本發(fā)明屬于分子生物醫(yī)學(xué)技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及特異識別甲型流感病毒H1N1型和H3N2型的寡核苷酸配基A8、A20與其所有截短后的序列和修飾，以及修飾后的序列在識別甲型流感病毒H1N1型和H3N2型方面的應(yīng)用。本發(fā)明涉及A8、A20與其所有截短序列在生物醫(yī)藥方面的應(yīng)用。A8、A20與其所有截短序列作為試劑盒的組成部分或者檢測指標(biāo)，用于感染甲流病毒患者或者的輔助診斷和甲型流感病毒H1N1，H3N2型的檢測。A8、A20與其所有截短序列結(jié)合納米金技術(shù)作為H1N1、H3N2型甲型流感快速可視化檢測方法及檢測試劑盒。

背景技術(shù)：

指數(shù)富集的配基系統(tǒng)進(jìn)化技術(shù)，簡稱SELEX(Systematic Evolution of Ligands by EXponential Enrichment)技術(shù)，是近十幾年興起并迅速得到發(fā)展的高通量生物文庫篩選技術(shù)。應(yīng)用大容量的隨機寡核苷酸文庫(ssDNA文庫和RNA文庫)，結(jié)合PCR體外擴增技術(shù)，以指數(shù)級富集與靶分子特異結(jié)合的寡核苷酸，經(jīng)過反復(fù)的體外篩選、擴增，最終獲得的寡核苷酸配基(aptamer)基于空間結(jié)構(gòu)與靶分子呈高特異性和高親和力的結(jié)合。由于aptamer具有精確識別、無免疫原性、易體外合成與修飾等優(yōu)點，又稱為“人工替代抗體”，在基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)、臨床診斷與新藥研發(fā)等方面具有廣闊的應(yīng)用前景。尤其是近年來興起的復(fù)合靶SELEX技術(shù)，使得對未知靶分子進(jìn)行篩選成為可能，并且通過引入消減篩選步驟，能夠獲得特異識別兩組復(fù)合靶子中差異存在分子的aptamer，并能利用該配基反過來對差異靶分子進(jìn)行研究，這就為開發(fā)新型分子探針以及鑒定生物標(biāo)志物，尤其是腫瘤標(biāo)志物分子開辟了新的途徑。

流感病毒根據(jù)其核蛋白的抗原性可以分為三類：甲乙丙，或ABC型。H1N1、 H3N2型甲流病毒為比較常見的人類感染的流感病毒，分別曾經(jīng)在西班牙與香港造成流感疫情爆發(fā)。甲型流感病毒表面的糖蛋白∶血凝素(HA)和神經(jīng)氨酸酶(NA)常發(fā)生抗原漂移以及抗原裝換，使流感疫苗的作用失效，從而再次引發(fā)流感疫情的爆發(fā)。因此，研究能夠區(qū)分甲型病毒的適配體，可以為甲型流感病毒的檢測和治療提供幫助。

本發(fā)明是通過SELEX技術(shù)獲得了寡核苷酸配基A8、A20。經(jīng)鑒定，兩條序列都能夠特異識別H1N1，H3N2型甲流病毒，而不結(jié)合其他相關(guān)病毒，對照核酸序列與上述病毒均無結(jié)合。在此基礎(chǔ)上將其截短，發(fā)現(xiàn)截短序列A8S、A8S8、A8SSS、A20S和A20S8序列和A8、A20特性一致，并且結(jié)合力更高。

通過結(jié)合膠體金技術(shù)，實現(xiàn)了對于檢測H1N1、H3N2型的快速可視化檢測。此標(biāo)記方法，使得寡核苷酸配基標(biāo)記膠體金具有速度更快，檢測靶標(biāo)耗時更短的優(yōu)勢。在一分鐘內(nèi)即可實現(xiàn)對H1N1、H3N2型甲流病毒的有效檢測。

技術(shù)實現(xiàn)要素：

本發(fā)明的目的在于提供寡核苷酸A8、A20以及其所有截短序列作為H1N1、H3N2型甲流病毒的特異性適配體，并作為檢測H1N1、H3N2型甲流病毒的分子標(biāo)志物。

本發(fā)明的目的還在于提供一種非診斷目的H1N1、H3N2型甲流病毒檢測方法(ELISA法)。還包括A8、A20以及其所有截短序列作為試劑盒的組成部分或者檢測指標(biāo)用于適配體結(jié)合膠體金對H1N1、H3N2型甲流病毒的快速可視化檢測。

寡核苷酸序列A8、A20以及其截短序列A8S、A8S8、A8SSS、A20S和A20S8序列如序列表中SEQ ID No.1，SEQ ID No.2，SEQ ID No.3，SEQ ID No.4，SEQ ID No.5，SEQ ID No.6，SEQ ID No.7所示。

