本發(fā)明涉及由血漿microRNA組成的II、III期胃癌復(fù)發(fā)標(biāo)志物以及復(fù)發(fā)預(yù)測(cè)方法。

背景技術(shù)：

胃癌是世界上最常見的惡性腫瘤之一，其發(fā)病率位居所有惡性腫瘤的第四位，病死率位居第二位。2008年，全球新增胃癌病例達(dá)98.9萬(wàn)，死亡病例達(dá)73.8萬(wàn)(A Jemal,et al.(2011)CA:a cancerjournal for clinicians 61,69-90)。盡管其全球發(fā)病率有逐年下降的趨勢(shì)，但亞洲地區(qū)仍然為胃癌的高發(fā)區(qū)。我國(guó)是胃癌的高發(fā)國(guó)家之一，發(fā)病數(shù)占全球42％(CF Bosman FT,Hruban RH,Theise ND..(2010))。胃癌病情隱匿，多數(shù)患者早期無(wú)特異性癥狀，限制了胃癌的早期發(fā)現(xiàn)，使大多數(shù)患者就診時(shí)已屬于晚期。

胃癌的治療主要以采取外科手術(shù)切除為主的綜合治療手段(Y Shi,et al.(2010)Journal of surgical oncology 101,687-692)，傳統(tǒng)的治療，包括手術(shù)、放療以及化療在早期胃癌的治療上取得了一定進(jìn)展，但對(duì)于診斷時(shí)已處于進(jìn)展期、伴有深度浸潤(rùn)或淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的胃癌患者，即使根治性切除術(shù)，仍有多數(shù)在術(shù)后發(fā)生復(fù)發(fā)或轉(zhuǎn)移，而復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移后患者的生存時(shí)間較少超過一年，成為限制胃癌術(shù)后生存率的最關(guān)鍵因素。術(shù)后輔助放化療針對(duì)的是手術(shù)不能完全清除的微轉(zhuǎn)移灶，但若對(duì)所有的病人均進(jìn)行術(shù)后輔助治療，不但帶來(lái)沉重的社會(huì)經(jīng)濟(jì)負(fù)擔(dān)，也使很多病人生存質(zhì)量降低。只有有效區(qū)分將高復(fù)發(fā)風(fēng)險(xiǎn)與低復(fù)發(fā)風(fēng)險(xiǎn)的病人，實(shí)施個(gè)體化治療，對(duì)高復(fù)發(fā)風(fēng)險(xiǎn)的病人加強(qiáng)術(shù)后輔助治療，對(duì)于低風(fēng)險(xiǎn)患者減少過度治療而不增加復(fù)發(fā)風(fēng)險(xiǎn)，才能有效降低術(shù)后復(fù)發(fā)率，提高患者生存質(zhì)量。

然而，胃癌是一種高度異質(zhì)性的疾病，有相似的臨床特征的患者往往臨床結(jié)局差異很大。目前傳統(tǒng)的TNM分期系統(tǒng)在預(yù)測(cè)胃癌患者，尤其是II期和III期患者的復(fù)發(fā)及預(yù)后方面已經(jīng)表現(xiàn)出明顯的局限性，大約一半的II期患者術(shù)后三年會(huì)發(fā)生復(fù)發(fā)，而仍有約三分之一的患者術(shù)后三年不會(huì)復(fù)發(fā)。根據(jù)傳統(tǒng)的治療方案，一部分早期患者可能能夠從術(shù)后輔助化療中獲益，而相反，有些低復(fù)發(fā)風(fēng)險(xiǎn)的進(jìn)展期患者可能接受了原本不必要的輔 助化療，并為此接受化療的毒性和風(fēng)險(xiǎn)帶來(lái)的生活質(zhì)量下降。因此，探索胃癌預(yù)測(cè)術(shù)后復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移的新的標(biāo)志物，區(qū)分出高復(fù)發(fā)風(fēng)險(xiǎn)的患者對(duì)于提供更有效、個(gè)體化的胃癌術(shù)后治療十分必要。

microRNA是一類廣泛存在于生物體內(nèi)，序列長(zhǎng)度為19-25個(gè)不編碼蛋白質(zhì)的單鏈核苷酸。成熟的microRNA能夠識(shí)別特定的靶向mRNA3’非編碼區(qū)，并與之結(jié)合，如果兩者堿基互補(bǔ)，則可使mRNA降解，如不完全互補(bǔ)，則抑制靶mRNA翻譯，影響蛋白質(zhì)表達(dá)水平，但不影響靶mRNA的穩(wěn)定性(VN Kim,et al.(2009)Nature reviews.Molecular cell biology 10,126-139)。近年來(lái)研究表明，腫瘤遷移、侵襲、粘附、上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化以及轉(zhuǎn)移瘤增殖等多個(gè)腫瘤轉(zhuǎn)移關(guān)鍵步驟中均有microRNA參與調(diào)控，起到類似癌基因或抑癌基因的作用(MV Iorio,et al.(2009)Journal of clinical oncology:official journal of the American Society of Clinical Oncology 27,5848-5856)。例如，let-7家族在多種腫瘤中通過負(fù)向調(diào)節(jié)Ras，Myc和JAK等通路抑制腫瘤增殖(X Wang,et al.(2012)Oncology letters 3,955-960)。miR-222則可以通過抑制RECK(N Li,et al.(2012)FEBS letters 586,722-728)和PTEN(Z Chun-Zhi,et al.(2010)BMC cancer 10,367)促進(jìn)腫瘤增殖。

