本發(fā)明涉及4，5，6，7-四氫-3H-咪唑并[4，5-c]吡啶-6-甲酰-Lys-Arg-Gly-Asp-Val，涉及它的制備方法、涉及它們的抗血栓活性，因而本發(fā)明涉及它作為抗血栓藥物的應(yīng)用。本發(fā)明屬于生物醫(yī)藥領(lǐng)域。

背景技術(shù)：

冠心病、腦卒中以及脈管炎等是非常常見(jiàn)的心腦血管疾病。隨著人們生活水平的不斷提高，心腦血管疾病的發(fā)病人數(shù)逐年遞增。心腦血管疾病危險(xiǎn)因素流行，我國(guó)心腦血管疾病的患病率持續(xù)上升。據(jù)資料統(tǒng)計(jì)，每5個(gè)成年人中就有1個(gè)心血管病患者。血栓形成是心腦血管疾病的重要病因。預(yù)防血栓形成仍然依賴(lài)藥物治療。臨床常用的血栓類(lèi)藥物有阿司匹林、氯吡格雷和華法林等。它們都存在一些副作用，如出血和胃腸道刺激等。因此，尋找療效好、副作用小的抗血栓藥物是很有意義的。

近年來(lái)，人們發(fā)現(xiàn)含有咪唑并四氫吡啶雜環(huán)的化合物是抗血栓活性的優(yōu)秀結(jié)構(gòu)。發(fā)明人曾經(jīng)公開(kāi)下式的4，5，6，7-四氫-3H-咪唑并[4，5-c]吡啶-6-甲酰-AA(式中AA為氨基酸殘基)在10nmol/kgd的口服劑量下具有確切的抗血栓活性。

不過(guò)，發(fā)明人對(duì)該系列化合物的抗血栓活性并不滿(mǎn)意。為了進(jìn)一步提高活性，發(fā)明人展開(kāi)了一系列實(shí)驗(yàn)研究，最終發(fā)現(xiàn)用血栓靶向肽代替已經(jīng)公開(kāi)的結(jié)構(gòu)中的AA，可提高抗血栓活性。按照這些研究，發(fā)明人提出了本發(fā)明。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

本發(fā)明的第一個(gè)內(nèi)容是提供4，5，6，7-四氫-3H-咪唑并[4，5-c]吡啶-6-甲酰-Lys-Arg-Gly-Asp-Val。

本發(fā)明的第二個(gè)內(nèi)容是提供4，5，6，7-四氫-3H-咪唑并[4，5-c]吡啶-6-甲酰 -Lys-Arg-Gly-Asp-Val的合成方法，該方法包括：

(1)L-組氨酸在稀硫酸催化下與甲醛進(jìn)行Pictet-Spengler縮合生成4，5，6，7-四氫-3H-咪唑并[4，5-c]吡啶-6-羧酸；

(2)4，5，6，7-四氫-3H-咪唑并[4，5-c]吡啶-6-羧酸轉(zhuǎn)化為3，5-二-Boc-4，5，6，7-四氫-3H-咪唑并[4，5-c]吡啶-6-羧酸；

(3)3，5-二-Boc-4，5，6，7-四氫-3H-咪唑并[4，5-c]吡啶-6-羧酸與Lys(Boc)-OBzl偶聯(lián)得到3，5-二-Boc-4，5，6，7-四氫-3H-咪唑并[4，5-c]吡啶-6-甲酰-Lys(Boc)-OBzl；

(4)3，5-二-Boc-4，5，6，7-四氫-3H-咪唑并[4，5-c]吡啶-6-甲酰-Lys(Boc)-OBzl在2N NaOH溶液中皂化成3，5-二-Boc-4，5，6，7-四氫-3H-咪唑并[4，5-c]吡啶-6-甲酰-Lys(Boc)；

