本發(fā)明涉及微藻生物領(lǐng)域，具體地，涉及一種雨生紅球藻的養(yǎng)殖方法。
背景技術(shù)：
：雨生紅球藻(Haematococcuspluvialis)是一種單細(xì)胞綠藻，其增殖依賴于細(xì)胞的分裂。當(dāng)環(huán)境適宜時(shí)，紅球藻生物量不斷增加，屬于綠色游動(dòng)細(xì)胞階段；當(dāng)受到外界脅迫時(shí)，如光照、溫度、pH值變化等，自身形成孢子，積累油脂和蝦青素，藻細(xì)胞變成紅色，屬于不動(dòng)孢子階段。雨生紅球藻富含油脂和蝦青素，油脂含量可占細(xì)胞干重的30-40％，可以作為生物能源的潛在來源；蝦青素含量可占細(xì)胞干重的1.5-3.0％，是天然蝦青素最為重要的來源。但是，現(xiàn)有的雨生紅球藻的大規(guī)模培養(yǎng)與生產(chǎn)仍存在很大的困難，主要原因包括：(1)雨生紅球藻養(yǎng)殖單位面積產(chǎn)量低，易受微生物污染，油脂和蝦青素含量不穩(wěn)定；(2)雨生紅球藻綠色游動(dòng)細(xì)胞階段和不動(dòng)孢子生長階段的生長條件不同，生產(chǎn)成本高。CN102766578A公開了一種雨生紅球藻的培養(yǎng)生產(chǎn)方法，并具體公開了：在密封罐體中，將雨生紅球藻綠色游動(dòng)細(xì)胞接種到培養(yǎng)基中，采用人工的LED光源照射培養(yǎng)，可以縮短培養(yǎng)周期，增加藻液中雨生紅球藻細(xì)胞濃度。但并沒有涉及紅球藻轉(zhuǎn)變至不動(dòng)孢子、積累蝦青素和油脂的過程。CN102827766A公開了用于規(guī)?；t球藻養(yǎng)殖生產(chǎn)蝦青素的光生物反應(yīng)器，但其僅用于紅球藻“轉(zhuǎn)紅階段”，不包括紅球藻綠色游動(dòng)細(xì)胞生長養(yǎng)殖培養(yǎng)階段。目前，國內(nèi)一般采用一步法培養(yǎng)雨生紅球藻，即綠色游動(dòng)細(xì)胞階段和不 動(dòng)孢子階段在同一個(gè)反應(yīng)器中進(jìn)行，主要目的是為了獲得高含量的蝦青素，很少涉及油脂的生產(chǎn)，而且在同一個(gè)反應(yīng)器中進(jìn)行培養(yǎng)的最大問題是采收后的培養(yǎng)液不能重復(fù)利用，作為廢水排放，造成養(yǎng)殖成本高，資源浪費(fèi)以及環(huán)境污染。例如，CN1966660A公開了大規(guī)模養(yǎng)殖紅球藻生產(chǎn)蝦青素的裝置和方法，整個(gè)培養(yǎng)裝置由光生物反應(yīng)器系統(tǒng)、充氣裝置、培養(yǎng)液灌輸裝置和靜細(xì)胞收集裝置組成。通過培養(yǎng)液相互流動(dòng)，連續(xù)充氣使得紅球藻生長與分裂基本同步；利用固定架上設(shè)置的浮塵控制裝置和自然水體進(jìn)行大規(guī)模紅球藻培養(yǎng)，使光生物反應(yīng)器系統(tǒng)降到所需要的水層深度，解決了紅球藻培養(yǎng)和轉(zhuǎn)化蝦青素兩個(gè)階段溫度、光照和營養(yǎng)條件不同的矛盾。CN1680539A公開了一種雨生紅球藻高密度培養(yǎng)的氣升式光生物反應(yīng)器，包括培養(yǎng)灌、水處理裝置、照明裝置和氣體供應(yīng)裝置，主要通過控制光照強(qiáng)度等條件實(shí)現(xiàn)紅球藻的培養(yǎng)和蝦青素的積累在同一反應(yīng)器中完成。CN1392244A公開了一種培養(yǎng)紅球藻生產(chǎn)蝦青素的方法，包括培養(yǎng)基配方、一步法生產(chǎn)工藝、培養(yǎng)基的循環(huán)利用和采用二氧化碳調(diào)節(jié)pH值誘導(dǎo)紅球藻孢子的形成和蝦青素積累的方法。技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：本發(fā)明的目的是為了克服現(xiàn)有技術(shù)中的上述缺陷，提供一種雨生紅球藻的養(yǎng)殖方法，該方法的游動(dòng)細(xì)胞階段的培養(yǎng)和不動(dòng)孢子階段的培養(yǎng)在不同的反應(yīng)器中進(jìn)行，養(yǎng)殖過程操作穩(wěn)定，質(zhì)量控制容易，且在養(yǎng)殖過程中所有培養(yǎng)液都可以回收利用，養(yǎng)殖成本低且不會(huì)產(chǎn)生廢液排放和環(huán)境污染的問題。