初步的研究表明，組織microRNA在胃癌診斷和預(yù)測(cè)預(yù)后以及治療療效預(yù)測(cè)方面可能具有良好的應(yīng)用前景。Li等(X Li,et al.(2010)Gut 59,579-585)檢測(cè)了100例胃癌患者的癌組織標(biāo)本中7種microRNA分子(miR-10b、miR-21、miR-223、miR-338、let-7a、miR-30a-5p和miR-126)的表達(dá)。通過計(jì)算每種microRNA分子的表達(dá)量，算出每例患者的危險(xiǎn)評(píng)分。發(fā)現(xiàn)這7種microRNA分子的表達(dá)與患者的總體生存率和無(wú)病生存率明顯相關(guān)。Ueda T等(T Ueda,et al.(2010)The lancet oncology 11,136-146)用microRNA微陣列分析來(lái)自日本的兩個(gè)獨(dú)立的患者組的353份胃組織樣本，發(fā)現(xiàn)Let-7g和miR-433的低表達(dá)、以及miR-214的高表達(dá)在所有存活的患者中與的轉(zhuǎn)歸相關(guān)，并和浸潤(rùn)深度、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移和臨床分期等臨床協(xié)變量相互獨(dú)立。以上證據(jù)均提示microRNA有希望成為胃癌進(jìn)展和預(yù)后相關(guān)的腫瘤標(biāo)志物。

循環(huán)miRNA由于其在循環(huán)中的穩(wěn)定性、腫瘤特異性的表達(dá)譜、無(wú)創(chuàng)性和可重復(fù)性， 被認(rèn)為是潛在的腫瘤診斷和預(yù)后判斷的標(biāo)志物(PS Mitchell,et al.(2008)Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America 105,10513-10518,X Chen,et al.(2008)Cell research 18,997-1006)。循環(huán)miRNA主要來(lái)源于腫瘤細(xì)胞，通過漏出或微囊泡介導(dǎo)的主動(dòng)轉(zhuǎn)運(yùn)進(jìn)入外周循環(huán)(H Valadi,et al.(2007)Nature cell biology 9,654-659)。據(jù)報(bào)道，有些miRNA在微囊泡中的含量遠(yuǎn)高于其來(lái)源的腫瘤細(xì)胞，提示miRNA可能選擇性的在微囊泡中富集(H Valadi,et al.(2007)Nature cell biology 9,654-659)。因此，循環(huán)中miRNA的表達(dá)譜和預(yù)測(cè)作用可能與腫瘤組織中有所區(qū)別。另外，由于循環(huán)miRNA來(lái)源于腫瘤中所有細(xì)胞而不是一部分細(xì)胞，而研究組織miRNA時(shí)僅需從一小塊組織中分離，研究循環(huán)miRNA能夠降低實(shí)體腫瘤異質(zhì)性帶來(lái)的影響。

已有大量的研究試圖尋找能夠作為胃癌標(biāo)志物的循環(huán)miRNA(HS Liu,et al.(2014)World journal of gastroenterology:WJG 20,12007-12017)。然而，這些研究大多關(guān)注胃癌的早期診斷，僅有極少數(shù)的研究關(guān)注胃癌的復(fù)發(fā)和預(yù)后。既往研究報(bào)道，循環(huán)miR-21(S Komatsu,et al.(2013)Anticancer research 33,271-276,GJ Ma,et al.(2013)Asian Pacific journal of cancer prevention:APJCP 14,7551-7554),miR-200c(M Valladares-Ayerbes,et al.(2012)Journal of translational medicine10,186),miR-146a,miR-148a(SY Kim,et al.(2013)The Journal of molecular diagnostics:JMD 15,661-669),miR-17-5p和miR-20a(M Wang,et al.(2012)Molecular medicine reports 5,1514-1520)與胃癌的預(yù)后、轉(zhuǎn)移和治療效果有關(guān)，但這幾項(xiàng)研究樣本量均較少，且缺乏驗(yàn)證，因此限制了應(yīng)用的價(jià)值。另外，在前人關(guān)于miRNA模型和其他腫瘤的研究中，人們發(fā)現(xiàn)將多個(gè)miRNA綜合建立模型與單個(gè)miRNA相比能夠明顯提高診斷或預(yù)測(cè)的準(zhǔn)確性(J Zhou,et al.(2011)Journal of clinical oncology:official journal of the American Society of Clinical Oncology 29,4781-4788,Z Hu,et al.(2010)Journal of clinical oncology:official journal of the American Society of Clinical Oncology 28,1721-1726,J-X Zhang,et al.(2013)The lancet oncology 14,1295-1306)。雖然有幾項(xiàng)miRNA模型早期診斷胃癌的研究已經(jīng)取得了令人振奮的結(jié)果(MY Song,et al.(2012)PloS one 7,e33608,A Shiotani,et al.(2013)British journal of cancer 109,2323-2330,C Zhu,et al.(2014)British journal of cancer,Y Yin,et al.(2012)International journal of molecular sciences13,12544-12555),但目前為止仍未見預(yù)測(cè)胃癌復(fù)發(fā)或預(yù)后的miRNA模型報(bào)道。

