天冬氨酸以及氨中的氮元素轉(zhuǎn)化為尿素，因而是生物體內(nèi)的主要排氨方式。動物利用新陳代謝將體內(nèi)多余的氮元素轉(zhuǎn)化為尿素的主要器官是肝臟，體內(nèi)的精氨酸在精氨酸酶的催化作用下水解，產(chǎn)生尿素和鳥氨酸。精氨酸水解后產(chǎn)生的鳥氨酸，將會與氨甲酰磷酸反應(yīng)，進(jìn)而產(chǎn)生瓜氨酸，瓜氨酸會進(jìn)一步與天冬氨酸反應(yīng)而生成精氨基琥珀酸，精氨基琥珀酸最終會在酶的催化作用下進(jìn)一步被分解為延胡索酸以及精氨酸等產(chǎn)物。由于該反應(yīng)的第一步是將精氨酸轉(zhuǎn)化為尿素，反應(yīng)到最后又生成了精氨酸，周而復(fù)始，所以該反應(yīng)稱為尿素循環(huán)。由于目前全世界氨基酸產(chǎn)業(yè)的迅速發(fā)展，各地的科學(xué)家逐漸認(rèn)識到了L-鳥氨酸的多種生物功能，其中日本最為突出，他們在20世紀(jì)40年代就開始對L-鳥氨酸有所研究，在10-20年后就有許多文章發(fā)表，且多數(shù)是以專利的形式發(fā)表的。其中包括鳥氨酸生產(chǎn)菌株、鳥氨酸高產(chǎn)菌株的選育、鳥氨酸的定量分析以及發(fā)酵法生產(chǎn)-鳥氨酸的發(fā)酵條件優(yōu)化等，并且以專利文獻(xiàn)的形式發(fā)表。但是此期間在國內(nèi)卻很少聽到對于-鳥氨酸的研究。直至1998年至2000年間，才報(bào)道有張克旭、潘韻和陳寧等人曾做過關(guān)于L-鳥氨酸的菌種篩選和發(fā)酵方面的研究，有幾篇論文發(fā)表。與國外的研究相比，我國L-鳥氨酸產(chǎn)業(yè)還處于起步階段，所研究的面很窄，而且研究進(jìn)展較慢，目前僅發(fā)展到搖瓶試驗(yàn)階段，要進(jìn)行工業(yè)化生產(chǎn)還需要我們進(jìn)行大量的試驗(yàn)和研究。和國外相比，我國對鳥氨酸的研究有很大的差距，研究面窄，進(jìn)展不大，僅限于搖瓶試驗(yàn)，離工業(yè)化生產(chǎn)還有很長的路要走。鳥氨酸是精氨酸的衍生物，在醫(yī)藥、保健、食品和化工等領(lǐng)域具有廣泛用途，市場需求逐年增長，國內(nèi)外尚無大規(guī)模生產(chǎn)的報(bào)道。鳥氨酸生產(chǎn)方法主要有化學(xué)法、微生物發(fā)酵法和酶轉(zhuǎn)化法。化學(xué)法工藝繁雜，環(huán)境污染嚴(yán)重，副產(chǎn)物多且不易分離；微生物發(fā)酵法由于缺乏性能優(yōu)良的生產(chǎn)菌株和生產(chǎn)工藝的系統(tǒng)研究，限制了該方法的發(fā)展和應(yīng)用。酶轉(zhuǎn)化法是精氨酸在精氨酸酶的專一作用下生成鳥氨酸，產(chǎn)品純度高，是最具開發(fā)潛力的鳥氨酸生產(chǎn)方法，優(yōu)質(zhì)廉價(jià)的精氨酸原料和轉(zhuǎn)化酶的獲得是該方法的關(guān)鍵。鳥氨酸的生產(chǎn)方法有4種：發(fā)酵法：酶法；化學(xué)合成法和蛋白質(zhì)水解提取法。(1)發(fā)酵法發(fā)酵法是借助微生物具有合成自身所需氨基酸的能力，通過對菌株的質(zhì)誘變等處理，選育出各種營養(yǎng)缺陷型及氨基酸結(jié)構(gòu)類似物抗性變異株，以解除代謝調(diào)節(jié)中的反饋抑制與阻遏，達(dá)到過量合成某種氨基酸的目的。發(fā)酵法包括直接發(fā)酵法和添加前體發(fā)酵法。