在現(xiàn)有培養(yǎng)雨生紅球藻的方法中，游動(dòng)細(xì)胞階段和不動(dòng)孢子階段在同一個(gè)反應(yīng)器中進(jìn)行，且并不對(duì)雨生紅球藻游動(dòng)細(xì)胞進(jìn)行分離，究其原因主要是：考慮到雨生紅球藻游動(dòng)細(xì)胞的形態(tài)和存活特性，本領(lǐng)域技術(shù)人員普遍認(rèn)為根本無法對(duì)游動(dòng)細(xì)胞階段的雨生紅球藻進(jìn)行分離，且一旦對(duì)游動(dòng)細(xì)胞階段的雨 生紅球藻進(jìn)行分離則極有可能傷害雨生紅球藻游動(dòng)細(xì)胞甚至?xí)绊懹晟t球藻游動(dòng)細(xì)胞的存活，而本發(fā)明的發(fā)明人在研究中意外發(fā)現(xiàn)，可以將雨生紅球藻游動(dòng)細(xì)胞進(jìn)行過濾分離或者重力沉降分離，然后在不同的反應(yīng)器中進(jìn)行不動(dòng)孢子階段的培養(yǎng)，該養(yǎng)殖過程不僅不會(huì)對(duì)雨生紅球藻游動(dòng)細(xì)胞造成傷害，而且操作穩(wěn)定，質(zhì)量控制容易，且在養(yǎng)殖過程中所有培養(yǎng)液都可以回收利用，養(yǎng)殖成本低且不會(huì)產(chǎn)生廢液排放和環(huán)境污染的問題。因此，為了實(shí)現(xiàn)上述目的，本發(fā)明提供了一種雨生紅球藻的養(yǎng)殖方法，該方法包括：(1)進(jìn)行雨生紅球藻游動(dòng)細(xì)胞階段的培養(yǎng)；(2)當(dāng)培養(yǎng)至藻液的OD680值為0.01-10時(shí)，將至少部分藻液進(jìn)行分離，得到分離清液I和雨生紅球藻游動(dòng)細(xì)胞，將分離清液I返回至步驟(1)中回用；(3)將步驟(2)得到的雨生紅球藻游動(dòng)細(xì)胞進(jìn)行不動(dòng)孢子階段的培養(yǎng)；(4)待培養(yǎng)至完全轉(zhuǎn)紅后進(jìn)行分離，得到分離清液II和雨生紅球藻不動(dòng)孢子，將分離清液II返回至步驟(3)中回用；(5)將雨生紅球藻不動(dòng)孢子進(jìn)行干燥得到雨生紅球藻產(chǎn)品；步驟(2)中，所述分離的方式為過濾分離或者重力沉降分離。本發(fā)明的方法能夠?qū)崿F(xiàn)雨生紅球藻游動(dòng)細(xì)胞的連續(xù)養(yǎng)殖，進(jìn)而實(shí)現(xiàn)雨生紅球藻不動(dòng)孢子的半連續(xù)養(yǎng)殖，養(yǎng)殖過程操作穩(wěn)定，質(zhì)量控制容易，且在養(yǎng)殖過程中所有培養(yǎng)液都可以回收利用，養(yǎng)殖成本低且不會(huì)產(chǎn)生廢液排放和環(huán)境污染的問題。本發(fā)明的其它特征和優(yōu)點(diǎn)將在隨后的具體實(shí)施方式部分予以詳細(xì)說明。具體實(shí)施方式以下對(duì)本發(fā)明的具體實(shí)施方式進(jìn)行詳細(xì)說明。應(yīng)當(dāng)理解的是，此處所描 述的具體實(shí)施方式僅用于說明和解釋本發(fā)明，并不用于限制本發(fā)明。本發(fā)明提供了一種雨生紅球藻的養(yǎng)殖方法，所述方法包括：(1)進(jìn)行雨生紅球藻游動(dòng)細(xì)胞階段的培養(yǎng)；(2)當(dāng)培養(yǎng)至藻液的OD680值為0.01-10時(shí)，將至少部分藻液進(jìn)行分離，得到分離清液I和雨生紅球藻游動(dòng)細(xì)胞，將分離清液I返回至步驟(1)中回用；(3)將步驟(2)得到的雨生紅球藻游動(dòng)細(xì)胞進(jìn)行不動(dòng)孢子階段的培養(yǎng)；(4)待培養(yǎng)至完全轉(zhuǎn)紅后進(jìn)行分離，得到分離清液II和雨生紅球藻不動(dòng)孢子，將分離清液II返回至步驟(3)中回用；(5)將雨生紅球藻不動(dòng)孢子進(jìn)行干燥得到雨生紅球藻產(chǎn)品；步驟(2)中，所述分離的方式為過濾分離或者重力沉降分離。本發(fā)明方法中，優(yōu)選情況下，步驟(1)在游動(dòng)細(xì)胞養(yǎng)殖器中進(jìn)行，游動(dòng)細(xì)胞養(yǎng)殖器為開放式光生物反應(yīng)器或封閉式光生物反應(yīng)器。對(duì)于開放式光生物反應(yīng)器和封閉式光生物反應(yīng)器沒有特別的限定，可以分別為本領(lǐng)域常用的各種開放式光生物反應(yīng)器和封閉式光生物反應(yīng)器。例如開放式光生物反應(yīng)器可以為跑道式光生物反應(yīng)器或箱體式光生物反應(yīng)器；開放式光生物反應(yīng)器的材質(zhì)可以為金屬、水泥、無機(jī)玻璃、有機(jī)玻璃或塑料，塑料可以包括聚乙烯、聚丙烯、聚氯乙烯、聚碳酸酯等。優(yōu)選地，開放式光生物反應(yīng)器為透明聚丙烯箱體或水泥池。封閉式光生物反應(yīng)器可以為鼓泡式光生物反應(yīng)器、氣升式光生物反應(yīng)器、攪拌式光生物反應(yīng)器等；封閉式光生物反應(yīng)器的材質(zhì)可以為無機(jī)玻璃、有機(jī)玻璃或透明塑料，透明塑料可以包括聚乙烯、聚丙烯、聚氯乙烯、聚碳酸酯等。優(yōu)選地，封閉式光生物反應(yīng)器為自清潔的鼓泡式聚氯乙烯光生物反應(yīng)器。本發(fā)明方法中，對(duì)于雨生紅球藻藻種和培養(yǎng)液沒有特別的限定，可以分別為本領(lǐng)域常用的各種雨生紅球藻藻種和培養(yǎng)液，此為本領(lǐng)域技術(shù)人員所公 知，在此不再贅述。