本發(fā)明涉及生物技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種黃嘌呤脫氫酶及其在含次黃嘌呤和黃嘌呤樣品檢測(cè)中的應(yīng)用，尤其涉及一種鮑氏不動(dòng)桿菌堿性黃嘌呤脫氫酶及其在降解含次黃嘌呤和黃嘌呤以及在檢測(cè)血液、尿液等樣品中黃嘌呤/次黃嘌呤含量的應(yīng)用。

背景技術(shù)：

黃嘌呤氧化還原酶(Xanthine oxidoreductase，簡(jiǎn)稱XOR)是一種包含鐵硫簇、鉬蝶呤輔基的黃素蛋白類氧化還原酶，它具有黃嘌呤氧化酶(Xanthine oxidase,簡(jiǎn)稱XOD，EC1.17.3.2)和黃嘌呤脫氫酶(Xanthine dehydrogenase，簡(jiǎn)稱XDH，EC 1.17.1.4)兩種不同的存在形式。XOR不僅能夠利用天然存在的諸如氧氣、NAD、硝酸鹽等物質(zhì)作為電子受體，也可以利用諸如PMS和亞甲基藍(lán)等人工合成染料作為電子受體，催化氧化包括嘌呤、蝶啶和醛類等多種雜環(huán)分子的sp2雜化的碳原子(李麗書，陳獻(xiàn)華，邵葉波，劉璇，徐平，《黃嘌呤氧化還原酶的結(jié)構(gòu)、功能和作用》)。因此，XOR具有重要的商業(yè)應(yīng)用價(jià)值，被用于生產(chǎn)XOR抗體和檢測(cè)黃嘌呤/次黃嘌呤和酶聯(lián)法檢測(cè)無(wú)機(jī)磷等的臨床診斷試劑盒，以及酶法生物合成病毒唑等核苷類藥物和降解有機(jī)污染物等(Agarwal,A.,A.Banerjee,and U.C.Banerjee,Xanthine oxidoreductase:a journey from purine metabolism to cardiovascular excitation-contraction coupling.Crit Rev Biotechnol,2011.31(3):264-80。孟疆輝,陳蔚梅,利用黃嘌呤氧化酶提高病毒唑轉(zhuǎn)化率.武漢大學(xué)學(xué)報(bào)(自然科學(xué)版).1999.45(6):838-840)。

XOR廣泛存在于牛乳、鼠、鳥類等動(dòng)物、昆蟲、植物、細(xì)菌中。其中，XDH是生物體內(nèi)XOR基因轉(zhuǎn)錄翻譯的直接產(chǎn)物，是XOR在體內(nèi)的主要存在狀態(tài)。XOD是由前體蛋白XDH經(jīng)過(guò)翻譯后修飾轉(zhuǎn)變而來(lái)，XOD利用分子O2作為電子受體，但失去了XDH所具有的利用NAD作為電子受體的能力(NishinoTomoko,OkamotoKen,Kawaguchi Yuko,HoriHiroyuki,Matsumura Tomohiro,Eger Bryan T.,Pai,Emil F.,Nishino,Takeshi.Mechanism of the conversion of xanthine dehydrogenase to xanthine oxidase:identification of the two cysteine disulfide bonds and crystal structure of a non-convertible rat liver xanthine dehydrogenase mutant.The Journal of Biological Chemistry,2005,280(26):24888-94)。目前商品化XOR主要是提取法生產(chǎn)的XOD，例如Sigma公司從牛奶奶油中提取的牛奶XOD，日本TOYOBO公司從野生藤黃節(jié)桿菌中提取的細(xì)菌XOD。特別是牛奶XOD與其他酶類聯(lián)用于樣品檢測(cè)，這包括黃嘌呤和次黃嘌呤的檢測(cè)，與嘌呤核苷磷酸化酶(PNP)聯(lián)用檢測(cè)無(wú)機(jī)磷酸，與PNP和過(guò)氧化物酶(POD)聯(lián)用檢測(cè)腺苷脫氨酶和5`-核苷酸酶等。然而，在XOD的臨床診斷應(yīng)用 中，往往由于樣品溶液中溶解氧含量受到溫度、壓力、鹽分和有機(jī)物含量等因素影響，造成檢測(cè)結(jié)果的不準(zhǔn)確性。同樣地，在規(guī)?；瘧?yīng)用XOD酶法催化或含XOD酶全細(xì)胞生物轉(zhuǎn)化生成核苷類藥物以及降解雜化類有機(jī)污染物質(zhì)過(guò)程中，催化轉(zhuǎn)化過(guò)程往往受到溶解氧含量的影響。相比較而言，XDH利用NAD作為電子受體，不受溶解氧的影響，可以更好地滿足這些特定應(yīng)用需求。

研究表明，XDH主要包括以牛奶XDH為代表的真核XDH和以莢膜紅細(xì)菌XDH為代表的細(xì)菌XDH兩大類。牛奶XDH經(jīng)過(guò)胰蛋白酶等蛋白酶的部分酶解或者氧化形成二硫鍵自發(fā)轉(zhuǎn)變成為XOD，而莢膜紅細(xì)菌XDH是一種純粹的XDH。莢膜紅細(xì)菌XDH催化活性比牛奶XOD/XDH至少高5倍(LeimkühlerSilke,HodsonRachael,George Graham N,Rajagopalan K.V.Recombinant Rhodobacter capsulatus xanthine dehydrogenase,a useful model system for the characterization of protein variants leading to xanthinuria I in humans.Journal of Biological Chemistry,2003,278(23):20802-20811)。除高的催化活性外，微生物XDH具有比真核XDH更高的溫度耐受性，更加適合于商業(yè)化應(yīng)用。然而，迄今為止除了牛和雞來(lái)源真核XDH可以從商業(yè)途徑獲取，比如美國(guó)MyBioSource公司提供的牛XDH，但是價(jià)格昂貴、產(chǎn)量有限而且活性低，尚未見(jiàn)到商品化微生物來(lái)源XDH。因此，開發(fā)新型微生物XDH、將其替代XOD應(yīng)用于臨床檢測(cè)領(lǐng)域并進(jìn)一步擴(kuò)展其應(yīng)用領(lǐng)域是一項(xiàng)具有重要應(yīng)用前景的工作。

本發(fā)明人前期研究獲取了一種新的莢膜紅細(xì)菌來(lái)源XDH(申請(qǐng)?zhí)?01410764840.5，發(fā)明人邢新會(huì)、王成華、張翀，一種黃嘌呤脫氫酶及其編碼基因與應(yīng)用)，并通過(guò)基因工程手段獲取了更高催化活性的截?cái)囿w形式變體XDH(申請(qǐng)?zhí)?01510048275.7，發(fā)明人邢新會(huì)、王成華、張翀，一種黃嘌呤脫氫酶截?cái)囿w及其應(yīng)用)。隨著應(yīng)用領(lǐng)域的擴(kuò)展，有必要進(jìn)一步開發(fā)底物親和力更強(qiáng)、pH耐受范圍更高和催化效率更好的新型XDH。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

本發(fā)明的一個(gè)目的是提供一種黃嘌呤脫氫酶。

本發(fā)明提供的一種蛋白，為堿性黃嘌呤脫氫酶，其由亞基甲和亞基乙組成：

所述亞基甲的氨基酸序列為序列表中序列1或?qū)⑿蛄斜碇行蛄?所示的氨基酸序列經(jīng)過(guò)一個(gè)或幾個(gè)氨基酸殘基的取代和/或缺失和/或添加的序列；

所述亞基乙的氨基酸序列為序列表中序列2或?qū)⑿蛄斜碇行蛄?所示的氨基酸序列經(jīng)過(guò)一個(gè)或幾個(gè)氨基酸殘基的取代和/或缺失和/或添加的序列；

編碼上述蛋白的DNA分子也是本發(fā)明保護(hù)的范圍。

上述DNA分子包括所述亞基甲的編碼DNA分子和所述亞基乙的編碼DNA分子。

所述亞基甲的編碼DNA分子的核苷酸序列為序列表中序列3中第1位至第1500位或?qū)⑿蛄斜碇行蛄?中第1位至第1500位所示的堿基序列經(jīng)過(guò)一個(gè)或幾個(gè)堿基的取代和/或缺失和/或添加的序列；