氨基酸產(chǎn)生菌是實(shí)現(xiàn)發(fā)酵法生產(chǎn)氨基酸的前提，在氨基酸發(fā)酵的建立和改進(jìn)中起著非常重要的作用。根據(jù)氨基酸產(chǎn)生菌的遺傳性狀，可將其分為四類：第一類為直接使用野生型菌株由糖和銨鹽發(fā)酵生產(chǎn)氨基酸，如谷氨酸；第二類為營養(yǎng)缺陷型變異株；第三類為氨基酸結(jié)構(gòu)類似物抗性變異株；第四類為營養(yǎng)缺陷型(或滲漏型)兼結(jié)構(gòu)類似物抗件變異株。應(yīng)用發(fā)酵法生產(chǎn)鳥氨酸因產(chǎn)酸水平較低實(shí)用價(jià)值不大。發(fā)酵法主要是利用精氨酸(Arg-)或瓜氨酸(Cit-)的營養(yǎng)缺陷型突變株來積累鳥氨酸。Takayasu等在營養(yǎng)缺陷型菌株的基礎(chǔ)上篩選到具有霉酚酸抗性的突變株，最高產(chǎn)量可達(dá)50g/L；李環(huán)等利用混合菌種發(fā)酵生產(chǎn)鳥氨酸，產(chǎn)量達(dá)40g/L左右。發(fā)酵法原料成本低廉，但是發(fā)酵液中成分復(fù)雜，后續(xù)分離困難。(2)化學(xué)合成法化學(xué)法制備鳥氨酸根據(jù)化學(xué)反應(yīng)機(jī)理可分為有機(jī)合成法和精氨酸水解法兩種。該法采用基礎(chǔ)化工原料合成鳥氨酸，原料來源廣泛且成本低。然而該法經(jīng)過多步化學(xué)反應(yīng)合成，收率偏低；其原料中的氰化氫為劇毒致癌物，在工業(yè)生產(chǎn)中應(yīng)盡量避免使用?；瘜W(xué)法合成出的鳥氨酸為DL型混合物，產(chǎn)物的手性拆分亦給該工藝增加了難度和成本，這些方面都成為該法的主要缺陷所在?；瘜W(xué)法是利用弱堿水解精氨酸得到鳥氨酸和少量瓜氨酸?；瘜W(xué)法生產(chǎn)鳥氨酸產(chǎn)物為DL-型外消旋體，分離困難，生產(chǎn)過程不易控制，現(xiàn)已被淘汰。(3)蛋白質(zhì)水解提取法以毛發(fā)、血粉及廢蠶絲等蛋白質(zhì)為原料，通過酸、堿或酶水解成多種氨基酸混合物，經(jīng)分離純化獲得各種氨基酸的方法稱為水解法。隨著氨基酸生產(chǎn)技術(shù)的進(jìn)步。由蛋白質(zhì)水解法提取氨基酸這一古老的生產(chǎn)方法受到很大的沖擊，傳統(tǒng)的水解法生產(chǎn)谷氨酸已失去其存在的價(jià)值。(4)酶法酶法生產(chǎn)鳥氨酸就是利用動植物或微生物體內(nèi)的精氨酸酶作催化劑，水解精氨酸，生成鳥氨酸和尿素；酶法生產(chǎn)氨基酸具有工藝簡單、周期短、耗能低、專一性強(qiáng)、收率高等特點(diǎn)。L-精氨酸酶廣泛存在于動物的肝臟、植物、酵母和細(xì)菌中傳統(tǒng)的酶法制備鳥氨酸方法，采用以牛肝為酶源，從牛肝中提取L-精氨酸酶，以成品精氨酸為合成底物轉(zhuǎn)化鳥氨酸。酶法生產(chǎn)鳥氨酸專一性強(qiáng)，反應(yīng)條件溫和，避免采用氰化氫等有毒化學(xué)品，同時(shí)底物轉(zhuǎn)化率高，產(chǎn)品較純，有利于后續(xù)分離，但是精氨酸酶的來源不易，底物精氨酸的成本也較高。如何獲得廉價(jià)的合成底物和酶源是這一方法能否成功應(yīng)用的關(guān)鍵。本技術(shù)采用發(fā)酵法生產(chǎn)的精氨酸純化液為原料，采用假單胞菌產(chǎn)生的精氨酸酶轉(zhuǎn)化生產(chǎn)鳥氨酸，原料易得，酶成本低廉，結(jié)合固定化酶技術(shù)，可節(jié)約鳥氨酸生產(chǎn)成本，制造出高質(zhì)量的產(chǎn)品。