本發(fā)明方法中，本領(lǐng)域技術(shù)人員應(yīng)該理解的是，在實(shí)際的雨生紅球藻培養(yǎng)過程中，培養(yǎng)溫度、光照強(qiáng)度和培養(yǎng)液的pH值往往無法控制在一個(gè)精確的點(diǎn)值，而是在一個(gè)范圍內(nèi)進(jìn)行波動(dòng)。優(yōu)選情況下，步驟(1)中，培養(yǎng)的條件包括：溫度為15-25℃，光照強(qiáng)度為1000-5000Lux，pH值為6-8。其中，培養(yǎng)的條件還包括：在培養(yǎng)過程中通入的碳源為含有二氧化碳的氣體，氣體中二氧化碳的含量為1-20重量％，優(yōu)選為2-10重量％，進(jìn)一步優(yōu)選為3-8重量％。在進(jìn)行光照時(shí)，光源可以為自然光，也可以為人造光源(如LED光源)，優(yōu)選為自然光。含有二氧化碳的氣體可以為高純二氧化碳或工業(yè)過程排放的含有二氧化碳的氣體，工業(yè)過程排放的含有二氧化碳的氣體可以包括電廠和煉廠排放的含有二氧化碳的氣體。優(yōu)選地，含有二氧化碳的氣體為高純二氧化碳或者煉廠制氫尾氣。本領(lǐng)域技術(shù)人員應(yīng)該理解的是，含有二氧化碳的氣體在進(jìn)入到游動(dòng)細(xì)胞養(yǎng)殖器前需進(jìn)行凈化除去固體顆粒物并進(jìn)行冷卻。本發(fā)明方法中，優(yōu)選情況下，步驟(2)中，培養(yǎng)至藻液的OD680值為0.05-5，進(jìn)一步優(yōu)選為0.1-1。本發(fā)明方法中，優(yōu)選情況下，步驟(2)中，至少部分藻液占全部藻液體積的20-50％。本發(fā)明方法中，優(yōu)選情況下，步驟(2)中，將至少部分藻液轉(zhuǎn)移至分離與儲(chǔ)運(yùn)裝置中進(jìn)行分離。對(duì)于轉(zhuǎn)移的方式?jīng)]有特別的限定，可以分別為本領(lǐng)域常用的各種轉(zhuǎn)移的方式。其中，轉(zhuǎn)移的方式優(yōu)選為重力轉(zhuǎn)移、溢流轉(zhuǎn)移或者虹吸轉(zhuǎn)移，進(jìn)一步優(yōu)選為溢流轉(zhuǎn)移。本發(fā)明方法中，優(yōu)選情況下，步驟(2)中，分離的方式為過濾分離。過濾分離的方式可以為常壓過濾分離、加壓過濾分離和真空過濾分離，進(jìn)一步優(yōu)選為常壓過濾分離。本發(fā)明方法中，優(yōu)選情況下，分離與儲(chǔ)運(yùn)裝置為圓柱形分離空塔，所述 圓柱形分離空塔的高徑比為1-10:1，進(jìn)一步優(yōu)選為1.5-5:1，且所述圓柱形分離空塔的底部安裝有過濾介質(zhì)。對(duì)于過濾介質(zhì)沒有特別的限定，可以為本領(lǐng)域常用的各種過濾介質(zhì)，優(yōu)選情況下，過濾介質(zhì)為玻砂、濾布或?yàn)V紙，進(jìn)一步優(yōu)選為玻砂；過濾介質(zhì)的孔徑為1-60μm，進(jìn)一步優(yōu)選為10-30μm。本發(fā)明方法中，優(yōu)選情況下，圓柱形分離空塔設(shè)置有攪拌器，進(jìn)一步優(yōu)選地，攪拌器為錨式攪拌器、框式攪拌器或螺帶式攪拌器，更進(jìn)一步優(yōu)選為框式攪拌器。本發(fā)明方法中，本領(lǐng)域技術(shù)人員應(yīng)該理解的是，分離與儲(chǔ)運(yùn)裝置的數(shù)目視游動(dòng)細(xì)胞養(yǎng)殖器和不動(dòng)孢子養(yǎng)殖器的體積而定，可以是1個(gè)，也可以是多個(gè)并聯(lián)操作。本發(fā)明方法中，優(yōu)選情況下，將分離清液I返回至步驟(1)中回用的方式包括：將分離清液I與補(bǔ)充的(新鮮的)培養(yǎng)液在介質(zhì)罐中混合后返回至游動(dòng)細(xì)胞養(yǎng)殖器。本發(fā)明方法中，優(yōu)選情況下，步驟(3)在不動(dòng)孢子養(yǎng)殖器中進(jìn)行，不動(dòng)孢子養(yǎng)殖器為開放式光生物反應(yīng)器或封閉式光生物反應(yīng)器，優(yōu)選為開放式光生物反應(yīng)器。對(duì)于開放式光生物反應(yīng)器和封閉式光生物反應(yīng)器沒有特別的限定，可以分別為本領(lǐng)域常用的各種開放式光生物反應(yīng)器和封閉式光生物反應(yīng)器。例如開放式光生物反應(yīng)器可以為跑道式光生物反應(yīng)器或箱體式光生物反應(yīng)器；開放式光生物反應(yīng)器的材質(zhì)可以為金屬、水泥、無機(jī)玻璃、有機(jī)玻璃或塑料，塑料可以包括聚乙烯、聚丙烯、聚氯乙烯、聚碳酸酯等。優(yōu)選地，開放式光生物反應(yīng)器為透明聚丙烯箱體或水泥池。封閉式光生物反應(yīng)器可以為鼓泡式光生物反應(yīng)器、氣升式光生物反應(yīng)器、攪拌式光生物反應(yīng)器等；封閉式光生物反應(yīng)器的材質(zhì)可以為無機(jī)玻璃、有機(jī)玻璃或透明塑料，透明塑料可以包括聚乙烯、聚丙烯、聚氯乙烯、聚碳酸酯等。