所述亞基乙的編碼DNA分子的核苷酸序列為序列表中序列3中第1502位至第3877位或?qū)⑿蛄斜碇行蛄?中第1502位至第3877位所示的堿基序列經(jīng)過(guò)一個(gè)或幾個(gè)堿基的取代和/或缺失和/或添加的序列。

上述DNA分子為如下1)-4)中至少一種：

1)編碼區(qū)為序列表中序列3第1位至第3877位核苷酸所示的DNA分子；

2)編碼區(qū)為序列表中序列3的核苷酸所示的DNA分子；

3)在嚴(yán)格條件下與1)或2)限定的DNA分子雜交且編碼權(quán)利要求1所述蛋白的DNA分子；

4)與1)或2)限定的DNA分子具有90％以上的同一性且編碼權(quán)利要求1或2所述蛋白的DNA分子。

上述嚴(yán)格條件可為在6×SSC，0.5％SDS的溶液中，在65℃下雜交，然后用2×SSC，0.1％SDS和1×SSC，0.1％SDS各洗膜一次。

含有上述DNA分子的重組載體、表達(dá)盒、轉(zhuǎn)基因細(xì)胞系或重組菌也是本發(fā)明保護(hù)的范圍。

所述轉(zhuǎn)基因細(xì)胞系不包括動(dòng)物和植物的繁殖材料。

上述重組載體將序列表中序列3所示的DNA分子替換pTrc99A質(zhì)粒NcoI和HindIII酶識(shí)別位點(diǎn)間DNA片段得到的重組質(zhì)粒，命名為pTRA，即為產(chǎn)鮑氏不動(dòng)桿菌黃嘌呤脫氫酶的重組質(zhì)粒，表達(dá)黃嘌呤脫氫酶。

上述的蛋白在作為黃嘌呤脫氫酶中的應(yīng)用也是本發(fā)明保護(hù)的范圍。

上述DNA分子或上述重組載體、表達(dá)盒、轉(zhuǎn)基因細(xì)胞系或重組菌在制備黃嘌呤脫氫酶中的應(yīng)用也是本發(fā)明保護(hù)的范圍。

上述的蛋白或上述DNA分子或上述重組載體、表達(dá)盒、轉(zhuǎn)基因細(xì)胞系或重組菌在制備具有黃嘌呤脫氫酶活性的產(chǎn)品中的應(yīng)用也是本發(fā)明保護(hù)的范圍；

或上述的蛋白或上述DNA分子或權(quán)利要求5所述重組載體、表達(dá)盒、轉(zhuǎn)基因細(xì)胞系或重組菌在降解黃嘌呤或次黃嘌呤中的應(yīng)用也是本發(fā)明保護(hù)的范圍。

上述應(yīng)用中，所述黃嘌呤脫氫酶具有如下1)-3)中至少一種特性：

1)所述黃嘌呤脫氫酶的亞基構(gòu)型為(αβ)₂型；

2)所述黃嘌呤脫氫酶的最適反應(yīng)溫度為40℃～45℃；

3)所述黃嘌呤脫氫酶的最適pH值為8.5～9.0，可以耐受pH 7.0～11.0寬泛的堿性環(huán)境條件。

本發(fā)明的另一個(gè)目的是提供一種制備堿性黃嘌呤脫氫酶的方法。

本發(fā)明提供的方法，包括如下步驟：誘導(dǎo)表達(dá)上述的重組菌，得到權(quán)利要求1所述蛋白。

本發(fā)明提供的黃嘌呤脫氫酶為由大小為56kDa、序列如序列1所示的小亞基和大小為87kDa、序列如序列2所示的大亞基組成，該黃嘌呤脫氫酶體最適pH為8.5～9.0，pH6.0-12范圍內(nèi)穩(wěn)定，最適溫度為40℃～45℃，30℃～50℃范圍內(nèi)穩(wěn)定，半失活溫度為59℃；以黃嘌呤作為底物時(shí)，K_m值為23.66±1.56μM，轉(zhuǎn)化數(shù)為76.36±1.07s^-1，最大比活力可達(dá)32.12±0.45U/mg蛋白，催化效率為3.23s^-1.μM^-1；以次黃嘌呤作為底物時(shí)，K_m值為22.48±1.53μM，轉(zhuǎn)化數(shù)為98.85±1.31s^-1，最大比活力可達(dá)41.58±0.55U/mg蛋白，催化效率為4.40s^-1.μM^-1。

本發(fā)明的實(shí)驗(yàn)證明，本發(fā)明提供的黃嘌呤脫氫酶，與已經(jīng)報(bào)道的黃嘌呤脫氫酶相比，至少可以耐受到pH 11.0的更加堿性的pH范圍，催化效率更高，底物親和力更強(qiáng)。例如，在酶學(xué)信息數(shù)據(jù)庫(kù)中(BREDA，http：//www.brenda-enzymes.org/enzyme.php？ecno＝1.17.1.4.)，只有Streptomyces cyanogenus，Veillonella atypica和Triticum aestivum少數(shù)XDH的最適pH值為8.5以上，而pH耐受范圍均在pH 6.0-9.2之間。典型的例子包括，莢膜紅細(xì)菌XDH的最適pH為8.0-8.5，pH耐受范圍為pH 5.5-10，TOYOBO公司出品的藤黃節(jié)桿菌XOD最適pH為7.5-8.0，pH耐受范圍為pH 6.0-9.0，而Sigma公司出品的商品化牛XOD最適pH為8.0-8.4，pH耐受范圍為pH 7.0-9.0(李忠琴,許小平,王武.奶油黃嘌呤氧化酶的酶學(xué)性質(zhì)研究，食品科學(xué),2008(09)：420-422)。

特別需要指出的是，雖然美國(guó)國(guó)家生物技術(shù)信息中心(NCBI)數(shù)據(jù)庫(kù)中已經(jīng)收錄了一些鮑氏不動(dòng)桿菌基因組序列信息，其中一些序列被注釋為黃嘌呤脫氫酶活性(Xanthine dehydrogenase)，與本發(fā)明提供的序列1，序列2和序列3具有較高的同源性，但是所有這些已有的序列信息均沒(méi)有經(jīng)過(guò)實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證，均為理論推測(cè)結(jié)果。為了進(jìn)一步說(shuō)明本發(fā)明的創(chuàng)新性，本發(fā)明對(duì)NCBI中同源性最高的Acinetobacter baumannii AB307-0294 XdhB(GI:446999566)和XdhA(GI:446816421)進(jìn)行了基因合成，兩者與本發(fā)明序列3對(duì)應(yīng)區(qū)域的序列同源性分別為94.7％和95.5％，氨基酸序列與序列1和序列2的同源性分別為98.7％和 97.4％，分別對(duì)應(yīng)15和20個(gè)不同的氨基酸。采用與本發(fā)明相同的方法進(jìn)行表征結(jié)果表明，與Acinetobacter baumannii AB307-0294XDH相比，本發(fā)明所提供的XDH催化活性高25％以上，pH耐受范圍更加寬泛。

本發(fā)明提供的鮑氏不動(dòng)桿菌堿性黃嘌呤脫氫酶，為首次報(bào)道的經(jīng)過(guò)實(shí)驗(yàn)證實(shí)的鮑氏不動(dòng)桿菌屬黃嘌呤脫氫酶類。本發(fā)明提供的堿性黃嘌呤脫氫酶可以適應(yīng)堿性測(cè)定條件的樣品，解決已有黃嘌呤脫氫酶/氧化酶pH有效作用范圍的問(wèn)題。該堿性黃嘌呤脫氫酶具有更高的底物親和力，和最高的催化效率，因此可以更加靈敏地降解和檢測(cè)次黃嘌呤/黃嘌呤。