(5)Boc-Arg(NO₂)與甘氨酸芐酯偶聯(lián)得到Boc-Arg(NO₂)-Gly-OBzl；

(6)Boc-Arg(NO₂)-Gly-OBzl在2N NaOH溶液中皂化成Boc-Arg(NO₂)-Gly；

(7)Boc-Asp(OBzl)與纈氨酸芐酯偶聯(lián)得到Boc-Asp(OBzl)-Val-OBzl；

(8)Boc-Asp(OBzl)-Val-OBzl在4N氯化氫的乙酸乙酯溶液中得到L-Asp(OBzl)-Val-OBzl；

(9)Boc-Arg(NO₂)-Gly與L-Asp(OBzl)-Val-OBzl偶聯(lián)得到Boc-Arg(NO₂)-Gly-Asp(OBzl)-Val-

OBzl；

(10)Boc-Arg(NO₂)-Gly-Asp(OBzl)-Val-OBzl在4N氯化氫的乙酸乙酯溶液中得到L-Arg(NO₂)-Gly-Asp(OBzl)-Val-OBzl；

(11)3，5-二-Boc-4，5，6，7-四氫-3H-咪唑并[4，5-c]吡啶-6-甲酰-Lys(Boc)與L-Arg(NO₂)-Gly-Asp(OBzl)-Val-OBzl偶聯(lián)得到3，5-二-Boc-4，5，6，7-四氫-3H-咪唑并[4，5-c]吡啶-6-甲酰-Lys(Boc)-Arg(NO₂)-Gly-Asp(OBzl)-Val-OBzl；

(12)3，5-二-Boc-4，5，6，7-四氫-3H-咪唑并[4，5-c]吡啶-6-甲酰-Lys(Boc)-Arg(NO₂)-Gly-Asp(OBzl)-Val-OBzl在TFA/TFMSA中得到4，5，6，7-四氫-3H-咪唑并[4，5-c]吡啶-6-甲酰-Lys-Arg-Gly-Asp-Val。

本發(fā)明的第三個(gè)內(nèi)容是評(píng)價(jià)4，5，6，7-四氫-3H-咪唑并[4，5-c]吡啶-6-甲酰-Lys-Arg-Gly-Asp-Val對(duì)SD大鼠的抗血栓作用。

附圖說(shuō)明

圖1.4，5，6，7-四氫-3H-咪唑并[4，5-c]吡啶-6-甲酰-Lys-Arg-Gly-Asp-Val的合成路線.

i)HCHO，H₂SO₄，65℃；ii)(Boc)₂O，4N NaOH；iii)HOBt，DCC，THF；iv)2N NaOH，CH₃OH；v)HCl/EA；vi)TFA/TFMSA。

具體實(shí)施方式

為了進(jìn)一步闡述本發(fā)明，下面給出一系列實(shí)施例。這些實(shí)施例完全是例證性的，它們僅用來(lái)對(duì)本發(fā)明進(jìn)行具體描述，不應(yīng)當(dāng)理解為對(duì)本發(fā)明的限制。

實(shí)施例1制備4，5，6，7-四氫-3H-咪唑并[4，5-c]吡啶-6-羧酸(1)

冰浴和攪拌下向5g(32.3mmol)L-His與18mL水的溶液中緩慢滴加0.8mL H₂SO₄，使完全溶解。向該溶液中加6mL 40％甲醛水溶液。撤去冰浴，60℃反應(yīng)8h，TLC(乙酸乙酯∶水∶冰醋酸＝4∶1∶1)監(jiān)測(cè)原料點(diǎn)消失。將反應(yīng)液冷卻至室溫，冰浴下用濃氨水調(diào)節(jié)pH至6，有大量無(wú)色固體析出。過(guò)濾。濾渣用水和丙酮洗滌，得4.52g(84％)標(biāo)題化合物。ESI-MS(m/e)：168[M+H]⁺。

實(shí)施例2制備3，5-二-Boc-4，5，6，7-四氫-3H-咪唑并[4，5-c]吡啶-6-羧酸(2)