因此，仍然有必要在II、III期胃癌患者的循環(huán)中發(fā)現(xiàn)有預(yù)測(cè)價(jià)值的microRNA標(biāo)志物，通過多個(gè)microRNA標(biāo)志物聯(lián)合應(yīng)用建立胃癌復(fù)發(fā)預(yù)測(cè)模型，從而快速、準(zhǔn)確、低成本地預(yù)測(cè)復(fù)發(fā)高?；颊?，為術(shù)后個(gè)體化輔助化療提供參考。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

本發(fā)明的第一個(gè)目的是提供一個(gè)新的II、III期胃癌復(fù)發(fā)標(biāo)志物；

本發(fā)明的第二個(gè)目的是提供一種II、III期胃癌復(fù)發(fā)預(yù)后預(yù)測(cè)方法；

本發(fā)明的第三個(gè)目的是提供一種用于預(yù)測(cè)II、III期胃癌復(fù)發(fā)的試劑盒，以克服現(xiàn)有技術(shù)存在的不足，滿足臨床應(yīng)用的需要。

在第一方面，本發(fā)明所述的II、III期胃癌復(fù)發(fā)標(biāo)志物，由血漿中多種核酸分子組成，每種所述的核酸分子，編碼至少一個(gè)microRNA序列；

優(yōu)選的，所述的多種核酸分子包含let-7e,miR-125b,miR-148a,miR-21,miR-222,miR-26a,miR-126和miR-16；

本發(fā)明還包含一個(gè)回歸模型，所述的回歸模型為：logitP_7miRNA classifier＝a₀+a₁*let-7e+a₂*miR-125b+a₃*miR-148a+a₄*miR-21+a₅*miR-222+a₆*miR-26a+a₇*miR-126；

其中：let-7e,miR-125b,miR-148a,miR-21,miR-222,miR-26a,miR-126的數(shù)值是以qRT-PCR檢測(cè)結(jié)果的CT值減去內(nèi)參miR-16的CT值得到；

系數(shù)為：

a₀為2.408～2.448，優(yōu)選2.427～2.429；

a₁為0.073～0.113，優(yōu)選0.092～0.094；

a₂為-0.237～-0.197，優(yōu)選-0.218～-0.216；

a₃為0.235～0.275，優(yōu)選0.254～0.256；

a₄為-0.363～-0.323，優(yōu)選-0.344～-0.342；

a₅為-0.041～-0.012，優(yōu)選-0.028～-0.026；

a₆為-0.060～-0.030，優(yōu)選-0.046～-0.044；

a₇為-0.185～-0.145，優(yōu)選-0.166～-0.164。

第二方面，所述的II、III期胃癌復(fù)發(fā)預(yù)后預(yù)測(cè)的方法，是包括采用所述的II、III期胃癌復(fù)發(fā)標(biāo)志物、由腫瘤T分期、腫瘤N分期、腫瘤最大徑長(zhǎng)度和是否有脈管侵犯所組成的數(shù)據(jù)進(jìn)行的；

優(yōu)選的，所述方法，還包含兩個(gè)回歸模型：

(1)logitP_7miR+pathological factors index＝b₀+b₁*logitP_7miR+b₂*N+b₃*size+b₄*T4+b₅vascular invasion；

(2)logitP_7miR+pathological factors index(without N)＝c₀+c₁*logitP_7miR+c₂*size+c₃*T+c₄*vascular_invasion；

其中：

logitP_7miR為logitP_7miRNA classifier的縮寫，其數(shù)值以logitP_7miRNA classifier公式計(jì)算得到。

N根據(jù)患者病理分期得到，無(wú)淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移定義為1，有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移定義為2；

T根據(jù)患者病理分期得到，浸潤(rùn)漿膜層或更淺定義為1，突破漿膜層定義為2；

size根據(jù)患者病理報(bào)告得到，為腫瘤測(cè)量最大徑，單位厘米；

vascular_invasion根據(jù)患者病理報(bào)告得到，有脈管侵犯定義為1，無(wú)脈管侵犯定義為0；

系數(shù)：

b₀為-7.983至-7.943，優(yōu)選-7.964至-7.962；

b₁為1.071-1.111，優(yōu)選1.090-1.092；

b₂為2.328-2.368，優(yōu)選2.347-2.349；

b₃為0.361-0.391，優(yōu)選0.375-0.377；

b₄為0.886-0.926，優(yōu)選0.905-0.907；

b₅為0.765-0.805，優(yōu)選0.784-0.786；

c₀為-3.512至-3.472，優(yōu)選-3.493至-3.491；

c₁為0.964至1.104，優(yōu)選0.983至0.985；

c₂為0.336至0.365，優(yōu)選0.350至0.352；

c₃為0.818至0.858，優(yōu)選0.837至0.839；

c₄為1.159至1.199，優(yōu)選1.178至1.180；

根據(jù)患者胃癌根治性手術(shù)及病理檢測(cè)結(jié)果，若胃癌根治術(shù)中淋巴結(jié)清掃數(shù)目大于等于16個(gè)的患者優(yōu)選logitP_7miR+pathological factors index，(即模型1)計(jì)算結(jié)果大于等于0.0192，可判定為高復(fù)發(fā)風(fēng)險(xiǎn)，結(jié)果小于0.0192，則判定為低復(fù)發(fā)風(fēng)險(xiǎn)。若胃癌根治術(shù)中淋巴結(jié)清掃數(shù)目小于16個(gè)的患者優(yōu)選logitP_7miR+pathological factors index(without N)(即模型2)，計(jì)算結(jié)果大于等于-0.1914，則判定為高復(fù)發(fā)風(fēng)險(xiǎn)，結(jié)果小于-0.1914，則判定為低復(fù)發(fā)風(fēng)險(xiǎn)。