本發(fā)明的另一個(gè)目的是提供一種應(yīng)用黃嘌呤脫氫酶的方法。

為達(dá)到上述發(fā)明目的，本發(fā)明采用的一個(gè)技術(shù)方案是檢測(cè)樣品中次黃嘌呤/黃嘌呤含量的方法，包括以下步驟：

1)將樣品與主要由堿性黃嘌呤脫氫酶、氧化型輔酶、緩沖試劑組成的試劑混合，使之發(fā)生如下反應(yīng)：

2)檢測(cè)主波長(zhǎng)295nm處產(chǎn)物尿酸的增加量，或者在340nm處NADH的增加量，計(jì)算樣品中次黃嘌呤/黃嘌呤含量，優(yōu)選的是340nm處NADH變化檢測(cè)。

其中，步驟1)所述樣品具體可以是按照常規(guī)體檢抽取的血清，尿液，肌肉組織等，或者是水產(chǎn)品如魚類的肌肉組織等，或者水果蔬菜等植物組織；

所述XDH可以為堿性黃嘌呤脫氫酶，其特征序列如SEQ ID:1所示；

檢測(cè)體系pH值在堿性范圍內(nèi)，具體為pH 7.0-12之間，，優(yōu)選的是pH 7.5-10.5之間；反應(yīng)條件為溫度在15-50℃之間，優(yōu)選的是25-40℃之間；反應(yīng)時(shí)間為1-60min之間；

樣品與試劑的比例可以是1/2到1/200之間。

所述步驟2)為，將最終反應(yīng)物置于紫外/可見(jiàn)分光光度分析儀或者半、全自動(dòng)生化分析儀上，通過(guò)產(chǎn)物變化對(duì)酶活進(jìn)行定量的方法，可以是通過(guò)295nm處吸光度變化檢測(cè)尿酸的變化量，或者在340nm處檢測(cè)NADH的變化量，優(yōu)選的是通過(guò)340nm處NADH變化。

所述定量樣品中次黃嘌呤/黃嘌呤的方法，是采用標(biāo)準(zhǔn)曲線的方法，通過(guò)測(cè)定不同濃度標(biāo)準(zhǔn)品黃嘌呤在相同反應(yīng)體系下吸光度的變化，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，然后根據(jù)樣品對(duì)應(yīng)的吸光度變化推算出次黃嘌呤/黃嘌呤的含量。

本發(fā)明的另一個(gè)目的是提供一種包含黃嘌呤脫氫酶的檢測(cè)試劑盒。所述試劑盒包 括：XDH酶、氧化型輔酶、黃嘌呤標(biāo)準(zhǔn)品、緩沖體系、穩(wěn)定劑；成份組成如下：

堿性黃嘌呤脫氫酶 40-40000U/L；

緩沖液 10-1000mmol/L，優(yōu)選的為 50-200mmol/L；

氧化型輔酶 0.1-20mmol/L；

黃嘌呤標(biāo)準(zhǔn)品 0.001-20mmol/L；

穩(wěn)定劑 0.1-80％(總體積)。

所述試劑盒特征在于：

其中，所述XDH酶為序列SEQ ID NO:1。

所述緩沖劑的pH范圍為pH 7.0-12.0，優(yōu)選pH 7.4-9.0，所述緩沖試劑是三(羥甲基)氨基甲烷-鹽酸緩沖液、三(羥甲基)氨基甲烷-二氨基乙烷四乙酸緩沖液、磷酸鹽緩沖液、三乙醇胺緩沖液、2-氨基-2-甲基-1-丙醇緩沖液、咪唑緩沖液、雙甘氨肽緩沖液或甘氨酸-鹽酸緩沖液中的一種。

所述氧化型輔酶是NAD⁺、NADP、thio-NAD⁺氧化型煙酰胺輔酶或其衍生物中的一種。

所述穩(wěn)定劑為乙二醇、丙二醇、甘油、海藻糖、聚糖、聚醇、硫酸銨、牛血清白蛋白(BSA)、氧嗪酸鉀或鹽中的至少一種。

用以實(shí)現(xiàn)本發(fā)明方法的次黃嘌呤/黃嘌呤診斷試劑盒可以是雙劑或三劑，其中雙劑包括：

試劑I

堿性黃嘌呤脫氫酶 40-40000U/L；

緩沖液 10-1000mmol/L，優(yōu)選的為 50-200mmol/L；

氧化型輔酶 0.1-20mmol/L；

穩(wěn)定劑 0.1-80％(總體積)。

試劑II

黃嘌呤標(biāo)準(zhǔn)品 0.001-20mmol/L。

也可以將上述試劑配成三劑，更有利于消除內(nèi)、外源次黃嘌呤及黃嘌呤污染，同時(shí)有利于穩(wěn)定試劑：

試劑I

堿性黃嘌呤脫氫酶 40-40000U/L；

緩沖液 10-1000mmol/L，優(yōu)選的為 50-200mmol/L；

穩(wěn)定劑 0.1-80％(總體積)。

試劑II

氧化型輔酶 0.1-20mmol/L；

緩沖液 10-1000mmol/L，優(yōu)選的為 50-200mmol/L；

穩(wěn)定劑 0.1-80％(總體積)。

試劑III

黃嘌呤標(biāo)準(zhǔn)品 0.001-20mmol/L。

三劑的配方不僅限于上述配方，其中的試劑I中堿性黃嘌呤脫氫酶可以和試劑II中氧化型輔酶放在一起，而將穩(wěn)定試和緩沖溶液放在一起，如此形成多種配方，不再詳述。

為減少試劑之間交叉影響和保持試劑穩(wěn)定以及便于儲(chǔ)存，所述試劑盒可以單組分形式存在。

此外，為了減少各試劑成份之間的交叉影響、保持試劑的穩(wěn)定性，以便長(zhǎng)期儲(chǔ)存，以上單劑、雙劑的試劑I、試劑II或三劑的試劑I、試劑II、試劑III中通常加入濃度為0.1－80％或者10-100mmol/L的穩(wěn)定劑，穩(wěn)定劑可以是乙二醇、丙二醇、甘油、海藻糖、聚糖、聚醇、硫酸銨、牛血清白蛋白(BSA)或鹽中的至少一種。

應(yīng)當(dāng)理解的是，本發(fā)明提供的檢測(cè)試劑盒可以很方便與其他酶類聯(lián)用擴(kuò)展檢測(cè)范圍，例如可以與嘌呤核苷磷酸化酶(PNP)聯(lián)用檢測(cè)無(wú)機(jī)磷酸，與PNP和過(guò)氧化物酶(POD)聯(lián)用檢測(cè)腺苷脫氨酶和5`-核苷酸酶等。這些都應(yīng)該屬于本發(fā)明保護(hù)的范圍。

本發(fā)明提供的鮑氏不動(dòng)桿菌堿性黃嘌呤脫氫酶，具有不依賴于分子氧(黃嘌呤脫氫酶利用NAD作為電子受體，不管是否存在氧氣均可以發(fā)生反應(yīng))、寬泛的pH作用范圍和耐受性、和寬泛的溫度作用范圍的特性，有利于與其他酶類聯(lián)用進(jìn)一步開發(fā)新的應(yīng)用領(lǐng)域，尤其適合于樣品檢測(cè)，包括黃嘌呤和次黃嘌呤的檢測(cè)，PNP酶的檢測(cè)和5`-核苷酸酶的檢測(cè)，以及與PNP酶聯(lián)用檢測(cè)無(wú)機(jī)磷酸、腺苷脫氨酶，同時(shí)適合于工業(yè)化應(yīng)用，包括降解病毒唑等核苷類藥物生產(chǎn)過(guò)程中產(chǎn)生的次黃嘌呤等副產(chǎn)物、以及降解嘌呤、蝶啶和醛類等多種含sp2雜化的碳原子的雜環(huán)分子類有機(jī)污染物等商業(yè)化應(yīng)用。本發(fā)明提供的黃嘌呤脫氫酶的應(yīng)用領(lǐng)域可以拓展至其它催化底物，例如其它嘌呤、蝶啶、雜環(huán)分子和醛類在內(nèi)的多種底物的氧化反應(yīng)，和亞甲基藍(lán)、苯醌、高鐵氰化物和硝酸鹽等多種類型的電子受體，進(jìn)一步將該黃嘌呤脫氫酶應(yīng)用于生物傳感器領(lǐng)域。