申請人多年來致力于發(fā)酵法生產(chǎn)精氨酸及其衍生物關(guān)鍵技術(shù)的研究，擁有年產(chǎn)500噸的精氨酸生產(chǎn)線。鑒于國內(nèi)外市場需求強(qiáng)勁的現(xiàn)狀，申請人對鳥氨酸高效生物制造技術(shù)及產(chǎn)業(yè)化進(jìn)行研究，創(chuàng)造性的提出了微生物酶法生產(chǎn)鳥氨。依托現(xiàn)有精氨酸技術(shù)和原料優(yōu)勢，選育了生產(chǎn)鳥氨酸的精氨酸酶的高效菌株，以精氨酸為原料通過酶轉(zhuǎn)化獲得鳥氨酸。本發(fā)明產(chǎn)品純度高易分離，同時(shí)克服了原料和酶昂貴不易獲取的劣勢，具有規(guī)?；a(chǎn)的前景。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：
本發(fā)明的目的在于提供一株產(chǎn)精氨酸酶的菌株MQO-154，本發(fā)明經(jīng)過對蘇云金芽孢桿菌(土壤分離)進(jìn)行紫外誘變和化學(xué)誘變，篩選到一株精氨酸酶活性較高的菌株，經(jīng)分離純化后獲得菌株MQO-154，其保藏編號為：CGMCCNo.10728；保藏單位為：中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心；保藏日期為：2015年4月21日；保藏地址為：北京市朝陽區(qū)北辰西路1號院3號。菌株MQO-154的生物特性為：該菌株在斜面培養(yǎng)基上培養(yǎng)24h，成乳白色菌落，濕潤，表面無光澤，菌苔厚且不透明，菌落較大，邊緣不規(guī)則菌體呈桿狀，細(xì)胞長約3-4μm，直徑1-2μm，具有內(nèi)生芽孢，不能運(yùn)動，好氧或兼性厭氧。菌株MQO-154的分類命名為蘇云金芽孢桿菌(Bacillusthuringensis)。利用菌株MQO-154制備精氨酸酶的方法，步驟如下：(1)斜面培養(yǎng)：將菌株MQO-154在無菌條件下接種到斜面培養(yǎng)基上進(jìn)行培養(yǎng)，培養(yǎng)溫度為33℃，培養(yǎng)時(shí)間為24h；斜面培養(yǎng)基：葡萄糖25g，魚蛋白胨15g，KH2PO40.6g，MgSO4·7H2O0.5g，K2HPO41.5g，瓊脂16g，加純凈水至1L，用NaOH調(diào)pH至為7.0，滅菌溫度115℃，15min。(2)種子擴(kuò)大培養(yǎng)：從步驟(1)的斜面培養(yǎng)基上挑取菌落，加水稀釋獲得菌體溶液，稀釋后的濃度為3×105-5×105個/mL，將菌體溶液接種到種子培養(yǎng)基上進(jìn)行擴(kuò)大培養(yǎng)，接種量為10％(v/v)，擴(kuò)大培養(yǎng)的溫度為30℃，培養(yǎng)時(shí)間為24h，0-10h，搖床轉(zhuǎn)速100r/min，10-20h，搖床轉(zhuǎn)速120r/min，20-24h，搖床轉(zhuǎn)速100r/min。種子培養(yǎng)基：葡萄糖25g，乙酸銨9g，KH2P040.59g，K2HPO41.5g，MgSO4·7H200.5g，F(xiàn)eSO40.05g，MnSO40.05g，VB1HCl0.005g，瓊脂16g，加純凈水至1L，用NaOH調(diào)pH至7.0，滅菌溫度115℃，15min。