第三方面，本發(fā)明公開了一種用于預(yù)測(cè)II、III期胃癌復(fù)發(fā)的檢測(cè)試劑盒，由血漿中多種核酸分子組成，每種核酸分子編碼至少一個(gè)microRNA序列；

在優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述的多種核酸分子包含let-7e,miR-125b,miR-148a,miR-21,miR-222,miR-26a,miR-126和miR-16。

最優(yōu)選的，所述檢測(cè)試劑盒還包含如下的回歸模型：

logitP_7miRNA classifier＝a₀+a₁*let-7e+a₂*miR-125b+a₃*miR-148a+a₄*miR-21+a₅*miR-222+a₆*miR-26a+a₇*miR-126；

其中：let-7e,miR-125b,miR-148a,miR-21,miR-222,miR-26a,miR-126的數(shù)值是以qRT-PCR檢測(cè)結(jié)果的CT值減去內(nèi)參miR-16的CT值得到；

系數(shù)：

a₀為2.408～2.448，優(yōu)選2.427～2.429；

a₁為0.073～0.113，優(yōu)選0.092～0.094；

a₂為-0.237～-0.197，優(yōu)選-0.218～-0.216；

a₃為0.235～0.275，優(yōu)選0.254～0.256；

a₄為-0.363～-0.323，優(yōu)選-0.344～-0.342；

a₅為-0.041～-0.012，優(yōu)選-0.028～-0.026；

a₆為-0.060～-0.030，優(yōu)選-0.046～-0.044；

a₇為-0.185～-0.145，優(yōu)選-0.166～-0.164。

本發(fā)明還涉及一種用于預(yù)測(cè)II、III期胃癌復(fù)發(fā)的檢測(cè)試劑盒，包括所述的由血漿 microRNA組成的II、III期胃癌復(fù)發(fā)標(biāo)志物、回歸模型(1)：logitP_7miRNA classifier＝a₀+a₁*let-7e+a₂*miR-125b+a₃*miR-148a+a₄*miR-21+a₅*miR-222+a₆*miR-26a+a₇*miR-126；

其中：let-7e,miR-125b,miR-148a,miR-21,miR-222,miR-26a,miR-126的數(shù)值是以qRT-PCR檢測(cè)結(jié)果的CT值減去內(nèi)參miR-16的CT值得到；

系數(shù)為：

a₀為2.408～2.448，優(yōu)選2.427～2.429；

a₁為0.073～0.113，優(yōu)選0.092～0.094；

a₂為-0.237～-0.197，優(yōu)選-0.218～-0.216；

a₃為0.235～0.275，優(yōu)選0.254～0.256；

a₄為-0.363～-0.323，優(yōu)選-0.344～-0.342；

a₅為-0.041～-0.012，優(yōu)選-0.028～-0.026；

a₆為-0.060～-0.030，優(yōu)選-0.046～-0.044；

a₇為-0.185～-0.145，優(yōu)選-0.166～-0.164和以下兩個(gè)回歸模型：

(1)logitP_7miR+pathological factors index＝b₀+b₁*logitP_7miR+b₂*N+b₃*size+b₄*T4+b₅vascular invasion；

(2)logitP_7miR+pathological factors index(without N)＝c₀+c₁*logitP_7miR+c₂*size+c₃*T+c₄*vascular_invasion；

其中：

N根據(jù)患者病理分期得到，無(wú)淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移定義為1，有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移定義為2；

T根據(jù)患者病理分期得到，浸潤(rùn)漿膜層或更淺定義為1，突破漿膜層定義為2；

size根據(jù)患者病理報(bào)告得到，為腫瘤測(cè)量最大徑，單位厘米；

vascular_invasion根據(jù)患者病理報(bào)告得到，有脈管侵犯定義為1，無(wú)脈管侵犯定義為0；

系數(shù)：

b₀為-7.983至-7.943，b₁為1.071-1.111，b₂為2.328-2.368，b₃為0.361-0.391，b₄為0.886-0.926，b₅為0.765-0.805，c₀為-3.512至-3.472，c₁為0.964至1.104，c₂為0.336至0.365，c₃為0.818至0.858，c₄為1.159至1.199；

logitP_7miR其數(shù)值是以數(shù)值是以logitP_7miRNAclassifier公式計(jì)算得到。

本發(fā)明的有益效果是：

本發(fā)明能夠在II、III期胃癌患者的循環(huán)中發(fā)現(xiàn)有預(yù)測(cè)價(jià)值的microRNA標(biāo)志物，通過多個(gè)microRNA標(biāo)志物聯(lián)合應(yīng)用，建立胃癌復(fù)發(fā)預(yù)測(cè)模型，從而能夠快速、準(zhǔn)確、低成本地預(yù)測(cè)復(fù)發(fā)高?；颊?，為術(shù)后個(gè)體化輔助化療提供參考；能夠方便應(yīng)用于臨床，快速有效的在術(shù)前檢測(cè)患者復(fù)發(fā)風(fēng)險(xiǎn)，檢測(cè)外周血為非侵入性檢查，創(chuàng)傷小，患者易于接受。血漿microRNA與臨床病理因素結(jié)合能更好的預(yù)測(cè)復(fù)發(fā)，而且目前國(guó)際上尚無(wú)預(yù)測(cè)胃癌術(shù)后復(fù)發(fā)的模型，實(shí)體腫瘤具有異質(zhì)性，循環(huán)microRNA相比組織取材能更全面的反映腫瘤的遺傳學(xué)特征，本發(fā)明基于的研究樣本量大，研究樣本來(lái)自不同地域多中心，有獨(dú)立驗(yàn)證組，結(jié)果可信。