由于上述技術(shù)方案應(yīng)用，本發(fā)明與現(xiàn)有技術(shù)相比具有下列優(yōu)點(diǎn)：1)底物親和力高，有利于結(jié)合和檢測(cè)低濃度底物；2)催化效率高，有利于減少酶使用量降低成本，有利于減 少作用時(shí)間，提高工作效率；3)最適pH為堿性，可以耐受堿性pH值，有利于擴(kuò)大應(yīng)用領(lǐng)域；4)不依賴于氧氣，對(duì)樣品處理和檢測(cè)體系條件依賴少，不受樣品溶氧狀態(tài)的影響，操作簡(jiǎn)便結(jié)果準(zhǔn)確；5)檢測(cè)體系組分少，減少了檢測(cè)步驟，降低了測(cè)試成本；6)檢測(cè)應(yīng)用過(guò)程不需要特殊額外的儀器。因此，本發(fā)明提供的黃嘌呤脫氫酶及其在檢測(cè)試劑盒中的應(yīng)用，更便于推廣應(yīng)用。

附圖說(shuō)明

圖1為純化的重組鮑氏不動(dòng)桿菌黃嘌呤脫氫酶SDS-PAGE電泳圖。

圖2為純化的黃嘌呤脫氫酶的酶活(A)和穩(wěn)定性(B)隨溫度變化圖。

圖3為純化的黃嘌呤脫氫酶的酶活(A)和穩(wěn)定性(B)隨pH變化圖。

圖4為純化的黃嘌呤脫氫酶催化反應(yīng)速度隨黃嘌呤(A)和次黃嘌呤(B)濃度變化圖。

圖5為純化的黃嘌呤脫氫酶降解黃嘌呤和次黃嘌呤底物隨時(shí)間變化圖，A為尿酸檢測(cè)法；B為NADH檢測(cè)法。

圖6為黃嘌呤脫氫酶法檢測(cè)胎牛血清中黃嘌呤含量的檢測(cè)值與真實(shí)值的相關(guān)性圖(B)及黃嘌呤含量標(biāo)準(zhǔn)曲線圖(A)。

圖7為試劑盒法檢測(cè)人血清中黃嘌呤含量的檢測(cè)值與真實(shí)值相關(guān)性圖，A為黃嘌呤含量標(biāo)準(zhǔn)曲線圖；B為本發(fā)明試劑盒；C為Sigma公司試劑盒。

圖8為試劑盒法檢測(cè)人尿液中黃嘌呤含量檢測(cè)值與真實(shí)值相關(guān)性圖，A為本發(fā)明試劑盒；B為Sigma公司試劑盒。

具體實(shí)施方式

下述實(shí)施例中所使用的實(shí)驗(yàn)方法如無(wú)特殊說(shuō)明，均為常規(guī)方法。

下述實(shí)施例中所用的材料、試劑、試劑盒等，如無(wú)特殊說(shuō)明，均可從商業(yè)途徑得到。

基因來(lái)源菌株為鮑氏不動(dòng)桿菌(Acinetobacter baumannii)，購(gòu)自中國(guó)工業(yè)微生物菌種保藏管理中心(CICC)，菌株編號(hào)為CICC 10254。

pTrc99A為中國(guó)質(zhì)粒載體菌株細(xì)胞株基因保藏中心Biovector Science Lab,Inc.產(chǎn)品，產(chǎn)品目錄號(hào)為Biovector108321(GenBank登錄號(hào)為M22744.1，Amann,E.,Ochs,B.and Abel,K.J.Tightly regulated tac promoter vectors useful for the expression of unfused and fused proteins in Escherichia coli.Gene,1988,69(2):301-315.)。

重組質(zhì)粒pTRAN為將序列3所示的DNA分子在5`端引入6x組氨酸純化標(biāo)簽編碼編 碼序列后，插入pTrc99A載體NcoI和Hind III雙酶切位點(diǎn)得到的載體。

含pTRAN重組質(zhì)粒的工程化大腸桿菌DH5α，將重組質(zhì)粒pTRAN轉(zhuǎn)入工程化大腸桿菌DH5α中，得到重組菌。

鎳離子金屬鰲合親和層析介質(zhì)－鎳柱親和樹脂為Qiagen公司產(chǎn)品，產(chǎn)品目錄號(hào)為30210。

黃嘌呤和次黃嘌呤為Sigma公司產(chǎn)品，產(chǎn)品目錄號(hào)分別為Sigma X7375-10g和Sigma H9377。

NAD和NADH均為Sigma公司產(chǎn)品，產(chǎn)品目錄號(hào)分別為Sigma N1636和N1161。

下述實(shí)施例中的黃嘌呤脫氫酶均是指實(shí)施例1制備的鮑氏不動(dòng)桿菌堿性黃嘌呤脫氫酶，簡(jiǎn)記為AbXDH，其組成大亞基和小亞基分別簡(jiǎn)記為AbXDHB和AbXDHA。

實(shí)施例1、黃嘌呤脫氫酶及編碼基因的獲得

一、黃嘌呤脫氫酶編碼基因的獲得及重組質(zhì)粒pTRAN的構(gòu)建

1、提取鮑氏不動(dòng)桿菌基因組DNA

用接種環(huán)挑取一環(huán)保藏于瓊脂斜面上的鮑氏不動(dòng)桿菌(購(gòu)自中國(guó)工業(yè)微生物菌種保藏管理中心(CICC)，菌株編號(hào)為CICC 10254)，在固體培養(yǎng)基(配方為：蛋白胨5.0g，牛肉浸取物3.0g，NaCl 5.0g，瓊脂15.0g，蒸餾水1.0L，pH7.0)平板上劃線，然后倒置37℃培養(yǎng)箱中靜止培養(yǎng)16h；挑取單菌落接種于5ml液體培養(yǎng)基(配方為：蛋白胨5.0g，牛肉浸取物3.0g，NaCl 5.0g，蒸餾水1.0L，pH7.0)，于37℃、220rpm搖床中培養(yǎng)過(guò)夜；用細(xì)菌基因組DNA提取試劑盒(OMEGA公司，產(chǎn)品代碼D3350-01)提取基因組總DNA。

2、設(shè)計(jì)并合成如下引物

根據(jù)NCBI中公布的鮑氏不動(dòng)桿菌基因組數(shù)據(jù)，設(shè)計(jì)如下引物對(duì)(pTRAN-gS1和pTRAN-gA2)序列擴(kuò)增黃嘌呤脫氫酶基因，

上游引物pTRAN-gS1：

5’-CACAACAGACCTTAGAACGTCCAATCACCTTCTTTTTTCGTGGTGGTC-3’(SEQ ID NO:4)

(下劃線所示序列為Gibsen連接互補(bǔ)區(qū)域，與pTrc99A載體序列一致，粗體下劃線部分為RBS序列，粗體部分序列為起始密碼子，斜體部分為組氨酸純化標(biāo)簽編碼區(qū)域，正體部分為與黃嘌呤脫氫酶基因互補(bǔ)配對(duì)序列)

下游引物pTRAN-gA2：

5’-CCAAAACAGCCAAGCTTATTTTTTTACATCAAATACCTGTAATAATTGAGCAAC-3’(SEQ ID NO:5)

(下劃線所示序列為Gibsen連接互補(bǔ)區(qū)域，與pTrc99A載體序列一致，粗體下劃線所示序列為終止密碼子，正體部分為與黃嘌呤脫氫酶基因互補(bǔ)配對(duì)序列)

設(shè)計(jì)如下引物對(duì)(pTRAN-gA1和pTRAN-gS2)擴(kuò)增pTrc99A質(zhì)粒NcoI和Hind III酶切位點(diǎn)之間大片段序列，

上游引物pTRAN-gA1：

5’-GATG-3’(SEQ ID NO:6)