本發(fā)明方法中，優(yōu)選情況下，步驟(3)中，雨生紅球藻游動(dòng)細(xì)胞與分 離清液II在分離與儲(chǔ)運(yùn)裝置中混合后轉(zhuǎn)移至不動(dòng)孢子養(yǎng)殖器中進(jìn)行不動(dòng)孢子階段的培養(yǎng)。進(jìn)一步優(yōu)選地，轉(zhuǎn)移至不動(dòng)孢子養(yǎng)殖器中的方式為虹吸轉(zhuǎn)移或真空轉(zhuǎn)移，更進(jìn)一步優(yōu)選為真空轉(zhuǎn)移。本發(fā)明方法中，對(duì)于脅迫雨生紅球藻積累油脂和蝦青素的方式?jīng)]有特別的限定，可以為本領(lǐng)域常用的各種方式。例如，步驟(3)中，培養(yǎng)的方式可以為溫度脅迫培養(yǎng)、光照脅迫培養(yǎng)或者脅迫劑脅迫培養(yǎng)。優(yōu)選地，培養(yǎng)的方式為脅迫劑脅迫培養(yǎng)。進(jìn)一步優(yōu)選地，脅迫劑脅迫培養(yǎng)的條件包括：pH值為7-9，溫度為24-30℃，光照強(qiáng)度為5000-15000Lux，脅迫劑為鈉鹽，且以每升混合藻液計(jì)，脅迫劑的加入量為每升培養(yǎng)液0.005-0.05mol，更進(jìn)一步優(yōu)選為0.02-0.05mol；再更進(jìn)一步優(yōu)選地，脅迫劑為碳酸氫鈉。本發(fā)明方法中，本領(lǐng)域技術(shù)人員應(yīng)該理解的是，不動(dòng)孢子養(yǎng)殖器的數(shù)目應(yīng)與游動(dòng)細(xì)胞養(yǎng)殖器中游動(dòng)細(xì)胞紅球藻的生長周期、采收周期、采收數(shù)量、不動(dòng)孢子紅球藻積累油脂和蝦青素的生長周期相匹配，可以是1個(gè)，也可以是多個(gè)并聯(lián)操作，優(yōu)選為2-5個(gè)。本發(fā)明方法中，優(yōu)選情況下，步驟(3)中，轉(zhuǎn)移結(jié)束后，用去離子水清洗分離與儲(chǔ)運(yùn)裝置至中性以進(jìn)行下次分離和轉(zhuǎn)移，并將清洗液儲(chǔ)存?zhèn)溆谩＠缈梢詫⑶逑匆核椭燎逡汗拗袃?chǔ)存?zhèn)溆?。本發(fā)明方法中，優(yōu)選情況下，將清洗液回用至步驟(3)中，進(jìn)一步優(yōu)選地，回用的方式包括：將清洗液與雨生紅球藻游動(dòng)細(xì)胞在分離與儲(chǔ)運(yùn)裝置中混合后轉(zhuǎn)移至不動(dòng)孢子養(yǎng)殖器中進(jìn)行不動(dòng)孢子階段的培養(yǎng)；或者回用的方式包括：在不動(dòng)孢子階段的培養(yǎng)中，將清洗液轉(zhuǎn)移至不動(dòng)孢子養(yǎng)殖器中用于補(bǔ)充水分。本發(fā)明方法中，本領(lǐng)域技術(shù)人員應(yīng)該理解的是，步驟(4)中，可以通過光學(xué)顯微鏡觀察不動(dòng)孢子的轉(zhuǎn)紅狀態(tài)，當(dāng)不動(dòng)孢子從周邊到中心均變?yōu)榧t色時(shí)進(jìn)行分離。本發(fā)明方法中，優(yōu)選情況下，步驟(4)中，分離的方式為離心分離、過濾分離或重力沉降分離，進(jìn)一步優(yōu)選為重力沉降分離。本發(fā)明方法中，優(yōu)選情況下，將分離清液II返回至步驟(3)中回用的方式包括：將分離清液II通過泵輸送到分離與儲(chǔ)運(yùn)裝置，同分離出的雨生紅球藻游動(dòng)細(xì)胞混合均勻。進(jìn)一步優(yōu)選地，通過離心泵輸送分離清液II。本領(lǐng)域技術(shù)人員可以理解的是，為了方便分離清液II的回用，可以將分離清液II先儲(chǔ)存于清液罐中備用。本發(fā)明方法中，步驟(5)中，可以先將雨生紅球藻不動(dòng)孢子送至濃縮罐中再進(jìn)行干燥。對(duì)于干燥的方式?jīng)]有特別的限定，可以為本領(lǐng)域常用的各種干燥方式，優(yōu)選情況下，干燥的方式為自然干燥、真空干燥或噴霧干燥，進(jìn)一步優(yōu)選為旋風(fēng)噴霧干燥。實(shí)施例以下將通過實(shí)施例對(duì)本發(fā)明進(jìn)行詳細(xì)描述，但本發(fā)明不僅限于此。雨生紅球藻購自中科院武漢水生生物研究所。藻液的光密度值(OD值)測(cè)定：光密度值用分光光度計(jì)測(cè)定，以蒸餾水作對(duì)照，測(cè)定藻液在波長680nm處的吸光值，作為藻液濃度的指標(biāo)。培養(yǎng)時(shí)使用BG11培養(yǎng)基，培養(yǎng)基成份見表1-表2，在BG11培養(yǎng)基中NaNO3為氮源。表1BG11培養(yǎng)基組分含量，mg/LK2HPO4·3H2O40NaNO31500Na2CO320MgSO4·7H2O75CaCl2·2H2O36檸檬酸6檸檬酸鐵銨6EDTA-2Na1微量元素A51表2微量元素A5組分組成，mg/LH3BO32860MnCl2·4H2O1810ZnSO4·7H2O222CuSO4·5H2O79NaMoO4·5H2O390Co(NO3)2·6H2O50煉廠制氫尾氣為中國石化公司石家莊煉化分公司的煉廠制氫尾氣，二氧化碳的含量為20-25重量％，使用前進(jìn)行凈化除去固體顆粒物并進(jìn)行冷卻。