附圖說(shuō)明

圖1為獲得標(biāo)志物和預(yù)測(cè)新方法的分析流程圖，

圖2為miRNA classifier和7miR+pathological factors index的ROC和K-M曲線。其中：第一行為訓(xùn)練集，第二行為驗(yàn)證集，第三行為合并集數(shù)據(jù)，第一列為7miRNA classifier的ROC曲線，第二列為7miRNA classifier的K-M曲線，第三列為7miR+pathological factors index的ROC曲線，第四列為7miR+pathological factors index的K-M曲線。

圖3為ROC曲線比較，即7miRNA classifier，7miR+pathological factors index與臨床病理因素比較。

圖4為根據(jù)病理分期分層的ROC和K-M曲線，第一行為II期患者數(shù)據(jù)，第二行為III期患者數(shù)據(jù)，第一列為7miRNA classifier的ROC曲線，第二列為7miRNA classifier的K-M曲線，第三列為7miR+pathological factors index的ROC曲線，第四列為7miR+pathological factors index的K-M曲線。

圖5為IIA期患者的ROC和K-M曲線，第一行為ROC曲線，第二行為K-M曲線，第一列為7miRNA classifier的數(shù)據(jù)，第二列為7miR+pathological factors index的數(shù)據(jù)。

圖6為不含淋巴結(jié)分期的模型的ROC和K-M曲線，第一行為訓(xùn)練集，第二行為驗(yàn)證集，第三行為合并集數(shù)據(jù)，第一列為ROC曲線，第二列為K-M曲線。

具體實(shí)施方式

本發(fā)明將從以下詳細(xì)描述中變得更為明。

本發(fā)明原理如下：

如圖1所示，為獲得本發(fā)明II、III期胃癌復(fù)發(fā)標(biāo)志物，II、III期胃癌復(fù)發(fā)預(yù)后預(yù)測(cè)的新方法的分析流程圖。

納入407例臨床樣本共來(lái)源于三個(gè)臨床中心；應(yīng)用ABI miRNA microarray芯片檢測(cè)5對(duì)II期復(fù)發(fā)和III期不復(fù)發(fā)的胃癌患者血漿miRNA差異表達(dá)；應(yīng)用Taqman Low Density Array(TLDA)檢測(cè)58個(gè)II、III期胃癌患者中候選差異miRNA和候選參照的表達(dá)；應(yīng)用qRT-PCR檢測(cè)訓(xùn)練集170例患者血漿差異miRNA表達(dá)，綜合臨床病理因素，通過Logistic回歸建立模型，在驗(yàn)證集169例患者中進(jìn)行驗(yàn)證，并通過ROC曲線分析、生存分析、分層分析等方法分析模型預(yù)測(cè)效能。

納入患者標(biāo)準(zhǔn)見表1，各階段納入患者的特征見表2。

首先，本發(fā)明使用Taqman Array Gene Signature Cards(Human A+B Card Setv3)對(duì)10例來(lái)自復(fù)旦大學(xué)附屬腫瘤醫(yī)院的性別年齡匹配的胃癌患者(5例II期復(fù)發(fā)患者，5例III期不復(fù)發(fā)患者)進(jìn)行血漿miRNA篩選，確定25個(gè)候選miRNA，7個(gè)候選qRT-PCR參照，在復(fù)旦大學(xué)附屬腫瘤醫(yī)院58例性別、年齡、分期頻率匹配的患者血漿通過Taqman Low DensityArray(TLDA)進(jìn)行驗(yàn)證。

發(fā)現(xiàn)集中根據(jù)最佳參照miR-16選擇11個(gè)候選miRNA繼續(xù)在訓(xùn)練集中通過qRT-PCR進(jìn)行檢測(cè)，并對(duì)每個(gè)miRNA與是否復(fù)發(fā)進(jìn)行單因素logistic回歸分析，發(fā)現(xiàn)其中7個(gè)miRNA有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。繼而對(duì)這7個(gè)miRNA進(jìn)行多因素logistic分析，單因素和多因素分析的結(jié)果以及通過曲線下面積(Area Under the Curve,AUC)描述的預(yù)測(cè)準(zhǔn)確性見表3。

通過多因素逐步logistic回歸建立模型預(yù)測(cè)胃癌復(fù)發(fā)的風(fēng)險(xiǎn)。復(fù)發(fā)的可能性通過以上單因素有意義的7個(gè)miRNA預(yù)測(cè)，即logitP_7miRNA classifier納入let-7e,miR-125b,miR-148a,miR-21,miR-222,miR-26a,miR-126。當(dāng)將所有預(yù)測(cè)胃癌復(fù)發(fā)單因素有意義的臨床病理因素都納入時(shí)，如上建立的7個(gè)miRNA組成的預(yù)測(cè)模型仍為獨(dú)立預(yù)測(cè)因子。7miRNA預(yù)測(cè)模型和臨床病理因素的單因素和多因素分析的結(jié)果以及通過AUC描述的預(yù)測(cè)準(zhǔn)確性見表4。通過以上多因素logistic回歸結(jié)果，進(jìn)一步建立了含miRNA的綜合預(yù)測(cè)模型,即logitP_7miR+pathological factors納入logitP_7miR，N,size,T,vascular invasion。7miRNA classifier和7miR+pathological factors index預(yù)測(cè)模型的預(yù)測(cè)效能通過ROC曲線分析評(píng)價(jià)，見圖2。曲線的切點(diǎn)定義為約登指數(shù)最大的點(diǎn)，即靈敏度+特異度-1數(shù)值最大。7miRNA classifier和7miR+pathological factors index預(yù)測(cè)模型的切點(diǎn)分別為0.0304和0.0192.根據(jù)模型的切點(diǎn)，將患者區(qū)分為高危組和低危組。