(下劃線所示序列為Gibsen連接互補(bǔ)區(qū)域，斜體部分與pTrc99A載體序列一致)

下游引物pTRAN-gS2：

5’-AATGAT-3’(SEQ ID NO:7)

(下劃線所示序列為用于Gibsen連接的互補(bǔ)區(qū)域，斜體部分與pTrc99A載體序列一致)

3、PCR產(chǎn)物的擴(kuò)增

以步驟1提取的鮑氏不動(dòng)桿菌基因組總DNA為模板，以上述2合成的上游引物pTRAN-gS1和下游引物pTRAN-gA2為引物，進(jìn)行PCR擴(kuò)增，得到4918bp PCR產(chǎn)物，即為含有完整黃嘌呤脫氫酶基因簇的基因片段。

25μl PCR反應(yīng)體系：10ng基因組總DNA,2.5μl上游引物，2.5μl下游引物，5μl 5x Q5 Reaction buffer，5μl5x Q5 High GC enhancer，2μl dNTPs(各2.5mM)，0.5U Q5 DNA polymerase，ddH₂O補(bǔ)齊至25μl。

PCR反應(yīng)程序?yàn)椋?8℃預(yù)變性1min，98℃ 10s，62℃ 5s，72℃ 2.5min，循環(huán)30次，最后72℃退火10min。

以質(zhì)粒pTrc99A DNA為模板，以上述步驟2合成的上游引物pTRAN-gA1和下游引物pTRAN-gS2為引物，進(jìn)行PCR擴(kuò)增，得到4092bp PCR產(chǎn)物，即為含有pTrc99A母核上NcoI和Hind III間DNA大片段。

25μl PCR反應(yīng)體系：1ng質(zhì)粒pTrc99A DNA,2.5μl上游引物，2.5μl下游引物，5μl5x Q5 Reaction buffer，5μl5x Q5 High GC enhancer，2μl dNTPs(各2.5mM)，0.5U Q5 DNA polymerase，ddH₂O補(bǔ)齊至25μl。

PCR反應(yīng)程序?yàn)椋?8℃預(yù)變性1min，98℃ 10s，62℃ 5s，72℃ 2min，循環(huán)30次，最后72℃退火10min。

將上述獲得的PCR產(chǎn)物各加入10U DpnI酶，于37℃水浴溫浴1h以消解掉甲基化 的模板質(zhì)粒。利用膠回收試劑盒(Gel Extraction kit,OMEGA公司產(chǎn)品代碼D2500-02)分別對(duì)黃嘌呤脫氫酶基因大片段(4918bp)和pTrc99A大片段(4092bp)進(jìn)行純化回收。

4、重組質(zhì)粒pTRAN的構(gòu)建

利用Gibsencloning kit(NEB公司，產(chǎn)品代碼E5510)構(gòu)建重組質(zhì)粒pTRAN。10μl反應(yīng)體系構(gòu)建如下：5μl GibsonMaster Mix，2.5μl黃嘌呤脫氫酶基因大片段，2.5μl pTrc99A大片段。將10μl反應(yīng)體系混勻后，置于50℃恒溫反應(yīng)20min，然后采用常規(guī)分子生物學(xué)操作，將反應(yīng)體系直接轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α感受態(tài)細(xì)胞，轉(zhuǎn)化產(chǎn)物涂布含氨芐青霉素(100μg/ml)的LB固體培養(yǎng)基，倒置于37℃恒溫培養(yǎng)箱培養(yǎng)16h。挑選陽(yáng)性克隆并提取質(zhì)粒測(cè)序，結(jié)果質(zhì)粒為將序列表中SEQ ID NO：3所示的DNA分子替換pTrc99A質(zhì)粒NcoI和HindIII酶識(shí)別位點(diǎn)間DNA片段得到的重組質(zhì)粒，命名為pTRAN，即為產(chǎn)鮑氏不動(dòng)桿菌細(xì)菌黃嘌呤脫氫酶的重組質(zhì)粒，表達(dá)黃嘌呤脫氫酶。

序列表中SEQ ID NO：3所示的DNA分子，自第1位至第3877位為黃嘌呤脫氫酶的編碼基因，第3884位至第4867位為黃嘌呤脫氫酶伴侶蛋白的編碼基因，該黃嘌呤脫氫酶伴侶蛋白的氨基酸序列如序列8所示，大小為37kDa。

黃嘌呤脫氫酶的編碼基因中，序列3第1位至第1500位為黃嘌呤脫氫酶體的小亞基的編碼基因序列，該小亞基的氨基酸序列如序列1所示，大小為約56kDa；第1502位至第3877位為黃嘌呤脫氫酶體的大亞基的編碼基因序列，該大亞基的氨基酸序列如序列2所示，大小為87kDa。

二、黃嘌呤脫氫酶的純化

1、將上述一得到的pTRAN轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α，得到重組菌，挑取重組菌單菌落，接種于5ml含有100μg/ml氨芐青霉素的LB液體培養(yǎng)基中，于37℃、220r/min條件下培養(yǎng)過(guò)夜。將過(guò)夜培養(yǎng)的菌液，按照1％的接種量轉(zhuǎn)接于500ml含100μg/mL氨芐青霉素的LB液體培養(yǎng)基中，于37℃、220r/min條件下培養(yǎng)，待菌液培養(yǎng)至OD600為0.6左右，加入終濃度為1mmol/L的IPTG誘導(dǎo)劑，同樣條件下繼續(xù)誘導(dǎo)培養(yǎng)16h。

2、將步驟1得到的菌液9000r/min、4℃離心，收集沉淀，得到誘導(dǎo)表達(dá)的工程菌，沉淀用50mmol/L磷酸鹽緩沖液(pH 7.5)洗滌一次后，重懸于100ml同樣的緩沖液中，得到菌懸液，將菌懸液通過(guò)高壓細(xì)胞破碎機(jī)JN-10HC(廣州聚能生物科技有限責(zé)任公司)破胞，流速10L/H，4℃，壓力為150MPa，破胞液于12000r/min、4℃下離心30min，上清液為粗酶液。

3、金屬螯合層析法純化黃嘌呤脫氫酶

(1)在上述2獲得的粗酶液中加入終濃度為300mmol/L的NaCl和5mmol/L的咪唑，并用0.22μm濾膜過(guò)濾，得到濾液；

(2)將總體積為40ml的濾液上樣至鎳柱親和樹脂，依次用含10mmol/L、30mmol/L和50mmol/L咪唑的50mmol/L pH 7.5磷酸緩沖液洗滌雜蛋白，每次洗脫的體積至少為20個(gè)柱體積，然后用含120mmol/L咪唑的50mmol/L pH 7.5磷酸緩沖液洗脫，收集洗脫液為目的重組酶，以上洗脫的流速均為2.5ml/min。

(3)將洗脫的目的重組酶通過(guò)分子截留量為10KDa的Millipore超濾管，用50mmol/L pH 7.5Tris鹽酸緩沖溶液反復(fù)換洗三次以除去鹽分及咪唑成份后，得到濃縮酶液，再將其重懸于50mmol/L pH 7.5Tris鹽酸緩沖液中，得到純化黃嘌呤脫氫酶。

將黃嘌呤脫氫酶進(jìn)行變性聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)檢測(cè)，結(jié)果如圖1所示，結(jié)果表明，黃嘌呤脫氫酶由大小約為56kDa的小亞基(AbXDHA)和大小約為87kDa的大亞基(AbXDHB)這兩種亞基組成。純化酶中不含有大小約為37kDa的伴侶蛋白。

實(shí)施例2、AbXDH作為黃嘌呤脫氫酶的表征

1、黃嘌呤脫氫酶酶活性的測(cè)定方法

基于黃嘌呤脫氫酶催化如下反應(yīng)(反應(yīng)式1和反應(yīng)式2)，NADH的生成與酶的催化過(guò)程存在嚴(yán)格的化學(xué)計(jì)量關(guān)系，因此可以通過(guò)產(chǎn)物NADH的生成速度對(duì)酶活進(jìn)行精確表征。因?yàn)镹ADH在340nm處有特異性吸收，本發(fā)明通過(guò)分光光度法對(duì)酶活性進(jìn)行測(cè)定。