冰浴和攪拌下向5g(29.9mmol)4，5，6，7-四氫-3H-咪唑并[4，5-c]吡啶-6-羧酸與40mL水的溶液中加40mL 1，4-二氧六環(huán)溶解的14.3g(65.7mmol)(Boc)₂O，用4N NaOH溶液調(diào)節(jié)pH至8-9，室溫反應(yīng)24h，TLC(二氯甲烷∶甲醇＝15∶1)監(jiān)測(cè)原料點(diǎn)消失。反應(yīng)液用飽和KHSO₄溶液調(diào)節(jié)pH至7，減壓蒸出1，4-二氧六環(huán)后，用飽和KHSO₄溶液調(diào)節(jié)pH至2。用乙酸乙酯萃取三次，酯層用飽和NaCl洗三次。用無(wú)水硫酸鈉干燥30min，過(guò)濾。將濾液減壓蒸干。加少量乙酸乙酯將其剛好溶解，靜置。有固體析出，過(guò)濾。得1.2g(11％)標(biāo)題化合物，為無(wú)色固體。ESI-MS(m/e)：368[M+H]⁺。

實(shí)施例3制備3，5-二-Boc-4，5，6，7-四氫-3H-咪唑并[4，5-c]吡啶-6-甲酰-Lys(Boc)-OBzl(3)

冰浴下，用20mL干燥的四氫呋喃(THF)將367mg(1mmol)3，5-二-Boc-4，5，6，7-凹?xì)?3H-咪唑并[4，5-c]吡啶-6-羧酸溶解。加入142mg(1.05mmol)HOBt以及258mg(1.25mmol)DCC，攪拌活化30min。用10mL干燥的THF將558mg(1.1mmol)Tos·Lys(Boc)-OBzl溶解，用NMM調(diào)節(jié)pH至8，將該溶液滴加至反應(yīng)液中，最后用NMM調(diào)節(jié)反應(yīng)液pH至8。室溫反應(yīng)5h，TLC(石油醚∶丙酮＝3∶1)顯示原料消失。過(guò)濾除去二環(huán)己基脲(DCU)，減壓蒸干反應(yīng)液，剩余物用乙酸乙酯溶解后，依次用飽和NaHCO₃溶液、飽和NaCl溶液、5％KHSO₄溶液、飽和NaCl溶液、飽和NaHCO₃溶液、飽和NaCl溶液各洗三次。乙酸乙酯層用無(wú)水Na₂SO₄干燥30min，過(guò)濾，濾液減壓蒸干。所得黃色油狀物經(jīng)硅膠柱層析純化(石油醚/丙酮為洗脫劑)，得248mg(36％)標(biāo)題化合物，為無(wú) 色固體。ESI-MS(m/e)：686[M+H]⁺。

實(shí)施例4制備3，5-二-Boc-4，5，6，7-四氫-3H-咪唑并[4，5-c]吡啶-6-甲酰-Lys(Boc)(4)

冰浴下，用20mL甲醇將685mg(1mmol)3，5-二-Boc-4，5，6，7-四氫-3H-咪唑并[4，5-c]吡啶-6-甲酰-Lys(Boc)-OBzl溶解，用2N NaOH溶液調(diào)節(jié)pH至12，冰浴反應(yīng)5h，TLC(石油醚∶丙酮＝3∶1)顯示原料點(diǎn)消失。用飽和KHSO₄溶液調(diào)節(jié)pH至7。減壓蒸出甲醇，用飽和KHSO₄溶液調(diào)節(jié)pH至2，用乙酸乙酯萃取3次，乙酸乙酯層用飽和NaCl溶液洗三次，用無(wú)水Na₂SO₄干燥30min，過(guò)濾，旋干濾液。得584mg(98％)標(biāo)題化合物，為無(wú)色固體。ESI-MS(m/e)：596[M+H]⁺。