定義可疑值范圍以增加模型的靈敏度和特異度，分別為-0.4963到0.1089和-0.5910到0.1801。與預(yù)期相符，兩個(gè)模型中預(yù)測(cè)的高?；颊叨汲霈F(xiàn)了更高的復(fù)發(fā)比例，見表4。在生存分析中，7miRNA classifier和7miR+pathological factors index預(yù)測(cè)模型中高?；颊叩腄FS及OS較低危患者均顯著縮短，見圖2及表4.

為了驗(yàn)證7miRNA classifier和7miR+pathological factors兩個(gè)預(yù)測(cè)模型預(yù)測(cè)胃癌患者復(fù)發(fā)及預(yù)后的能力，在另一個(gè)獨(dú)立的隊(duì)列中檢測(cè)這7個(gè)miRNA的表達(dá)，并計(jì)算7miRNA classifier和7miR+pathological factors兩個(gè)模型。訓(xùn)練集中獲得的參數(shù)和切點(diǎn)直接運(yùn)用于驗(yàn)證集中以此預(yù)測(cè)胃癌患者復(fù)發(fā)的風(fēng)險(xiǎn)。兩模型仍較準(zhǔn)確，且高危組均呈現(xiàn)更高的復(fù)發(fā)率，圖2。當(dāng)把訓(xùn)練集和驗(yàn)證集的患者合并之后，結(jié)果仍相似。7miRNA classifier和7miR+pathological factors兩個(gè)預(yù)測(cè)模型均有較好的預(yù)測(cè)準(zhǔn)確性，預(yù)測(cè)的高?；颊呔鶑?fù)發(fā)率較高，DFS和OS較短。

為了研究7miRNA classifier是否為預(yù)后的獨(dú)立預(yù)后因素，首先對(duì)DFS進(jìn)行了單因素COX分析，在訓(xùn)練集、驗(yàn)證集和合并集中，7miRNA classifier均與DFS顯著相關(guān)。納入所有單因素有意義的臨床病理因素，繼續(xù)分析了多因素COX回歸。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，當(dāng)納入所有有意義的因素后，除7miRNA classifier在驗(yàn)證集中僅有邊界統(tǒng)計(jì)學(xué)意義外兩模型在其他集合對(duì)DFS和OS均為獨(dú)立危險(xiǎn)因素，見表5。7miRNAclassifier模型與任意單個(gè)miRNA或有意義的臨床病理因素相比預(yù)測(cè)效能均更好，詳見表3及圖3。加入7miRNA classifier與單純的合并臨床病理因素相比亦能增加預(yù)測(cè)效能。因此，7miRNAclassifier能夠在傳統(tǒng)預(yù)后因子的基礎(chǔ)上增加預(yù)測(cè)的價(jià)值。

為了探究7miRNA classifier和7miR+pathological factors index能否在II期和III期內(nèi)預(yù)測(cè)復(fù)發(fā)，用合并集的數(shù)據(jù)進(jìn)行了分層分析。對(duì)于7miR+pathological factors模型，AUC在II期患者和III期患者中沒有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。7miRNA classifier模型對(duì)于II期患者比對(duì)III期患者更準(zhǔn)確，圖4，表6。

值得注意的是，兩個(gè)模型在IIA期患者中都有較高的準(zhǔn)確性。其中7miRNA classifier的AUC為0.892(95％CI:0.765-1.000),靈敏度為0.833,特異度為0.839,診斷準(zhǔn)確度為0.838,陽(yáng)性預(yù)測(cè)值為0.500,陰性預(yù)測(cè)值為0.963。對(duì)于7miR+pathological factors模型，AUC為0.867(95％CI:0.721-1.000),靈敏度為0.400,特異度為1.000,準(zhǔn)確度為0.914,陽(yáng)性預(yù)測(cè)值為1.000,陰性預(yù)測(cè)值為0.909。見圖5及表7。DFS生存分析表明，兩模型預(yù)測(cè)的高危人群DFS顯著縮短。7miRNA classifier預(yù)測(cè)10人復(fù)發(fā)，其中復(fù)發(fā)5人；預(yù)測(cè)27人不復(fù)發(fā)， 其中復(fù)發(fā)1人；7miR+pathological factors index預(yù)測(cè)2人復(fù)發(fā)，全部發(fā)生復(fù)發(fā)；預(yù)測(cè)33人不復(fù)發(fā)，其中3人復(fù)發(fā)，如圖5可見兩個(gè)模型都達(dá)到了較高的預(yù)測(cè)效能。OS的分析結(jié)果類似，高危人群OS顯著縮短，log-rank P均<0.001。