2mL黃嘌呤脫氫酶酶活性的測(cè)定反應(yīng)體系如表1所示。

表1黃嘌呤脫氫酶酶活測(cè)定的2mL反應(yīng)體系組成

將表1中的2mL反應(yīng)體系中除黃嘌呤脫氫酶水溶液外的其余試劑混勻后置于40℃水浴溫浴5min，然后加入100μL黃嘌呤脫氫酶水溶液?jiǎn)?dòng)反應(yīng)。在40℃條件下邊反應(yīng)邊記錄反應(yīng)3-5min內(nèi)OD₃₄₀吸光值變化，計(jì)算反應(yīng)曲線最初線性部分的吸光度隨時(shí)間變化速率(ΔOD₃₄₀/min)，吸光度隨時(shí)間變化速率(ΔOD₃₄₀/min)反映的是黃嘌呤脫氫酶水溶液生成NADH的速率。

按照下述公式計(jì)算所檢測(cè)的黃嘌呤脫氫酶的酶活和比酶活。

酶活(U/ml)＝ΔOD₃₄₀/min×3.21543×df (公式1)

比酶活(U/mg)＝(U/ml)×1/C (公式2)

公式1中3.21543為采用消光系數(shù)法將上述2ml反應(yīng)體系中NADH從吸光度變化轉(zhuǎn)化為摩爾濃度的計(jì)算系數(shù)，該系數(shù)計(jì)算方法為：

$\frac{\mathrm{Vt}}{Vs\×1.0cm\×6.22}=\frac{2.0ml}{0.1ml\×1.0cm\×6.22{\mathrm{cm}}^2/\mathrm{\μ}mol}=3.21543\mathrm{\μ}mol.{\mathrm{ml}}^{-1}$ (公式3)

其中：Vt為反應(yīng)總體積(2.0ml)，Vs為反應(yīng)體系中酶液體積(0.1ml)，6.22為測(cè)定條件下NADH的摩爾消光系數(shù)(cm²/μmol)，1.0cm為測(cè)定比色杯光程。

公式1中df為酶液稀釋倍數(shù)。

公式2中C為酶液的濃度，單位為mg/ml。

酶活力單位(U)定義：在測(cè)定溫度和pH值條件下每分鐘轉(zhuǎn)化生成1μmol NADH所需要的酶量。

2、最適溫度和溫度耐受性的測(cè)定

檢測(cè)由實(shí)施例1中制備的AbXDH是否具有黃嘌呤脫氫酶活性及其最適溫度和溫度耐受性。

將上述1的方法中的黃嘌呤脫氫酶分別替換為實(shí)施例1中制備的AbXDH。

最適溫度的測(cè)定通過(guò)將表1的200μl反應(yīng)體系分別置于25-80℃區(qū)間范圍內(nèi)測(cè)定酶活，方法同步驟1，僅將水浴溫度替換為25-80℃區(qū)間，相對(duì)酶活用殘余酶活相對(duì)于最大酶活的百分比來(lái)表示，最適溫度用相對(duì)酶活的最大值對(duì)應(yīng)的溫度表示。

實(shí)施例1制備的AbXDH活性隨反應(yīng)溫度變化曲線如圖2A所示，表明，其最適反應(yīng)溫度為40℃～45℃。

溫度耐受性的測(cè)定是通過(guò)將實(shí)施例1制備的AbXDH在25-80℃區(qū)間不同溫度下分別處理30min，然后采用步驟1中的方法測(cè)定殘余酶活，相對(duì)酶活用殘余酶活性相對(duì)于未經(jīng)過(guò)處理的黃嘌呤脫氫酶的酶活性的百分比來(lái)表示。以相對(duì)殘余酶活為縱坐標(biāo)，以處理溫度為橫坐標(biāo)，進(jìn)行S型曲線(Sigmoidal)曲線擬合，求出相對(duì)殘余酶活為50％時(shí)對(duì)應(yīng)的處理溫度，記為半失活溫度()，用以表征溫度耐受性。

實(shí)施例1制備的重組黃嘌呤脫氫酶溫度耐受性的測(cè)定結(jié)果如圖2B所示，表明，在25-60℃以下，重組黃嘌呤脫氫酶保持穩(wěn)定，對(duì)應(yīng)的值為59℃。

3、最適pH和pH耐受性的測(cè)定

最適pH值通過(guò)測(cè)定pH 4.0-11.0范圍內(nèi)的相對(duì)酶活，用最大酶活對(duì)應(yīng)的pH值表示。具體是將表1中反應(yīng)體系中最終濃度為0.05M的pH 8.5Tris鹽酸緩沖溶液分別替換為pH 4.0-5.8的0.05M乙酸緩沖體系、pH 5.8-8.0的0.05M磷酸緩沖體系、pH 7.5-9.0的0.05M的Tris鹽酸緩沖體系和pH 9.0-11.0的0.05M的碳酸鈉緩沖體系進(jìn)行測(cè)定。以野生型黃嘌呤脫氫酶為對(duì)照。

結(jié)果如圖3A所示，表明，黃嘌呤脫氫酶的最適pH值為8.5～9.0。

pH耐受性的測(cè)定是通過(guò)將黃嘌呤脫氫酶置于pH 4.0-11.0區(qū)間不同pH值0.05M緩沖溶液(pH 4.0-5.8為0.05M乙酸緩沖體系；pH 5.8-8.0為0.05M磷酸緩沖體系；pH 7.5-9.0為Tris鹽酸緩沖體系；pH 9.0-11.0為碳酸鈉緩沖體系)中，于室溫放置16h。然后采用步驟 1中的方法測(cè)定殘余酶活，相對(duì)酶活用殘余酶活性相對(duì)于未經(jīng)過(guò)處理的黃嘌呤脫氫酶的酶活性的百分比來(lái)表示。

結(jié)果如圖3B所示，表明，在pH 6.0-11.0范圍內(nèi)，黃嘌呤脫氫酶保持穩(wěn)定，在高達(dá)pH 11.0的堿性條件下酶活基本不變。

4、酶促動(dòng)力學(xué)參數(shù)

按照步驟1的方法測(cè)定實(shí)施例1的AbXDH的酶活力。在最適pH 8.5和最適溫度40℃條件下，0.001-1mM濃度范圍，AbXDH降解黃嘌呤和次黃嘌呤的最初反應(yīng)速度符合米氏動(dòng)力學(xué)方程。

結(jié)果如圖4所示，A為初反應(yīng)速度隨黃嘌呤濃度變化圖，B為初反應(yīng)速度隨黃嘌呤濃度變化圖。按照米氏方程進(jìn)行非線性擬合，結(jié)果表明，以黃嘌呤作為底物時(shí)，K_m值為23.66±1.56μM，轉(zhuǎn)化數(shù)為76.36±1.07s^-1，最大比活力可達(dá)32.12±0.45U/mg蛋白，催化效率為3.23s^-1.μM^-1；以次黃嘌呤作為底物時(shí)，K_m值為22.48±1.53μM，轉(zhuǎn)化數(shù)為98.85±1.31s^-1，最大比活力可達(dá)41.58±0.55U/mg蛋白，催化效率為4.40s^-1.μM^-1。

實(shí)施例3、黃嘌呤脫氫酶在降解黃嘌呤和次黃嘌呤以及處理含該類底物的材料中的應(yīng)用

參照表1中黃嘌呤脫氫酶反應(yīng)體系的構(gòu)建方法，構(gòu)建如下a)至c)三組反應(yīng)體系：

a)50mM Tris-HCl緩沖溶液(pH 7.5)，分別含終濃度為1mM的EDTA，0.1mM的氧嗪酸鉀，0.1mM的煙酰胺腺嘌呤二核苷酸(NAD⁺)，0.1mM的黃嘌呤和0.216mg/L實(shí)施例1制備的黃嘌呤脫氫酶；

b)50mM Tris-HCl緩沖溶液(pH 8.5)，分別含終濃度為1mM的EDTA，0.1mM的氧嗪酸鉀，0.1mM的煙酰胺腺嘌呤二核苷酸(NAD⁺)，0.1mM的黃嘌呤，和0.216mg/L實(shí)施例1制備的黃嘌呤脫氫酶；

c)50mM Tris-HCl緩沖溶液(pH 8.5)，分別含終濃度為1mM的EDTA，0.1mM的氧嗪酸鉀，0.1mM的煙酰胺腺嘌呤二核苷酸(NAD⁺)，0.1mM的次黃嘌呤，和0.216mg/L實(shí)施例1制備的黃嘌呤脫氫酶體；