冷卻至25℃后與空氣混合形成混合氣體，使得混合氣體中二氧化碳含量為6重量％，在雨生紅球藻培養(yǎng)過程中通過控制混合氣體的進(jìn)氣流量控制pH值。封閉式光生物反應(yīng)器為聚氯乙烯薄膜袋，直徑為220mm、高為1500mm、容積為35L，無內(nèi)導(dǎo)流筒。開放式光生物反應(yīng)器為透明聚丙烯箱體，容積為20L，受光面積為0.095m2。雨生紅球藻的養(yǎng)殖速率(g/m2/d)＝雨生紅球藻干重/雨生紅球藻游動(dòng)細(xì)胞培養(yǎng)階段的受光面積/雨生紅球藻游動(dòng)細(xì)胞培養(yǎng)階段的養(yǎng)殖時(shí)間。分離與儲(chǔ)運(yùn)裝置為一個(gè)30L的底部帶有玻砂過濾介質(zhì)的有機(jī)玻璃圓柱形分離空塔，高徑比為2:1，框式攪拌，帶有從頂部插入到底部的輸送管，并與不動(dòng)孢子養(yǎng)殖器連接，輸送管的直徑為10mm，玻砂的規(guī)格為G3，孔徑為15-30μm。實(shí)施例1本實(shí)施例用于說明利用封閉式光生物反應(yīng)器養(yǎng)殖雨生紅球藻的方法。本實(shí)施例中，游動(dòng)細(xì)胞養(yǎng)殖器和不動(dòng)孢子養(yǎng)殖器均為封閉式光生物反應(yīng)器。(1)雨生紅球藻的一級(jí)培養(yǎng)將雨生紅球藻藻種接種到裝有1000mLBG11培養(yǎng)基的2000mL三角瓶中，接種雨生紅球藻藻種后培養(yǎng)液的OD680值為0.015。在20-22℃、1800-2200Lux、pH值6-7下培養(yǎng)藻液至OD值為0.3，備用。培養(yǎng)過程中pH值由高純二氧化碳調(diào)節(jié)。(2)在1個(gè)封閉式光生物反應(yīng)器中進(jìn)行雨生紅球藻游動(dòng)細(xì)胞階段的培養(yǎng)：封閉式光生物反應(yīng)器消毒后加入28LBG11培養(yǎng)基和一級(jí)培養(yǎng)的雨生紅球藻藻種，培養(yǎng)液的初始OD680值為0.08?；旌蠚怏w從封閉式光生物反應(yīng)器底部通過氣石分散以鼓泡形式進(jìn)入，并產(chǎn)生攪動(dòng)、混合，進(jìn)氣流量為200L/h。在20-24℃、光照強(qiáng)度1800-5000Lux、pH值6-8下培養(yǎng)，pH值通過混合氣體的進(jìn)氣流量控制。(3)雨生紅球藻游動(dòng)細(xì)胞分離與轉(zhuǎn)移：培養(yǎng)7天后培養(yǎng)液的OD680值達(dá)到0.3，通過溢流轉(zhuǎn)移的方式將8.4L雨生紅球藻藻液從步驟(2)的封閉式光生物反應(yīng)器中轉(zhuǎn)移至分離與儲(chǔ)運(yùn)裝置。經(jīng)過玻砂過濾，得到分離清液I和雨生紅球藻游動(dòng)細(xì)胞，分離清液I進(jìn)入培養(yǎng)液介質(zhì)罐中與補(bǔ)充的培養(yǎng)基混合，經(jīng)過泵輸入步驟(2)的封閉式光生物反應(yīng)器中使得封閉式光生物反應(yīng) 器內(nèi)培養(yǎng)液的體積為28L，繼續(xù)雨生紅球藻游動(dòng)細(xì)胞階段的培養(yǎng)。8.4L液體由清液罐經(jīng)泵送入分離與儲(chǔ)運(yùn)裝置，與過濾得到的雨生紅球藻游動(dòng)細(xì)胞混合。混合均勻后抽真空，混合液經(jīng)過輸送管進(jìn)入不動(dòng)孢子養(yǎng)殖器。(4)分離與儲(chǔ)運(yùn)裝置洗滌：真空轉(zhuǎn)移結(jié)束后，加入去離子水清洗分離與儲(chǔ)運(yùn)裝置至中性，清洗液進(jìn)入清液罐備用。(5)在2個(gè)并聯(lián)的不動(dòng)孢子養(yǎng)殖器，即封閉式光生物反應(yīng)器中進(jìn)行雨生紅球藻不動(dòng)孢子轉(zhuǎn)化、油脂和蝦青素的積累：混合液真空轉(zhuǎn)移至第1個(gè)封閉式光生物反應(yīng)器后，以每升混合藻液計(jì)，加入0.02mol脅迫劑碳酸氫鈉，進(jìn)行不動(dòng)孢子轉(zhuǎn)化、油脂和蝦青素的積累。培養(yǎng)時(shí)溫度為28-32℃，光照強(qiáng)度為5000-15000Lux，pH值為7-9?；旌蠚怏w從封閉式光生物反應(yīng)器底部通過氣石分散以鼓泡形式進(jìn)入，并產(chǎn)生攪動(dòng)、混合，混合氣體的進(jìn)氣量為60L/h，pH值通過混合氣體的進(jìn)氣流量控制。培養(yǎng)10天后在光學(xué)顯微鏡下觀察，不動(dòng)孢子從周邊到中心均變?yōu)榧t色，停止進(jìn)氣，靜置分離，得到分離清液II和雨生紅球藻不動(dòng)孢子，分離清液II進(jìn)入清液罐，雨生紅球藻不動(dòng)孢子進(jìn)入濃縮罐并經(jīng)過旋風(fēng)噴霧干燥后得到雨生紅球藻藻粉。