考慮到有些低復(fù)發(fā)率地區(qū)相當(dāng)一部分患者未能接受標(biāo)準(zhǔn)的D2淋巴結(jié)清掃術(shù)，在這些患者中，由于清掃的淋巴結(jié)數(shù)目少于16個(gè)，TNM分期中的N分期可能不準(zhǔn)，導(dǎo)致預(yù)測(cè)預(yù)后的情況不準(zhǔn)確。因此，進(jìn)一步建立了另一個(gè)包含7miRNA classifier和除N分期以外的臨床病理因素的復(fù)發(fā)預(yù)測(cè)模型，以此對(duì)未能接受D2淋巴結(jié)清掃術(shù)的胃癌患者提供預(yù)測(cè)復(fù)發(fā)及預(yù)后的建議。在對(duì)包含7miRNA classifier和除N分期以外的臨床病理因素進(jìn)行多因素logistic回歸后，建立如下模型：logitP_7miR+pathological factors(without N)包含logitP_7miR，size，T，vascular_invasion.在訓(xùn)練集、驗(yàn)證集和合并集中，該模型均表現(xiàn)出較高的判斷復(fù)發(fā)的準(zhǔn)確性，圖6，各集合靈敏度、特異度、陽(yáng)性預(yù)測(cè)值、陰性預(yù)測(cè)值、準(zhǔn)確度見表8。最佳切點(diǎn)為-0.1914，切點(diǎn)區(qū)分的高危組較低危組相比預(yù)后更差。

表1.患者入組條件

表2.納入患者的臨床病理特征

縮寫:TLDA:TaqMan Low DensityArray；DFS:disease free survival；OS:overall survival.

表3.建模組單因素及多因素logistic回歸結(jié)果

縮寫:AUC:area under the curve；OR:odds ratio.

表4.訓(xùn)練集及驗(yàn)證集中兩模型預(yù)測(cè)復(fù)發(fā)及預(yù)后效能

縮寫:AUC:area under the curve；OR:odds ratio；HR:harzard ratio.

繼表4.訓(xùn)練集及驗(yàn)證集中兩模型預(yù)測(cè)復(fù)發(fā)及預(yù)后效能

縮寫:AUC:area under the curve；OR:odds ratio；HR:harzard ratio.

表5. DFS多因素COX分析

Abbreviations:HR:harzard ratio.

續(xù)表5. DFS多因素COX分析

表6.模型預(yù)測(cè)效能的分層分析

Abbreviations:AUC:area under the curve；PPV:positive predictive value；NPV:negative predictive value；OR:odds ratio；HR:harzard ratio.

繼表6.模型預(yù)測(cè)效能的分層分析

Abbreviations:AUC(area under the curve):曲線下面積；PPV(positive predictive value)：陽(yáng)性預(yù)測(cè)值；NPV(negative predictive value)：陰性預(yù)測(cè)值；OR(odds ratio)：比數(shù)比；HR(harzard ratio)：危險(xiǎn)比.

表7.模型在IIA期患者中的預(yù)測(cè)效能

縮寫:AUC:area under the curve；OR:odds ratio；HR:harzard ratio.

續(xù)表7.模型在IIA期患者中的預(yù)測(cè)效能

表8.無(wú)N分期模型的預(yù)測(cè)效能

縮寫:AUC(area under the curve):曲線下面積；OR(odds ratio)：比數(shù)比；HR(harzard ratio)：危險(xiǎn)比.

續(xù)表8.無(wú)N分期模型的預(yù)測(cè)效能

以下結(jié)合實(shí)施例對(duì)本發(fā)明作進(jìn)一步說(shuō)明。

實(shí)施例1

由血漿microRNA組成的II、III期胃癌復(fù)發(fā)標(biāo)志物及一種II、III期胃癌復(fù)發(fā)預(yù)后預(yù)測(cè)的新方法。

使用試劑盒和新方法預(yù)測(cè)II、III期胃癌患者術(shù)后3年是否復(fù)發(fā)的具體步驟如下：

1.血漿樣本制備

1)采集外周血4mL(采血時(shí)間一般為早晨),迅速轉(zhuǎn)入EDTA抗凝管中(不超過30分鐘),渦旋或用移液器混勻。

2)離心機(jī)820g,4攝氏度,離心10分鐘。此步驟在1小時(shí)(室溫條件下)或2小時(shí)(4攝氏度條件下)內(nèi)需完成。

3)吸約1mL上清轉(zhuǎn)至潔凈的1.5mL離心管中,16000g,4攝氏度,離心10分鐘,將所有雜質(zhì)沉淀下來(lái),小心吸取上清到新的離心管中,置于.80攝氏度冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

2. RNA抽提

mirVana^TM PARIS^TM Kit(Applied Biosystem,p/n AMl556)提取總RNA,NanoDrop 1000Spectrophotometer測(cè)定總RNA濃度。方法如下:

1)在2×變性液中添加375μl β-巰基乙醇,混勻后放置備用；在miRNA Wash Solution 1中添加21mL無(wú)水乙醇,混勻后放置備用；在Wash Solution2/3中添加40mL無(wú)水乙醇,混勻后放置備用。

2)取適量的血漿(芯片檢測(cè)800μl，TLDA檢測(cè)400μl，qRT-PCR檢測(cè)150μl),加入等量的2×變性液,渦旋混勻,冰上放置5分鐘。