分別將a)和c)反應(yīng)體系中除黃嘌呤脫氫酶外的所有試劑加入并混勻，置于40℃水浴中溫浴5min，然后加入黃嘌呤脫氫酶啟動(dòng)反應(yīng)，利用帶有加熱模塊的分光光度計(jì)將反應(yīng)溫度控制在40℃條件下，邊反應(yīng)邊記錄反應(yīng)3-5min內(nèi)295nm下吸光值變化，繪制吸光度(ΔOD₂₉₅)的增加隨時(shí)間變化的關(guān)系曲線、并計(jì)算反應(yīng)曲線最初線性部分的吸光度隨時(shí)間的變化速率(ΔOD₂₉₅/min)，通過(guò)產(chǎn)物尿酸變化檢測(cè)底物黃嘌呤和次黃嘌呤的降解情況。實(shí)驗(yàn)結(jié) 果如圖5A所示。

采用同樣的操作方法，將b)和c)置于40℃溫浴，然后加入重組黃嘌呤脫氫酶啟動(dòng)反應(yīng)，記錄40℃反應(yīng)條件下ΔOD₃₄₀變化，通過(guò)產(chǎn)物NADH變化，檢測(cè)底物黃嘌呤和次黃嘌呤的降解情況。實(shí)驗(yàn)結(jié)果如圖5B所示。

圖5A表明，黃嘌呤脫氫酶在pH 7.5和40℃、pH 8.5和40℃下均可以有效降解黃嘌呤和次黃嘌呤。a)至c)反應(yīng)體系下的最大吸光度變化速度(ΔOD₂₉₅/min)分別為0.0683、0.0863和0.0301，對(duì)應(yīng)的降解速率分別為0.1093μmol.L^-1.min^-1，0.1381μmol.L^-1.min^-1和0.0482μmol.L^-1.min^-1，對(duì)應(yīng)的比活力分別為0.506U/mg，0.6394U/mg和0.2231U/mg。

圖5B表明，b)和c)反應(yīng)體系以NADH表征的吸光度變化速率(ΔOD₃₄₀/min)分別為0.0313和0.0457，對(duì)應(yīng)的降解速率分別為0.1006μmol.L^-1.min^-1和0.1467μmol.L^-1.min^-1，對(duì)應(yīng)的比活力分別為0.4657U/mg和0.6792U/mg。

實(shí)施例4、應(yīng)用黃嘌呤脫氫酶檢測(cè)血液等樣品中次黃嘌呤/黃嘌呤含量的方法

1)含黃嘌呤血液樣品的制備

取冷凍保藏-20℃胎牛血清(杭州天杭生物科技股份有限公司，“四季青”牌無(wú)噬菌體、低內(nèi)毒素胎牛血清，生產(chǎn)批號(hào)150212)于4℃冰箱中緩慢溶解，按照下表2分別構(gòu)建含0～0.4mmol/L黃嘌呤的牛血清樣品。

表2含黃嘌呤胎牛血清樣品的構(gòu)建

2)含酶檢測(cè)體系的構(gòu)建

按照下表3構(gòu)建50μL黃嘌呤脫氫酶檢測(cè)體系混合物，同時(shí)構(gòu)建除黃嘌呤脫氫酶外的檢測(cè)體系作為空白對(duì)照。

表3含黃嘌呤脫氫酶檢測(cè)體系的構(gòu)建

3)標(biāo)準(zhǔn)曲線制作

按照下表4制作含0～0.4mmol/L黃嘌呤的50μL標(biāo)準(zhǔn)樣品，分別取上述50μL標(biāo)準(zhǔn)樣品與2)所構(gòu)建50μL含酶檢測(cè)標(biāo)準(zhǔn)體系混合，室溫放置30min，在酶標(biāo)儀(Tecan公司,型號(hào)為infinite M200Pro)測(cè)定340nm處吸光度變化。

表4含黃嘌呤標(biāo)準(zhǔn)樣品的構(gòu)建

以1#空白黃嘌呤標(biāo)準(zhǔn)品為本底對(duì)照，2#～6#標(biāo)準(zhǔn)品讀數(shù)均扣除1#本底讀值。以各標(biāo)準(zhǔn)品黃嘌呤含量(單位為nmole/well)為縱坐標(biāo)(y)，以扣除本底后OD₃₄₀變化值為橫坐標(biāo)(x)，構(gòu)建用分光光度法測(cè)定黃嘌呤含量的標(biāo)準(zhǔn)曲線。結(jié)果如下圖6A所示，標(biāo)準(zhǔn)曲線為y＝64.083x-0.0386,相關(guān)系數(shù)R²為0.987。

4)取1)中構(gòu)建的樣品50μL和2)中含酶檢測(cè)體系50μL混勻，室溫放置30min，在酶標(biāo)儀(Tecan公司,型號(hào)為infinite M200Pro)測(cè)定340nm處吸光度變化。以各標(biāo)準(zhǔn)樣品與2)所構(gòu)建50μL樣品對(duì)照混勻室溫放置30min后測(cè)得的OD₃₄₀變化為空白對(duì)照。將各樣本讀數(shù)扣除空白對(duì)照所得差值代人3)中標(biāo)準(zhǔn)曲線，求得黃嘌呤含量測(cè)量值(Sa)。按照下式計(jì)算樣品中黃嘌呤濃度(C)：

Sa/Sv＝C (公式4)

其中：

Sa－從標(biāo)準(zhǔn)曲線求得的樣品中黃嘌呤/次黃嘌呤含量(nmole)；

Sv－樣本體積，此處為50μL；

C－樣品中黃嘌呤/次黃嘌呤濃度(nmole/μL)。

為了評(píng)估本發(fā)明所提供黃嘌呤脫氫酶法檢測(cè)血清中黃嘌呤含量的效果，以樣品中黃嘌呤含量真實(shí)值為橫坐標(biāo)，以檢測(cè)值為縱坐標(biāo)，繪制相關(guān)曲線如下圖6B所示。可見(jiàn)，胎牛血清樣品中黃嘌呤含量真實(shí)值與檢測(cè)值基本吻合，兩者線性相關(guān)系數(shù)(R²)為0.987，與黃嘌呤水溶液檢測(cè)結(jié)果基本一致。

實(shí)施例5、一種將黃嘌呤脫氫酶用于檢測(cè)試劑盒的方法

本實(shí)施例的目的是提供一種包含黃嘌呤脫氫酶的檢測(cè)試劑盒。所述試劑盒包括：XDH酶、氧化型輔酶、黃嘌呤標(biāo)準(zhǔn)品、緩沖體系、穩(wěn)定劑；成份組成如下：

堿性黃嘌呤脫氫酶 40-40000U/L；

緩沖液 10-1000mmol/L，優(yōu)選的為 50-200mmol/L；

氧化型輔酶 0.1－20mmol/L；

黃嘌呤標(biāo)準(zhǔn)品 0.001-20mmol/L；

穩(wěn)定劑 0.1－80％(總體積)。

所述試劑盒特征在于：

其中，所述XDH酶為序列SEQ ID NO:1。

所述緩沖劑的pH范圍為pH 7.0-12.0，優(yōu)選pH 7.4-9.0，所述緩沖試劑是三(羥甲基)氨基甲烷-鹽酸緩沖液、三(羥甲基)氨基甲烷-二氨基乙烷四乙酸緩沖液、磷酸鹽緩沖液、三乙醇胺緩沖液、2-氨基-2-甲基-1-丙醇緩沖液、咪唑緩沖液、雙甘氨肽緩沖液或甘氨酸-鹽酸緩沖液中的一種；