實(shí)施例5制備Boc-Arg(NO₂)-Gly-OBzl

冰浴和攪拌下向1.595g(5mmol)Boc-Arg(NO₂)中加30mL干燥的THF。依次加入708mg(5.25mmol)HOBt及1.291g(6.25mmol)DCC，活化30min。用干燥的THF將2.022g(6mmol)Tos·Gly-OBzl溶解后，用NMM調(diào)pH至8，然后將該溶液滴加至反應(yīng)液中，最后用NMM調(diào)反應(yīng)液pH至8。室溫反應(yīng)12小時(shí)，TLC(二氯甲烷∶甲醇＝20∶1)顯示反應(yīng)完畢后，將反應(yīng)液減壓蒸干，剩余油狀物用乙酸乙酯溶解，過(guò)濾除去DCU，濾液依次用飽和NaHCO₃溶液、飽和NaCl溶液、飽和KHSO₄溶液、飽和NaCl溶液、飽和NaHCO₃溶液、飽和NaCl溶液各洗三遍，乙酸乙酯層用無(wú)水Na₂SO₄干燥30min，過(guò)濾。濾液減壓濃縮至干，得到的黃色油狀物加入二氯甲烷溶解，靜置有固體析出。過(guò)濾。得到1.866g(80％)標(biāo)題化合物，為無(wú)色固體。ESI-MS(m/e)：467[M+H]⁺。

實(shí)施例6制備Boc-Arg(NO₂)-Gly

冰浴下，用40mL甲醇將1.680g(5mmol)Boc-Arg(NO₂)-Gly-OBzl溶解，用2NNaOH溶液調(diào)節(jié)pH至12，冰浴反應(yīng)5h，TLC(二氯甲烷∶甲醇＝20∶1)顯示原料點(diǎn)消失。用飽和KHSO₄溶液調(diào)節(jié)pH至7。減壓蒸出甲醇，用飽和KHSO₄溶液調(diào)節(jié)pH至2，用乙酸乙酯萃取三次，乙酸乙酯層用飽和NaCl溶液洗三次，用無(wú)水Na₂SO₄干燥30min，過(guò)濾。濾液減壓濃縮至干。得1.737g(92％)標(biāo)題化合物，為無(wú)色固體。ESI-MS(m/e)：375[M+H]^-。

實(shí)施例7制備Boc-Asp(OBzl)-Val-OBzl

按照實(shí)施例5的方法從1.615g(5mmol)Boc-Asp(OBzl)和2.369g(6mmol)Tos·Val-OBzl得到2.081g(81％)標(biāo)題化合物，為無(wú)色固體。ESI-MS(m/e)：513[M+H]⁺。

實(shí)施例8制備HCl·Asp(OBzl)-Val-OBzl

冰浴和攪拌下，用少量干燥的乙酸乙酯將1.024g(2mmol)Boc-Asp(OBzl)-Val- OBzl溶解。向該溶液中加20ml 4N氯化氫的乙酸乙酯溶液，冰浴下反應(yīng)6小時(shí)，TLC(石油醚：丙酮＝3∶1)顯示反應(yīng)完畢后，將反應(yīng)液減壓濃縮至干。向殘余物中加干燥的乙酸乙酯，減壓濃縮至干，重復(fù)兩次。再向殘余物中加無(wú)水乙醚，減壓濃縮至干，重復(fù)三次。得0.751g(91％)標(biāo)題化合物，為淡黃色固體。ESI-MS(m/e)：413[M+H]⁺。

實(shí)施例9 制備Boc-Arg(NO₂)-Gly-Asp(OBzl)-Val-OBzl

按照實(shí)施例5的方法從1.880g(5mmol)Boc-Arg(NO₂)-Gly和2.700g(6mmol)HCl·Asp(OBzl)-Val-OBzl得到2.903g(75％)標(biāo)題化合物，為無(wú)色固體。ESI-MS(m/e)：771[M+H]⁺。

實(shí)施例10 制備HCl·Arg(NO₂)-Gly-Asp(OBzl)-Val-OBzl

按照實(shí)施例8的方法從1.540g(2mmol)Boc-Arg(NO₂)-Gly-Asp(OBzl)-Val-OBzl得到1.187g(89％)標(biāo)題化合物，為淡黃色固體。ESI-MS(m/e)：671[M+H]⁺。

實(shí)施例11 制備3，5-二-Boc-4，5，6，7-四氫-3H-咪唑并[4，5-c]吡啶-6-甲酰-Lys(Boc)-Arg(NO₂)-Gly-Asp(OBzl)-Val-OBzl (5)

按照實(shí)施例5的方法從906mg(1.52mmol)3，5-二-Boc-4，5，6，7-四氫-3H-咪唑并[4，5-c]吡啶-6-甲酰-Lys(Boc)和1.06g HCl·Arg(NO₂)-Gly-Asp(OBzl)-Val-OBzl得1.39g(73％)標(biāo)題化合物，為無(wú)色固體。ESI-MS(m/e)：1248[M+H]⁺。

