本發(fā)明涉及生物技術(shù)領(lǐng)域，具體地說，涉及ISLR蛋白在骨骼肌中調(diào)控Wnt信號通路中的應用。

背景技術(shù)：

Immunoglobulin Superfamily Containing Leucine-Rich Repeat(ISLR，富含亮氨酸重復序列的免疫球蛋白樣蛋白)是1997年由Nagasawa等人從人類視網(wǎng)膜消減文庫中研究分析得到的一種新蛋白，屬于免疫球蛋白超家族成員。ISLR蛋白是一種在各物種間都十分保守的蛋白，從基因結(jié)構(gòu)上，它主要存在兩種剪切體，這兩種剪接體的差異在于5’UTR的不同，其編碼的蛋白質(zhì)是完全相同的。該蛋白包含一個富含亮氨酸的重復序列(LRR)和類免疫球蛋白(Ig)的結(jié)構(gòu)域，這些結(jié)構(gòu)域在許多重要的蛋白中都存在。因此該蛋白具有很大的研究價值。

眾所周知，Wnt經(jīng)典信號通路對于骨骼肌的發(fā)育是至關(guān)重要的，它可以直接調(diào)控Pax3、Pax7和Myf5的表達；另外，Wnt經(jīng)典信號通路在維持衛(wèi)星細胞的數(shù)量，自我更新以及分化方面也發(fā)揮著重要的功能；其次，Wnt經(jīng)典信號通路對于肌纖維的肥大和肌纖維的類型轉(zhuǎn)換也有著非常重要的功能；最后，Wnt經(jīng)典信號通路也與許多骨骼肌疾病相關(guān)，在老年鼠中表現(xiàn)出高活性Wnt經(jīng)典信號通路，這將導致肌肉衛(wèi)星細胞分化出現(xiàn)纖維化，肌肉纖維化的出現(xiàn)將會嚴重影響骨骼肌發(fā)揮功能。

技術(shù)實現(xiàn)要素：

本發(fā)明的目的是提供ISLR蛋白在骨骼肌中調(diào)控Wnt信號通路中的應用。

為了實現(xiàn)本發(fā)明目的，本發(fā)明提供的ISLR蛋白在骨骼肌中調(diào)控Wnt信號通路中的應用，其是通過在成肌細胞中過表達ISLR蛋白，使ISLR蛋白通過正調(diào)控Dvl2基因進而影響Wnt信號通路和促進動物骨骼肌發(fā)育。

前述的應用是指構(gòu)建ISLR基因的過表達載體，通過電轉(zhuǎn)染的方法，將所述載體轉(zhuǎn)染到小鼠成肌細胞中，通過抗性篩選標記獲得ISLR蛋白穩(wěn)定過表達的小鼠成肌細胞，然后將細胞用誘導分化培養(yǎng)基培養(yǎng)。

所述載體的出發(fā)載體為pCDNA3.1。

所述誘導分化培養(yǎng)基為含有2％馬血清的DMEM高糖培養(yǎng)基。

培養(yǎng)條件為：5％CO₂，37℃培養(yǎng)。

本發(fā)明還提供ISLR基因穩(wěn)定干擾細胞系，所述細胞系是根據(jù)ISLR基因設計shRNA，將所述shRNA轉(zhuǎn)染到小鼠成肌細胞中構(gòu)建得到的，其中所述shRNA的編碼序列為5′-TATTGGTGCTCTGGCCCCTCTGAGCCATC-3′。

本發(fā)明還提供ISLR基因穩(wěn)定過表達細胞系，其特征在于，所述細胞系是通過將ISLR基因的過表達載體轉(zhuǎn)染到小鼠成肌細胞中構(gòu)建得到的。

通過對上述兩個細胞系進行表型觀察，尤其是干擾細胞系，發(fā)現(xiàn)穩(wěn)定干擾細胞系在含2％馬血清的DMEM誘導培養(yǎng)基中，進行誘導分化不能形成成熟的肌管，針對這一表型進行了深入的分子機制的研究，通過對Wnt通路相關(guān)組分進行Western Blot、定量PCR以及免疫熒光分析，發(fā)現(xiàn)ISLR蛋白確實是通過影響Dvl2基因的表達來發(fā)揮功能的。

本發(fā)明首次利用基因克隆技術(shù)以及細胞培養(yǎng)技術(shù)獲得了ISLR基因穩(wěn)定過表達以及ISLR基因穩(wěn)定干擾的小鼠成肌細胞，證明了ISLR蛋白通過影響Dvl2基因的表達，進而參與到Wnt經(jīng)典信號通路和動物 骨骼肌發(fā)育中，這也是世界上首次在小鼠成肌細胞中研究ISLR蛋白的功能，可以通過選擇藥物靶向ISLR蛋白，直接調(diào)控Wnt經(jīng)典信號通路，為治療肌肉萎縮癥和肌肉纖維化提供新的可靠的途徑。