所述氧化型輔酶是NAD+、NADP、thio-NAD+氧化型煙酰胺輔酶或其衍生物中的一種；

所述穩(wěn)定劑為乙二醇、丙二醇、甘油、海藻糖、聚糖、聚醇、硫酸銨、牛血清白蛋白(BSA)、氧嗪酸鉀或鹽中的至少一種。

用以實(shí)現(xiàn)本發(fā)明方法的次黃嘌呤/黃嘌呤診斷試劑盒可以是雙劑或三劑，其中雙劑包括：

試劑I

堿性黃嘌呤脫氫酶 40-40000U/L；

緩沖液 10-1000mmol/L，優(yōu)選的為 50-200mmol/L；

氧化型輔酶 0.1－20mmol/L；

穩(wěn)定劑 0.1－80％(總體積)。

試劑II

黃嘌呤標(biāo)準(zhǔn)品 0.001-20mmol/L。

也可以將上述試劑配成三劑，更有利于消除內(nèi)、外源次黃嘌呤及黃嘌呤污染，同時(shí)有利于穩(wěn)定試劑：

試劑I

堿性黃嘌呤脫氫酶 40-40000U/L；

緩沖液 10-1000mmol/L，優(yōu)選的為 50-200mmol/L；

穩(wěn)定劑 0.1－80％(總體積)。

試劑II

氧化型輔酶 0.1－20mmol/L；

緩沖液 10-1000mmol/L，優(yōu)選的為 50-200mmol/L；

穩(wěn)定劑 0.1－80％(總體積)。

試劑III

黃嘌呤標(biāo)準(zhǔn)品 0.001-20mmol/L。

三劑的配方不僅限于上述配方，其中的試劑I中堿性黃嘌呤脫氫酶可以和試劑II中氧化型輔酶放在一起，而將穩(wěn)定試和緩沖溶液放在一起，如此形成多種配方，不再詳述。

為減少試劑之間交叉影響和保持試劑穩(wěn)定以及便于儲(chǔ)存，所述試劑盒可以單組分形式存在。

此外，為了減少各試劑成份之間的交叉影響、保持試劑的穩(wěn)定性，以便長(zhǎng)期儲(chǔ)存，以上單劑、雙劑的試劑I、試劑II或三劑的試劑I、試劑II、試劑III中通常加入濃度為0.1－80％或者10-100mmol/L的穩(wěn)定劑，穩(wěn)定劑可以是乙二醇、丙二醇、甘油、海藻糖、聚糖、聚醇、硫酸銨、牛血清白蛋白(BSA)或鹽中的至少一種。

一個(gè)優(yōu)選的三劑型試劑盒為：試劑I－酶混合物，試劑II－樣品檢測(cè)緩沖溶液盒，試劑III－黃嘌呤標(biāo)準(zhǔn)品，具體組成如下：

試劑I－酶混合物

堿性黃嘌呤脫氫酶 1000U/L；

Tris-Hcl 50mmol/L(pH 8.5)；

EDTA 1mmol/L(pH 8.5)；

NAD 100mmol/L；

甘油 50％(w/v)；

氧嗪酸鉀 10mmol/L。

試劑II－樣品檢測(cè)緩沖溶液

Tris-Hcl 50mmol/L(pH 8.5)；

EDTA 1mmol/L(pH 8.5)；

NAD 0.1mmol/L；

氧嗪酸鉀 0.1mmol/L。

試劑III－黃嘌呤標(biāo)準(zhǔn)品

黃嘌呤標(biāo)準(zhǔn)品 20mmol/L。

實(shí)施例6、檢測(cè)試劑盒檢測(cè)人血清中黃嘌呤含量

取實(shí)施例5制作的三劑型檢測(cè)試劑盒，采用與實(shí)施例4中相同方法，對(duì)含黃嘌呤人血清進(jìn)行檢測(cè)。具體操作步驟如下，

1)含黃嘌呤人血清樣品的制備

取冷凍保藏于-20℃的人血清(Solarbio公司，產(chǎn)品代碼Solarbio SA45，生產(chǎn)批號(hào)(lot No)20150106)于4℃冰箱中緩慢溶解，替代表2中胎牛血清，并用溶液II代替Tris-HCl緩沖液體(0.1mM,pH 8.5)，按照表2制備含0～0.4mmol/L黃嘌呤的人血清樣品。

2)酶檢測(cè)體系的構(gòu)建

取2μL試劑I和48μL試劑II組成酶檢測(cè)體系用于檢測(cè)樣品(同實(shí)施例4表3)，取50μL試劑II作為樣品檢測(cè)的空白對(duì)照。

3)標(biāo)準(zhǔn)曲線的制作

用試劑II代替表4中Tris-HCl緩沖液體(0.1mM,pH 8.5)，用試劑III配制0～0.4mmol/L黃嘌呤的50μL標(biāo)準(zhǔn)品。采用與實(shí)施例4中相同操作方法，獲得黃嘌呤含量y(nmole/well，每well含100μL)與340nm吸光度變化x的關(guān)系曲線，如圖7A所示，y＝63.467x-0.3694,相關(guān)系數(shù)R²＝0.9947。

4)采用與實(shí)施例4相同的測(cè)定方法，測(cè)定1)中人血清中黃嘌呤含量。所得檢測(cè)值與真實(shí)值關(guān)系如圖7B所示，可見(jiàn)，血清中黃嘌呤含量檢測(cè)值與真實(shí)值非常吻合，本發(fā)明所提供檢測(cè)試劑盒檢測(cè)效果良好。

本發(fā)明采用商品化黃嘌呤/次黃嘌呤檢測(cè)試劑盒(Sigma公司，產(chǎn)品代碼MAK186)對(duì)人血清中黃嘌呤含量進(jìn)行了對(duì)比研究。Sigma試劑盒基于牛奶黃嘌呤氧化酶作為主要檢測(cè)酶。檢測(cè)結(jié)果如圖7C所示：可見(jiàn)，Sigma試劑盒檢測(cè)黃嘌呤含量(不論是標(biāo)準(zhǔn)黃嘌呤溶液 還是人血清中黃嘌呤含量)的線性范圍僅在0～12nmole/well范圍內(nèi)，對(duì)應(yīng)的濃度為0.24mmol/L，超過(guò)該范圍基本不發(fā)生反應(yīng)。這種現(xiàn)象很可能是由于黃嘌呤氧化酶催化黃嘌呤的氧化需要O₂的參與，而室溫下O₂在水溶液中溶解度不超過(guò)0.21mmol/L。除此之外，基于黃嘌呤氧化酶的檢測(cè)試劑盒，需要偶聯(lián)辣根過(guò)氧化酶酶檢測(cè)H₂O₂的生成來(lái)間接測(cè)定黃嘌呤的量。因此，本發(fā)明提供的黃嘌呤脫氫酶試劑盒，用到的試劑少，反應(yīng)步驟少而且是直接測(cè)定。

實(shí)施例7、檢測(cè)試劑盒檢測(cè)人尿液中黃嘌呤含量

取新鮮尿液采用實(shí)施例6中制備含黃嘌呤人血清的方法制備含0～0.4mmol/L黃嘌呤的人尿液樣品。然后采用與實(shí)施例6相同的檢測(cè)方法，用實(shí)施例5制作的三劑型檢測(cè)試劑盒對(duì)其中黃嘌呤含量進(jìn)行檢測(cè)。同時(shí)，商品化黃嘌呤/次黃嘌呤檢測(cè)試劑盒(Sigma公司，產(chǎn)品代碼MAK186)測(cè)定結(jié)果進(jìn)行對(duì)比。測(cè)定結(jié)果如圖8所示，可見(jiàn)，本發(fā)明所提供基于黃嘌呤脫氫酶的檢測(cè)試劑盒測(cè)定范圍更廣泛，線性更好。該結(jié)果與人血清黃嘌呤含量測(cè)定結(jié)果一致。