待步驟(3)中用于雨生紅球藻游動(dòng)細(xì)胞階段培養(yǎng)的封閉式光生物反應(yīng)器中培養(yǎng)液的OD680值達(dá)到0.3時(shí)，重復(fù)步驟(3)將混合液轉(zhuǎn)移至第2個(gè)不動(dòng)孢子養(yǎng)殖器，即第2個(gè)封閉式光生物反應(yīng)器。依次循環(huán)。按雨生紅球藻游動(dòng)細(xì)胞培養(yǎng)階段的培養(yǎng)液的總體積計(jì)，雨生紅球藻的養(yǎng)殖速率為3g/m2/d，得到的雨生紅球藻中油脂的含量為36％，蝦青素的含量為1.5％。實(shí)施例2本實(shí)施例用于說明利用開放式光生物反應(yīng)器養(yǎng)殖雨生紅球藻的方法。本實(shí)施例中，游動(dòng)細(xì)胞養(yǎng)殖器和不動(dòng)孢子養(yǎng)殖器均為開放式光生物反應(yīng)器。(1)雨生紅球藻的一級(jí)培養(yǎng)將雨生紅球藻藻種接種到裝有1000mLBG11培養(yǎng)基的2000mL三角瓶中，接種雨生紅球藻藻種后培養(yǎng)液的OD680值為0.015。在20-22℃、1800-2200Lux、pH值6-7下培養(yǎng)藻液至OD值為0.3，備用。培養(yǎng)過程中pH值由高純二氧化碳調(diào)節(jié)。(2)在1個(gè)開放式光生物反應(yīng)器中進(jìn)行雨生紅球藻游動(dòng)細(xì)胞階段的培養(yǎng)：在開放式光生物反應(yīng)器中加入16LBG11培養(yǎng)基和一級(jí)培養(yǎng)的雨生紅球藻藻種，培養(yǎng)液的初始OD680值為0.03?；旌蠚怏w通過氣石分散以鼓泡形式進(jìn)入光生物反應(yīng)器，并產(chǎn)生攪動(dòng)、混合，進(jìn)氣流量為80L/h。在22-25℃、光照強(qiáng)度1800-5000Lux、pH值6-8下培養(yǎng)，pH值通過混合氣體的進(jìn)氣流量控制。(3)雨生紅球藻游動(dòng)細(xì)胞分離與轉(zhuǎn)移：培養(yǎng)8天后培養(yǎng)液的OD680值達(dá)到0.28，通過溢流轉(zhuǎn)移的方式將4.8L雨生紅球藻藻液從步驟(2)的開放式光生物反應(yīng)器中轉(zhuǎn)移至分離與儲(chǔ)運(yùn)裝置。經(jīng)過玻砂過濾，得到分離清液I和雨生紅球藻游動(dòng)細(xì)胞，分離清液I進(jìn)入培養(yǎng)液介質(zhì)罐中與補(bǔ)充的培養(yǎng)基混合，經(jīng)過泵輸入步驟(2)的開放式光生物反應(yīng)器中使得開放式光生物反應(yīng)器內(nèi)培養(yǎng)液的體積為16L，繼續(xù)雨生紅球藻游動(dòng)細(xì)胞階段的培養(yǎng)。4.8L液體由清液罐經(jīng)泵送入分離與儲(chǔ)運(yùn)裝置，與過濾得到的雨生紅球藻游動(dòng)細(xì)胞混合?；旌暇鶆蚝?，混合液經(jīng)過輸送管虹吸進(jìn)入不動(dòng)孢子養(yǎng)殖器。(4)分離與儲(chǔ)運(yùn)裝置洗滌：虹吸轉(zhuǎn)移結(jié)束后，加入去離子水清洗分離與儲(chǔ)運(yùn)裝置至中性，清洗液進(jìn)入清液罐備用。(5)在2個(gè)并聯(lián)的不動(dòng)孢子養(yǎng)殖器，即開放式光生物反應(yīng)器中進(jìn)行雨生紅球藻不動(dòng)孢子轉(zhuǎn)化、油脂和蝦青素的積累：混合液虹吸轉(zhuǎn)移至第1個(gè)開 放式光生物反應(yīng)器后，以每升混合藻液計(jì)，加入0.03mol脅迫劑碳酸氫鈉，進(jìn)行不動(dòng)孢子轉(zhuǎn)化、油脂和蝦青素的積累。培養(yǎng)時(shí)溫度為28-32℃，光照強(qiáng)度為5000-15000Lux，pH值為7-9?；旌蠚怏w通過氣石分散以鼓泡形式進(jìn)入開放式光生物反應(yīng)器，并產(chǎn)生攪動(dòng)、混合，混合氣體的進(jìn)氣量為40L/h，pH值通過混合氣體的進(jìn)氣流量控制。培養(yǎng)10天后在光學(xué)顯微鏡下觀察，不動(dòng)孢子從周邊到中心均變?yōu)榧t色，停止進(jìn)氣，靜置分離，得到分離清液II和雨生紅球藻不動(dòng)孢子，分離清液II進(jìn)入清液罐，雨生紅球藻不動(dòng)孢子進(jìn)入濃縮罐并經(jīng)過真空干燥后得到雨生紅球藻藻粉。待步驟(3)中用于雨生紅球藻游動(dòng)細(xì)胞階段培養(yǎng)的開放式光生物反應(yīng)器中培養(yǎng)液的OD680值達(dá)到0.28時(shí)，重復(fù)步驟(3)將混合液轉(zhuǎn)移至第2個(gè)不動(dòng)孢子養(yǎng)殖器，即開放式光生物反應(yīng)器。依次循環(huán)。按雨生紅球藻游動(dòng)細(xì)胞培養(yǎng)階段的培養(yǎng)液的總體積計(jì)，雨生紅球藻的養(yǎng)殖速率為2.7g/m2/d，得到的雨生紅球藻中油脂的含量為35％，蝦青素的含量為1.6％。實(shí)施例3本實(shí)施例用于說明利用復(fù)合式光生物反應(yīng)器養(yǎng)殖雨生紅球藻的方法。