附圖說明

圖1為本發(fā)明實施例1中構(gòu)建的ISLR基因穩(wěn)定干擾細胞系在誘導分化培養(yǎng)基中的培養(yǎng)結(jié)果；其中，Ctrl shRNA代表對照組細胞系，ISLR shRNA代表穩(wěn)定干擾細胞系。

圖2為本發(fā)明實施例2中采用CHIR激活Wnt經(jīng)典信號通路后，ISLR基因穩(wěn)定干擾細胞系能夠進行正常分化。

具體實施方式

以下實施例用于說明本發(fā)明，但不用來限制本發(fā)明的范圍。若未特別指明，實施例中所用的技術(shù)手段為本領(lǐng)域技術(shù)人員所熟知的常規(guī)手段，所用原料均為市售商品。

實施例1 ISLR基因穩(wěn)定干擾細胞系的篩選

根據(jù)ISLR基因設計shRNA，將所述shRNA轉(zhuǎn)染到小鼠成肌細胞中，即構(gòu)建得到ISLR基因穩(wěn)定干擾細胞系，其在誘導分化培養(yǎng)基中不能夠正常分化(圖1)。

通過軟件評估，對ISLR基因的ORF設計了4個shRNA靶點，將這4個shRNA序列分別連接到pGFP-V-RS載體中，通過驗證發(fā)現(xiàn)其中一個shRNA干擾效率最高，所述shRNA的編碼序列為5′-TATTGGTGCTCTGGCCCCTCTGAGCCATC-3′。

將含有上述shRNA的載體電轉(zhuǎn)染到C2C12細胞當中，細胞生長24小時后，用嘌呤霉素進行篩選，嘌呤霉素濃度為2μg/ml，篩選一周后，抗性C2C12細胞生長成團，將其挑出，共31個單克隆。提取31個單克隆的基因組，對其進行PCR鑒定，獲得10個陽性單克隆。對這些陽性克隆進一步進行定量PCR和Western驗證，共找到6個確實能夠干擾ISLR基因的克隆，選取其中一個克隆進行后期誘導分化試驗。

為了保證試驗的嚴謹性，在篩選過程中同步篩選到一個插入了Scrambled片段的對照組細胞系(Ctrl shRNA0，Scrambled是一段含29個堿基的無意義干擾序列，理論上對細胞沒有影響。

實施例2 Wnt通路的激活試驗

向ISLR基因穩(wěn)定干擾細胞系的誘導分化培養(yǎng)基中添加Wnt經(jīng)典通路激活劑CHIR對其進行激活，CHIR濃度為3μmol/L，通過激活Wnt通路，發(fā)現(xiàn)確實援救了ISLR基因穩(wěn)定干擾細胞系不能分化的表型(圖2)。

實施例1和2中使用的誘導分化培養(yǎng)基為含有2％馬血清的DMEM高塘培養(yǎng)基。

實施例3 ISLR基因穩(wěn)定過表達細胞系的篩選

通過將ISLR基因的過表達載體轉(zhuǎn)染到小鼠成肌細胞中構(gòu)建得到ISLR基因穩(wěn)定過表達細胞系。

首先從小鼠cDNA文庫中對ISLR基因進行PCR擴增，擴增引物如下：

上游引物：5′-AAGTTTAAACGCCACCATGCGGGCACTGTGC-3′

下游引物：5′-CCGTTTAAACTTAGAAGTAGAAAAAGGAGA-3′

PCR獲得ISLR基因的ORF全長，然后用PmeI對pcDNA3.1載體和PCR產(chǎn)物進行酶切，酶切完成后，用T4連接酶進行連接，轉(zhuǎn)化大腸桿菌感受態(tài)細胞，涂板劃線。對得到的菌落進行PCR驗證以及測序，選取陽性菌落并對其提取質(zhì)粒。

然后，采用電轉(zhuǎn)染的方法將質(zhì)粒轉(zhuǎn)染到C2C12細胞當中，用G418抗性進行篩選，G418濃度為800μg/ml，進行10天抗性篩選，獲得了38個陽性單克隆。

對這些陽性單克隆提取基因組，并進行PCR驗證插入片段的完整性，確定了2個正確插入的單克隆。最后，對這兩個單克隆進行定量PCR和Western驗證，發(fā)現(xiàn)只有一個陽性克隆，并進行后期實驗。

通過對該過表達ISLR基因的陽性單克隆細胞系進行驗證，穩(wěn)定過表達ISLR蛋白后能夠促進成肌細胞的早期分化，與穩(wěn)定干擾細胞系的結(jié)果正好相反，從而進一步驗證了ISLR蛋白在骨骼肌中調(diào)控Wnt信號通路中的用途。

雖然，上文中已經(jīng)用一般性說明及具體實施方案對本發(fā)明作了詳盡的描述，但在本發(fā)明基礎(chǔ)上，可以對之作一些修改或改進，這對本領(lǐng)域技術(shù)人員而言是顯而易見的。因此，在不偏離本發(fā)明精神的基礎(chǔ)上所做的這些修改或改進，均屬于本發(fā)明要求保護的范圍。