(3)發(fā)酵培養(yǎng)：將擴(kuò)大培養(yǎng)后的菌體接種到發(fā)酵液體培養(yǎng)基中，接種量為10％(v/v)，接種時(shí)菌體溶液的濃度為3×105-5×105個/mL，于30℃，170r/min的搖床上發(fā)酵24h，得到含精氨酸激酶的發(fā)酵培養(yǎng)液；發(fā)酵培養(yǎng)基：葡萄糖25g，魚蛋白胨15g，玉米漿10g，酵母膏1g，KH2PO40.5g，MgSO4·7H2O0.5g，F(xiàn)eSO40.05g，MnSO40.05g，VB1HCl0.005g，用自來水配成1L溶液，用NaOH調(diào)pH至7.0，滅菌溫度121℃，滅菌時(shí)間20min。(4)30L發(fā)酵罐培養(yǎng)：將步驟(3)中發(fā)酵培養(yǎng)后的發(fā)酵液接種到30L發(fā)酵罐的培養(yǎng)基中，接種量為10％(v/v)，接種時(shí)菌體溶液的濃度為3×105-5×105個/mL，控制罐壓強(qiáng)為0.05MPa，在33℃條件下培養(yǎng)28小時(shí)，攪拌轉(zhuǎn)速為600-800rpm，風(fēng)量為1：0.8，控制溶氧量為30-40％，全程用無菌飽和氨水控制pH為6.7-7.0，中途補(bǔ)糖控制殘?zhí)菫?％，放罐殘?zhí)菫?％，發(fā)酵后得含有精氨酸酶的菌體。本發(fā)明利用精氨酸酶，以精氨酸純化液為原料制備L-鳥氨酸，步驟如下：(1)轉(zhuǎn)化底物的獲得：將精氨酸陶瓷膜過濾液經(jīng)711氨型樹脂吸附，用2.0N氨水洗脫，得到精氨酸陽柱純化液(2)將含有精氨酸酶的菌體,用生理鹽水洗滌1次,離心后收集菌體。將菌體轉(zhuǎn)移到轉(zhuǎn)化液中，轉(zhuǎn)化液包括0.3mol/L碳酸鹽緩沖液(Na2CO4與NaHCO4體積比為7:3)和0.1mg/ml的Mn2+，加入5％的L-精氨酸純化液,反應(yīng)24h(30℃，200r/min)；轉(zhuǎn)化率可達(dá)98％。(3)分離純化：離子交換：將轉(zhuǎn)化液經(jīng)氨型732樹脂吸附后用水反洗樹脂至流出液清澈，用1.0N氨水洗脫，洗脫液再過流D335-OH型樹脂除去陰離子雜質(zhì)得到鳥氨酸純化液，收率達(dá)到95％；納濾：采用800分子量納濾膜過濾鳥氨酸純化液得到鳥氨酸納濾清液，用3倍濃縮液體積的去離子水分3次清洗濃縮液(納濾清液)后，棄去濃縮液，收集含L-鳥氨酸產(chǎn)品的納濾透析液，，收率達(dá)到98％；調(diào)pH、脫色：用鹽酸調(diào)節(jié)鳥氨酸納濾清液的pH至4.5，用活性炭進(jìn)行脫色，活性炭的用量為鳥氨酸納濾清液的0.5％(質(zhì)量分?jǐn)?shù))，脫色溫度為50℃，脫色時(shí)間為30min，用0.22μm濾膜過濾得脫色液，脫色液透光率≥99％，收率達(dá)到99％；反滲透濃縮：將鳥氨酸脫色液經(jīng)反滲透膜濃縮至原體積一半得到鳥氨酸脫氨后的預(yù)濃縮液，收率達(dá)到99％；濃縮結(jié)晶：將預(yù)濃縮液在真空度≥0.095，蒸發(fā)溫度50℃條件下濃縮至濃縮度含量≥80％的濃縮液，將濃縮液放至5℃冰箱保溫2h得到鳥氨酸結(jié)晶；鳥氨酸鹽酸鹽的獲得：將結(jié)晶的鳥氨酸經(jīng)抽濾后用無水乙醇洗滌3次得到鳥氨酸鹽酸鹽濕品，收率達(dá)到85％；干燥：將鳥氨酸鹽酸鹽濕品放入55℃真空干燥箱在≥-0.098真空度下干燥6h得到鳥氨酸鹽酸鹽成品。