實(shí)施例12 制備3，5-二-Boc-4，5，6，7-四氫-3H-咪唑并[4，5-c]吡啶-6-甲酰-Lys-Arg-Gly-Asp-Val(6)

冰浴和攪拌下，向60mg(0.05mmol)3，5-二-Boc-4，5，6，7-四氫-3H-咪唑并[4，5-c]吡啶-6-甲酰-Lys(Boc)-Arg(NO₂)-Gly-Asp(OBzl)-Val-OBzl中滴加1.8mL三氟乙酸，使其完全溶解。滴加0.6mL三氟甲磺酸，溶液變?yōu)槟G色。加干燥管冰浴反應(yīng)25min，加入大量乙醚，有無(wú)色固體析出。離心后棄去上清液，固體再加乙醚，如此反復(fù)磨洗三次。用少量水將所得固體溶解，用稀釋的氨水調(diào)節(jié)pH至8，再用稀釋的冰醋酸調(diào)節(jié)pH至7。經(jīng)Sephadex G10柱子除鹽，冷凍干燥，得20.8mg(60％)標(biāo)題化合物，為無(wú)色固體。Mp：193.2-194.0℃.ESI-MS(m/e)：723[M+H]⁺.¹H-NMR(500Hz，DMSO-d6)：δ/ppm＝10.269(s，1H)，8.976(d，J＝8.0Hz，1H)，8.549(s，1H)，8.252(d，J＝7.0Hz，1H)，8.107(d，J＝8.0Hz，1H)，7.449(s，1H)，6.997(d，J＝8.5Hz，2H)，4.370(dd，J＝12.0Hz，6.0Hz，1H)，4.275(m，1H)，4.228(m，1H)，3.855(m，2H)，3.710(dd，J＝26.0Hz，15.5Hz，1H)，3.618(dd，J＝16.5Hz，5.5Hz，1H)，3.472(dd，J＝9.0Hz，4.5Hz，1H)，3.177(m，1H)，2.740(m，3H)，2.564(m，2H)，2.253(dd，J＝16.0Hz，5.0Hz，1H)，2.006(m，1H)，1.961(m，2H)，1.871(m，5H)，1.669(m，2H)，1.530(m，4H)，1.285(m，2H)，0.776(d，J＝6.5Hz，6H)。

實(shí)驗(yàn)例1評(píng)價(jià)化合物6的抗血栓活性

將雄性SD大鼠(200±20g)，隨機(jī)分組，每組12只，飼養(yǎng)1天，停止喂食過(guò)夜。灌胃給予化合物6的生理鹽水溶液(劑量為10nmol/kg)或阿司匹林的生理鹽水溶液(劑量為167μmol/kg)或生理鹽水(劑量為10mL/kg)30min之后，大鼠用20％烏來(lái)糖的生理鹽水溶液麻醉，之后手術(shù)。分離大鼠的右頸動(dòng)脈和左頸靜脈，將準(zhǔn)確稱(chēng)重的絲線置于旁路插管，管的一端插入左靜脈，另一端管插入右側(cè)動(dòng)脈并注射0.2mL肝素鈉抗凝。使得血流從右側(cè)動(dòng)脈流經(jīng)旁路插管進(jìn)入左側(cè)靜脈，15min之后取出附有血栓的絲線稱(chēng)量，計(jì)算血液循環(huán)前后絲線的重量，得到的血栓重以均值±SDmg表示并代表抗血栓活性，作t檢驗(yàn)。數(shù)據(jù)列入表1。結(jié)果表明口服10nmol/kg化合物6與口服167μmol/kg阿司匹林一樣能有效地抑制血栓形成。說(shuō)明化合物6的活性比阿司匹林強(qiáng)16700倍，獲得了意想不到的技術(shù)效果。

表1.10nmol/kg化合物6的抗血栓活性

n＝12；a)與生理鹽水比p＜0.01，與阿司匹林比p＞0.05。