本實(shí)施例中，游動(dòng)細(xì)胞養(yǎng)殖器為封閉式光生物反應(yīng)器，不動(dòng)孢子養(yǎng)殖器為開放式光生物反應(yīng)器。(1)雨生紅球藻的一級(jí)培養(yǎng)將雨生紅球藻藻種接種到裝有1000mLBG11培養(yǎng)基的2000mL三角瓶中，接種雨生紅球藻藻種后培養(yǎng)液的OD680值為0.015。在20-22℃、1800-2200Lux、pH值6-7下培養(yǎng)藻液至OD值為0.3，備用。培養(yǎng)過程中pH值由高純二氧化碳調(diào)節(jié)。(2)在1個(gè)封閉式光生物反應(yīng)器中進(jìn)行雨生紅球藻游動(dòng)細(xì)胞階段的培養(yǎng)：在封閉式光生物反應(yīng)器中加入28LBG11培養(yǎng)基和一級(jí)培養(yǎng)的雨生紅球藻藻種，培養(yǎng)液的初始OD680值為0.075?；旌蠚怏w通過氣石分散以鼓泡形式進(jìn)入光生物反應(yīng)器，并產(chǎn)生攪動(dòng)、混合，進(jìn)氣流量為200L/h。在20-24℃、光照強(qiáng)度1800-5000Lux、pH值6-8下培養(yǎng)，pH值通過混合氣體的進(jìn)氣流量控制。(3)雨生紅球藻游動(dòng)細(xì)胞分離與轉(zhuǎn)移：培養(yǎng)7天后培養(yǎng)液的OD680值達(dá)到0.31，通過溢流轉(zhuǎn)移的方式將8.4L雨生紅球藻藻液從步驟(2)的封閉式光生物反應(yīng)器中轉(zhuǎn)移至分離與儲(chǔ)運(yùn)裝置。經(jīng)過玻砂過濾，得到分離清液I和雨生紅球藻游動(dòng)細(xì)胞，分離清液I進(jìn)入培養(yǎng)液介質(zhì)罐中與補(bǔ)充的培養(yǎng)基混合，經(jīng)過泵輸入步驟(2)的封閉式光生物反應(yīng)器中使得封閉式光生物反應(yīng)器內(nèi)培養(yǎng)液的體積為28L，繼續(xù)雨生紅球藻游動(dòng)細(xì)胞階段的培養(yǎng)。8.4L液體由清液罐經(jīng)泵送入分離與儲(chǔ)運(yùn)裝置，與過濾得到的雨生紅球藻游動(dòng)細(xì)胞混合。混合均勻后，混合液經(jīng)過輸送管虹吸進(jìn)入不動(dòng)孢子養(yǎng)殖器。(4)分離與儲(chǔ)運(yùn)裝置洗滌：虹吸轉(zhuǎn)移結(jié)束后，加入去離子水清洗分離與儲(chǔ)運(yùn)裝置至中性，清洗液進(jìn)入清液罐備用。(5)在2個(gè)并聯(lián)的不動(dòng)孢子養(yǎng)殖器，即開放式光生物反應(yīng)器中進(jìn)行雨生紅球藻不動(dòng)孢子轉(zhuǎn)化、油脂和蝦青素的積累：混合液虹吸轉(zhuǎn)移至第1個(gè)開放式光生物反應(yīng)器后，以每升混合藻液計(jì)，加入0.05mol脅迫劑碳酸氫鈉，進(jìn)行不動(dòng)孢子轉(zhuǎn)化、油脂和蝦青素的積累。培養(yǎng)時(shí)溫度為28-32℃，光照強(qiáng)度為5000-15000Lux，pH值為7-9?；旌蠚怏w通過氣石分散以鼓泡形式進(jìn)入光生物反應(yīng)器，并產(chǎn)生攪動(dòng)、混合，混合氣體的進(jìn)氣量為40L/h，pH值通過混合氣體的進(jìn)氣流量控制。培養(yǎng)10天后在光學(xué)顯微鏡下觀察，不動(dòng)孢子從周邊到中心均變?yōu)榧t色，停止進(jìn)氣，靜置分離，得到分離清液II和雨生紅球藻不動(dòng)孢子，分離清液II 進(jìn)入清液罐，雨生紅球藻不動(dòng)孢子進(jìn)入濃縮罐并經(jīng)過旋風(fēng)噴霧干燥后得到雨生紅球藻藻粉。待步驟(3)中用于雨生紅球藻游動(dòng)細(xì)胞階段培養(yǎng)的封閉式光生物反應(yīng)器中培養(yǎng)液的OD680值達(dá)到0.31時(shí)，重復(fù)步驟(3)將混合液轉(zhuǎn)移至第2個(gè)不動(dòng)孢子養(yǎng)殖器，即開放式光生物反應(yīng)器。依次循環(huán)。按雨生紅球藻游動(dòng)細(xì)胞培養(yǎng)階段的培養(yǎng)液的總體積計(jì)，雨生紅球藻的養(yǎng)殖速率為3.1g/m2/d，得到的雨生紅球藻中油脂的含量為39％，蝦青素的含量為1.5％。實(shí)施例4本實(shí)施例用于說明利用復(fù)合式光生物反應(yīng)器養(yǎng)殖雨生紅球藻的方法。本實(shí)施例中，游動(dòng)細(xì)胞養(yǎng)殖器為開放式光生物反應(yīng)器，不動(dòng)孢子養(yǎng)殖器為封閉式光生物反應(yīng)器。(1)雨生紅球藻的一級(jí)培養(yǎng)將雨生紅球藻藻種接種到裝有1000mLBG11培養(yǎng)基的2000mL三角瓶中，接種雨生紅球藻藻種后培養(yǎng)液的OD680值為0.015。在20-22℃、1800-2200Lux、pH值6-7下培養(yǎng)藻液至OD值為0.3，備用。培養(yǎng)過程中pH值由高純二氧化碳調(diào)節(jié)。