本發(fā)明與現(xiàn)有技術(shù)相比具有以下優(yōu)點(diǎn)：(1)篩選到了一株MQO-154，解決了酶轉(zhuǎn)化工藝酶來源和酶成本高的限制；(2)利用精氨酸酶，以精氨酸純化液為原料制備L-鳥氨酸，產(chǎn)品純度高，易分離，產(chǎn)成品成本低；(3)采用膜分離、納濾脫色、膜濃縮等先進(jìn)處理工藝節(jié)省了能耗，節(jié)省了活性炭的用量，減少了對環(huán)境的污染，降低了生產(chǎn)成本，提高了產(chǎn)品質(zhì)量。具體實(shí)施方式下面結(jié)合具體實(shí)施例來進(jìn)一步描述本發(fā)明，本發(fā)明的優(yōu)點(diǎn)和特點(diǎn)將會隨著描述而更為清楚。但實(shí)施例僅是范例性的，并不對本發(fā)明的范圍構(gòu)成任何限制。本領(lǐng)域技術(shù)人員應(yīng)該理解的是，在不偏離本發(fā)明的精神和范圍下可以對本發(fā)明技術(shù)方案的細(xì)節(jié)和形式進(jìn)行修改或替換，但這些修改和替換均落入本發(fā)明的保護(hù)范圍內(nèi)。實(shí)施例1一株產(chǎn)精氨酸酶的菌株MQO-154，本發(fā)明經(jīng)過對蘇云金芽孢桿菌進(jìn)行紫外誘變和化學(xué)誘變，篩選到一株酶活性較高的菌株，經(jīng)分離純化后獲得菌株MQO-154，其保藏編號為：CGMCCNo.10728；保藏單位為：中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心；保藏日期為：2015年4月21日；保藏地址為：北京市朝陽區(qū)北辰西路1號院3號。菌株MQO-154的生物特性為：菌株MQO-154接種到斜面培養(yǎng)基上進(jìn)行培養(yǎng)24h，成乳白色菌落，濕潤，表面無光澤，菌苔厚且不透明，菌落較大，邊緣不規(guī)則菌體呈桿狀，細(xì)胞長約3-4μm，直徑1-2μm，具有內(nèi)生芽孢，不能運(yùn)動，好氧或兼性厭氧。實(shí)施例2利用菌株MQO-154制備精氨酸酶的方法，步驟如下：(1)斜面培養(yǎng)：將菌株MQO-154在無菌條件下接種到斜面培養(yǎng)基上進(jìn)行培養(yǎng)，培養(yǎng)溫度為33℃，培養(yǎng)時(shí)間為24h；斜面培養(yǎng)基：葡萄糖25g，魚蛋白胨15g，KH2PO40.6g，MgSO4·7H200.5g，K2HPO41.5g，瓊脂16g，加純凈水至1L，用NaOH調(diào)pH至為7.0，滅菌溫度115℃，15min。(2)種子擴(kuò)大培養(yǎng)：從步驟(1)的斜面培養(yǎng)基上挑取菌落，加水稀釋獲得菌體溶液，稀釋后的濃度為3×105-5×105個/mL，將菌體溶液接種到種子培養(yǎng)基上進(jìn)行擴(kuò)大培養(yǎng)，接種量為10％(v/v)，擴(kuò)大培養(yǎng)的溫度為30℃，培養(yǎng)時(shí)間為24h，0-10h，搖床轉(zhuǎn)速100r/min，10-20h，搖床轉(zhuǎn)速120r/min，20-24h，搖床轉(zhuǎn)速100r/min。種子培養(yǎng)基：葡萄糖25g，乙酸銨9g，KH2PO40.59g，K2HPO41.5g，MgSO4·7H200.5g，F(xiàn)eSO40.05g，MnSO40.05g，VB1HCl0.005g，瓊脂16g，加純凈水至1L，用NaOH調(diào)pH至7.0，滅菌溫度115℃，15min。