3)添加與總體積等量的酚/氯仿,渦旋混勻30-60秒,室溫,最高轉(zhuǎn)速離心5分鐘。

4)小心吸取上清到新的1.5mL離心管中,添加1.25倍體積的無(wú)水乙醇,渦旋混勻。

5)將潔凈的離心柱放置到潔凈的收集管中,吸取上一步的液體到柱子中,10000g,室溫離心30秒,棄流過液,將離心柱重新放置到收集管中。重復(fù)該步驟,直到所有的液體過柱。

6)吸取350μlmiRNA Wash Solmion 1到離心柱中,10000g,室溫離心15秒,棄流過液,將離心柱重新放置到收集管中。

7)混合l0μlDNaseI stocksolution和70μlBufferRDDQIAGEN(#79254)80μl加到離心柱中的膜上,25℃放置15min。

8)吸取350μlmiRNAWash Solution 1到離心柱中,10000g,室溫離心15秒,棄流過液,將離心柱重新放置到收集管中。

9)500μl Wash Solution 2/3過柱兩次,空柱離心1分鐘。將離心柱放置到新的收集管中,柱中心加入50μl 95℃預(yù)熱的Elution Solution或nuclease-free水,室溫最高轉(zhuǎn)速離心20-30秒,收集管中的液體即為提取的總RNA,可放置在-70攝氏度保存。

3.實(shí)時(shí)熒光定量RT-PCR

3.1 RT反應(yīng)

1)參照Taqman microRNA RT反應(yīng)試劑盒說(shuō)明書,每個(gè)樣本用150μl血漿提取產(chǎn)物(50μl)上樣,反應(yīng)步驟如下:

2)加入各反應(yīng)成分后稍作離心混勻,執(zhí)行如下程序:

3.2 Real-time PCR

1)參照Taqman MicroRNA assays(Applied Biosystems)反應(yīng)試劑盒說(shuō)明書在Applied Biosystems 7900HT Fast Real.Time PCR System實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀上進(jìn)行,反應(yīng)體系和條件如下:

2)加入各反應(yīng)成分并充分混勻后稍作離心,在Applied Biosystems 7900HT FastReal-Time PCR System實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀上執(zhí)行如下程序:

共進(jìn)行45個(gè)循環(huán)。

3)60℃時(shí)進(jìn)行熒光數(shù)據(jù)采集,吸收波長(zhǎng):490nm；釋放波長(zhǎng):530nm。Ct值由Applied Biosystems 7900HT Fast Real-Time PCR System控制分析軟件經(jīng)過二次衍生法計(jì)算而得。

4)獲得qRT-PCR讀數(shù)后使用內(nèi)參miR-16進(jìn)行矯正。

4.由血漿microRNA組成的II、III期胃癌復(fù)發(fā)標(biāo)志物的計(jì)算：let-7e,miR-125b,miR-148a,miR-21,miR-222,miR-26a,miR-126的數(shù)值以miR-16為內(nèi)參得到的delta CT值。計(jì)算公式：

logitP_7miRNA classifier

＝2.438+0.093*let-7e-0.217*miR-125b+0.255*miR-148a-0.343*miR-21-0.027*miR-222-0.045*miR-26a-0.165*miR-126；如編號(hào)b9患者，let-7e,miR-125b,miR-148a,miR-21, miR-222,miR-26a,miR-126的qRT-PCR檢測(cè)CT值分別為30.9426,32.199,28.3145,20.2609,26.4205,26.6194和25.412，miR-16的CT值為19.8339，故以上delta CT值分別為11.1087，12.3651，8.4806，0.427，6.5866，6.7855和5.5781，代入以上公式計(jì)算得到logitP_7miRNA classifier＝1.40，大于切點(diǎn)0.0304，預(yù)測(cè)為高復(fù)發(fā)風(fēng)險(xiǎn)，復(fù)發(fā)風(fēng)險(xiǎn)為0.80。

5.基于血漿microRNA標(biāo)志物和臨床病理因素的II、III期胃癌復(fù)發(fā)預(yù)后預(yù)測(cè)：該患者淋巴結(jié)清掃數(shù)目大于16，故患者復(fù)發(fā)風(fēng)險(xiǎn)預(yù)測(cè)值計(jì)算采用如下公式：logitP_7miR+pathological factors index＝-7.953+1.091*logitP_7miR+2.348*N+0.376*size+0.906*T+0.785*vascular invasion，其中N根據(jù)患者病理分期得到，無(wú)淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移定義為1，有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移定義為2；T根據(jù)患者病理分期得到，浸潤(rùn)漿膜層或更淺定義為1，突破漿膜層定義為2；size根據(jù)患者病理報(bào)告得到，為腫瘤測(cè)量最大徑，單位厘米；vascular_invasion根據(jù)患者病理報(bào)告得到，有脈管侵犯定義為1，無(wú)脈管侵犯定義為0。logitP_7miR為logitP_7miR為logitP_7miRNA classifier縮寫，其數(shù)值是以logitP_7miRNA classifier公式計(jì)算得到。

該患者病理分期T3N0M0,腫瘤最大徑為9cm，無(wú)脈管侵犯，故公式中T為2，N為1，vascular_invasion為0，size為9，代入以上公式，計(jì)算logitP_7miR+pathological factors index＝0.19，結(jié)果大于0.0192，預(yù)測(cè)為高復(fù)發(fā)風(fēng)險(xiǎn)，復(fù)發(fā)風(fēng)險(xiǎn)估計(jì)為55％。