(2)在1個(gè)開放式光生物反應(yīng)器中進(jìn)行雨生紅球藻游動(dòng)細(xì)胞階段的培養(yǎng)：在開放式光生物反應(yīng)器中加入16LBG11培養(yǎng)基和一級(jí)培養(yǎng)的雨生紅球藻藻種，培養(yǎng)液的初始OD680值為0.025?；旌蠚怏w通過氣石分散以鼓泡形式進(jìn)入光生物反應(yīng)器，并產(chǎn)生攪動(dòng)、混合，進(jìn)氣流量為80L/h。在22-25℃、光照強(qiáng)度1800-5000Lux、pH值6-8下培養(yǎng)，pH值通過混合氣體的進(jìn)氣流量控制。(3)雨生紅球藻游動(dòng)細(xì)胞分離與轉(zhuǎn)移：培養(yǎng)7天后培養(yǎng)液的OD680值 達(dá)到0.29，通過溢流轉(zhuǎn)移的方式將4.8L雨生紅球藻藻液從步驟(2)的開放式光生物反應(yīng)器中轉(zhuǎn)移至分離與儲(chǔ)運(yùn)裝置。經(jīng)過玻砂過濾，得到分離清液I和雨生紅球藻游動(dòng)細(xì)胞，分離清液I進(jìn)入培養(yǎng)液介質(zhì)罐中與補(bǔ)充的培養(yǎng)基混合，經(jīng)過泵輸入步驟(2)的開放式光生物反應(yīng)器中使得開放式光生物反應(yīng)器內(nèi)培養(yǎng)液的體積為16L，繼續(xù)雨生紅球藻游動(dòng)細(xì)胞階段的培養(yǎng)。4.8L液體由清液罐經(jīng)泵送入分離與儲(chǔ)運(yùn)裝置，與過濾得到的雨生紅球藻游動(dòng)細(xì)胞混合?；旌暇鶆蚝?，混合液經(jīng)過輸送管進(jìn)入不動(dòng)孢子養(yǎng)殖器。(4)分離與儲(chǔ)運(yùn)裝置洗滌：真空轉(zhuǎn)移結(jié)束后，加入去離子水清洗分離與儲(chǔ)運(yùn)裝置至中性，清洗液進(jìn)入清液罐備用。(5)在2個(gè)并聯(lián)的不動(dòng)孢子養(yǎng)殖器，即封閉式光生物反應(yīng)器中進(jìn)行雨生紅球藻不動(dòng)孢子轉(zhuǎn)化、油脂和蝦青素的積累：混合液真空轉(zhuǎn)移至第1個(gè)封閉式光生物反應(yīng)器后，以每升混合藻液計(jì)，加入0.02mol脅迫劑碳酸氫鈉，進(jìn)行不動(dòng)孢子轉(zhuǎn)化、油脂和蝦青素的積累。培養(yǎng)時(shí)溫度為28-32℃，光照強(qiáng)度為5000-15000Lux，pH值為7-9?；旌蠚怏w從封閉式光生物反應(yīng)器底部通過氣石分散以鼓泡形式進(jìn)入，并產(chǎn)生攪動(dòng)、混合，混合氣體的進(jìn)氣量為60L/h，pH值通過混合氣體的進(jìn)氣流量控制。培養(yǎng)10天后在光學(xué)顯微鏡下觀察，不動(dòng)孢子從周邊到中心均變?yōu)榧t色，停止進(jìn)氣，靜置分離，得到分離清液II和雨生紅球藻不動(dòng)孢子，分離清液II進(jìn)入清液罐，雨生紅球藻不動(dòng)孢子進(jìn)入濃縮罐并經(jīng)過真空干燥后得到雨生紅球藻藻粉。待步驟(3)中用于雨生紅球藻游動(dòng)細(xì)胞階段培養(yǎng)的開放式光生物反應(yīng)器中培養(yǎng)液的OD680值達(dá)到0.29時(shí)，重復(fù)步驟(3)將混合液轉(zhuǎn)移至第2個(gè)不動(dòng)孢子養(yǎng)殖器，即封閉式光生物反應(yīng)器。依次循環(huán)。按雨生紅球藻游動(dòng)細(xì)胞培養(yǎng)階段的培養(yǎng)液的總體積計(jì)，雨生紅球藻的養(yǎng)殖速率為2.6g/m2/d，得到的雨生紅球藻中油脂的含量為38％，蝦青素的含量 為1.8％。本發(fā)明的雨生紅球藻的養(yǎng)殖方法，游動(dòng)細(xì)胞階段的培養(yǎng)和不動(dòng)孢子階段的培養(yǎng)在不同的反應(yīng)器中進(jìn)行，養(yǎng)殖過程操作穩(wěn)定，質(zhì)量控制容易，且在養(yǎng)殖過程中所有培養(yǎng)液都可以回收利用，養(yǎng)殖成本低且不會(huì)產(chǎn)生廢液排放和環(huán)境污染的問題。以上詳細(xì)描述了本發(fā)明的優(yōu)選實(shí)施方式，但是，本發(fā)明并不限于上述實(shí)施方式中的具體細(xì)節(jié)，在本發(fā)明的技術(shù)構(gòu)思范圍內(nèi)，可以對(duì)本發(fā)明的技術(shù)方案進(jìn)行多種簡單變型，這些簡單變型均屬于本發(fā)明的保護(hù)范圍。另外需要說明的是，在上述具體實(shí)施方式中所描述的各個(gè)具體技術(shù)特征，在不矛盾的情況下，可以通過任何合適的方式進(jìn)行組合，為了避免不必要的重復(fù)，本發(fā)明對(duì)各種可能的組合方式不再另行說明。此外，本發(fā)明的各種不同的實(shí)施方式之間也可以進(jìn)行任意組合，只要其不違背本發(fā)明的思想，其同樣應(yīng)當(dāng)視為本發(fā)明所公開的內(nèi)容。當(dāng)前第1頁1 2 3