(3)發(fā)酵培養(yǎng)：將擴(kuò)大培養(yǎng)后的菌體接種到發(fā)酵液體培養(yǎng)基中，接種量為10％(v/v)，接種時(shí)菌體溶液的濃度為3×105-5×105個/mL，于30℃，170r/min的搖床上發(fā)酵24h，得到含精氨酸激酶的發(fā)酵培養(yǎng)液；發(fā)酵培養(yǎng)基：葡萄糖25g，魚蛋白胨15g，玉米漿10g，酵母膏1g，KH2PO40.5g，MgSO4·7H2O0.5g，F(xiàn)eSO40.05g，MnSO40.05g，VB1HCl0.005g，用自來水配成1L溶液，用NaOH調(diào)pH至7.0，滅菌溫度121℃，滅菌時(shí)間20min。(4)30L發(fā)酵罐培養(yǎng)：將步驟(3)中發(fā)酵培養(yǎng)后的發(fā)酵液接種到30L發(fā)酵罐的培養(yǎng)基中，接種量為10％(v/v)，接種時(shí)菌體溶液的濃度為3×105-5×105個/mL，控制罐壓強(qiáng)為0.05MPa，在35℃條件下培養(yǎng)28小時(shí)，攪拌轉(zhuǎn)速為600-800rpm，風(fēng)量為1：0.8，控制溶氧量為30-40％，全程用無菌飽和氨水控制pH為6.7-7.0，中途補(bǔ)糖控制殘?zhí)菫?％，放罐殘?zhí)菫?％，發(fā)酵后得含有精氨酸酶的菌體。實(shí)施例3本發(fā)明利用精氨酸酶，以精氨酸純化液為原料制備L-鳥氨酸，步驟如下：(1)底物的獲得：將精氨酸陶瓷膜過濾液經(jīng)711氨型樹脂吸附，用2.0N氨水洗脫，得到精氨酸陽柱純化液；(2)轉(zhuǎn)化培養(yǎng)：將含有精氨酸酶的菌體,用生理鹽水洗滌1次,離心后收集菌體。將菌體轉(zhuǎn)移到轉(zhuǎn)化液中，轉(zhuǎn)化液包括0.3mol/L碳酸鹽緩沖液(Na2CO4與NaHCO4體積比為7:3)和0.1mg/ml的Mn2+，加入5％的L-精氨酸純化液,反應(yīng)24h(30℃，200r/min)；轉(zhuǎn)化率可達(dá)98％。實(shí)施例4本發(fā)明制備的L-鳥氨酸的分離純化(1)離子交換：將實(shí)施例3獲得的L-鳥氨酸轉(zhuǎn)化液經(jīng)氨型732樹脂吸附后用水反洗樹脂至流出液清澈，用1.0N氨水洗脫，洗脫液再過流D335-OH型樹脂除去陰離子雜質(zhì)得到鳥氨酸純化液，收率達(dá)到95％；(2)納濾：采用800分子量納濾膜過濾鳥氨酸純化液得到鳥氨酸納濾清液，用3倍濃縮液體積的去離子水分3次清洗濃縮液(納濾清液)后，棄去濃縮液，收集含L-鳥氨酸產(chǎn)品的納濾透析液，，收率達(dá)到98％；(3)調(diào)pH、脫色：用鹽酸調(diào)節(jié)鳥氨酸納濾清液的pH至4.5，用活性炭進(jìn)行脫色，活性炭的用量為鳥氨酸納濾清液的0.5％(質(zhì)量分?jǐn)?shù))，脫色溫度為50℃，脫色時(shí)間為30min，用0.22μm濾膜過濾得脫色液，脫色液透光率≥99％，收率達(dá)到99％；(4)反滲透濃縮：將鳥氨酸脫色液經(jīng)反滲透膜濃縮至原體積一半得到鳥氨酸脫氨后的預(yù)濃縮液，收率達(dá)到99％；(5)濃縮結(jié)晶：將預(yù)濃縮液在真空度≥0.095，蒸發(fā)溫度50℃條件下濃縮至濃縮度含量≥80％的濃縮液，將濃縮液放至5℃冰箱保溫2h得到鳥氨酸結(jié)晶。試驗(yàn)例1本發(fā)明中轉(zhuǎn)化條件的確定(1)pH值的確定，當(dāng)其它條件不變，反應(yīng)pH為9.0-10.0時(shí)，精氨酸完全反應(yīng)，pH為10.0時(shí)精氨酸摩爾轉(zhuǎn)化率明顯提高。(2)轉(zhuǎn)化時(shí)間的確定，當(dāng)其它條件不變，反應(yīng)為10h時(shí)坂口實(shí)驗(yàn)顏色為深玫瑰紅色，表明尚有大量的L-精氨酸鹽酸鹽，反應(yīng)不完全；隨著反應(yīng)時(shí)間的延長，坂口實(shí)驗(yàn)顏色在變淺，15h時(shí)L-精氨酸鹽酸鹽已經(jīng)反應(yīng)完全，但還沒有完全轉(zhuǎn)化為L-鳥氨酸，產(chǎn)率仍然很低；24h時(shí)坂口實(shí)驗(yàn)已經(jīng)檢驗(yàn)不出L-精氨酸鹽酸鹽的存在，且產(chǎn)率很高。然而隨著時(shí)間的進(jìn)一步延長，L-鳥氨酸的產(chǎn)率沒有發(fā)生明顯變化，說明24h時(shí)反應(yīng)已經(jīng)完全，因此24h是較佳反應(yīng)時(shí)間。(3)反應(yīng)溫度的確定，當(dāng)其它條件不變，反應(yīng)溫度為36℃時(shí)，產(chǎn)率最高，說明36℃能使L-精氨酸酶的催化活性最好地發(fā)揮。(4)不同底物濃度的確定，當(dāng)初始底物精氨酸濃度為5％時(shí)，經(jīng)過24h左右的轉(zhuǎn)化精氨酸摩爾轉(zhuǎn)化率仍然可以保持在一個比較高的水平；但當(dāng)初始底物精氨酸的濃度達(dá)到7％和10％的時(shí)候，初始精氨酸濃度為5％的轉(zhuǎn)化液，其轉(zhuǎn)化液中產(chǎn)物鳥氨酸的濃度僅有很小的提高。通過上述系列實(shí)驗(yàn)得出精氨酸酶轉(zhuǎn)化鳥氨酸最佳酶轉(zhuǎn)化條件如下：反應(yīng)pH為9.5，反應(yīng)溫度36℃，反應(yīng)時(shí)間24h，底物精氨酸濃度5％。試驗(yàn)例2本發(fā)明中鳥氨酸濃度、精氨酸摩爾轉(zhuǎn)化率的測定(1)鳥氨酸濃度的測定鳥氨酸和茚三酮在pH為11的條件下能反應(yīng)生成紅色物質(zhì)，該物質(zhì)在515nm處有最大光吸收，通過配制不同已知濃度的鳥氨酸與酸性茚三酮反應(yīng)，測定其515nm處的吸光值繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。由標(biāo)準(zhǔn)曲線可計(jì)算鳥氨酸濃度(mol/mL)。(2)精氨酸摩爾轉(zhuǎn)化率的測定將菌體接種到50mL液體培養(yǎng)基中于33℃培養(yǎng)24h。培養(yǎng)好的發(fā)酵液4℃下4000r/min離心30min，棄去上清液。將菌體轉(zhuǎn)移至10mL碳酸鹽緩沖液中，加入0.15g精氨酸，在30℃下轉(zhuǎn)化24h。6000r/min離心10min，測定上清液中的鳥氨酸濃度，并計(jì)算底物精氨酸的摩爾轉(zhuǎn)化率y，以此表示精氨酸酶的活力。本發(fā)明測得精氨酸摩爾轉(zhuǎn)化率為98％。y＝nA/nB其中nA為轉(zhuǎn)化液中鳥氨酸的物質(zhì)的量(mol)；nB為轉(zhuǎn)化液中原始的精氨酸的物質(zhì)的量(mol)。試驗(yàn)例4本發(fā)明中獲得的鳥氨酸鹽酸鹽的檢驗(yàn)中試產(chǎn)品經(jīng)青島譜尼測試有限公司的第三方檢驗(yàn)，各項(xiàng)指標(biāo)符合美國聯(lián)邦通訊委員會，L-鳥氨酸鹽酸鹽USP標(biāo)準(zhǔn)，主要性能指標(biāo)見表1所示：表1