附圖說明

圖1是經(jīng)過SELEX篩選后得到的A8、A20寡核苷酸序列與H1N1、H3N2型甲流病毒，以及乙流、副流感123型的結(jié)合力對比圖。

圖2是寡核苷酸序列A8、A20以及其截短序列A8S、A8S8、A20S和A20S8序列與H1N1、H3N2型甲流病毒的結(jié)合力對比結(jié)果。

圖3是寡核苷酸序列A8、A20以及其截短序列A8S8、A20S和A20S8序列與H1N1、H3N2型甲流病毒的KD值測定曲線結(jié)果。

圖4是結(jié)合膠體金快速可視化檢測H1N1、H3N2型甲流病毒的結(jié)果。

具體實施方式

下面結(jié)合附圖和具體實施例對本發(fā)明做進(jìn)一步說明。

以下實施例未說明的實驗步驟參照《分子克隆實驗指南》第三版。

實施例1 A8、A20寡核苷酸序列與H1N1、H3N2型甲流病毒，以及乙流、副流感123型的結(jié)合力對比

(1)合成生物素標(biāo)記的Bio-A8、Bio-A20序列。

(2)將流感病毒分別混合于pH 9.7的碳酸鹽緩沖液中，按照100μl/孔加入到酶聯(lián)條中，4℃包被過夜。

(3)棄包被液，每孔加入100μl的封閉液，37℃溫箱封閉30min。

(4)將Bio-A8、Bio-A20序列溶解于孵育緩沖液中(1×PBS-5mmolMgCl2)，于100℃變性5min后立即置于冰上充分冷卻。

(5)經(jīng)過變性處理后的序列加入酶聯(lián)條中，使核酸序列與包被的病毒共同孵育37℃，30min。

(6)棄去孔內(nèi)液體，每孔用200μl的洗滌液洗滌，重復(fù)洗滌5次，最后一次洗滌后要把孔內(nèi)液體完全吸干。

(7)每孔加入100μl按照1∶300稀釋好的HRP酶，37℃孵育30min，棄去孔內(nèi)液體，洗板5次，方法同上。

(8)每孔加入100μl TMB顯色底物，37℃避光顯色，當(dāng)有明顯顏色變化時，加100μl終止液，酶聯(lián)儀OD450nm波長讀數(shù)。

截短序列的結(jié)合力對比以及KD值的計算實施方法與此法相同。

圖1結(jié)果顯示，A8、A20序列與H1N1、H3N2型甲流病毒有特異性結(jié)合，并且與乙流，副流感1、2、3型無結(jié)合。(B5序列為陰性對照)

圖2結(jié)果顯示，A8序列的截短序列A8S、A8S8和A20序列的截短序列A20S、A20S8均與H1N1、H3N2型甲流病毒有特異性結(jié)合。(B5序列為陰性對照)

圖3結(jié)果顯示，不同寡核苷酸序列的投入與H1N1、H3N2型甲流病毒的結(jié)合力關(guān)系圖，經(jīng)計算得到A8序列與H1N1、H3N2型甲流病毒結(jié)合的平衡解離常數(shù)KD值，約為23.98±6.387nmol/L、21.08±5.112nmol/L；A8S8與H1N1、H3N2型甲流病毒結(jié)合的平衡解離常數(shù)KD值，約為4.746±2.860nmol/L、11.34±7.686nmol/L；A20序列與H1N1、H3N2型甲流病毒結(jié)合的平衡解離常數(shù)KD值，約為42.44±15.36nmol/L、30.65±11.32nmol/L；A20S與H1N1、H3N2型甲流病毒結(jié)合的平衡解離常數(shù)KD值，約為5.559±4.141nmol/L、5.838±3.937nmol/L；A20S8與H1N1、H3N2型甲流病毒結(jié)合的平衡解離常數(shù)KD值，約為7.657±3.397nmol/L、6.175±3.018nmol/L。

實施例2 結(jié)合膠體金快速可視化檢測H1N1、H3N2甲流病毒

(1)將25μL膠體金溶液與75μL水溶液混合，調(diào)到適合的pH。

(2)將截短的寡核苷酸序列A8SSS變性處理，隨后加入到膠體金溶液中進(jìn)行標(biāo)記。

(3)加入靶標(biāo)H1N1、H3N2型甲流病毒以及H7N9，乙流和無關(guān)蛋白。

(4)孵育1min中后，加入顯色劑，肉眼對比顏色變化即可得到檢測結(jié)果。圖4結(jié)果顯示，A為對照孔，B為H1N1型甲流病毒孔，C為H3N2型甲流病毒孔，D為H7N9型甲流病毒孔，E為乙流病毒孔，F(xiàn)為無關(guān)蛋白孔。寡核苷酸序列標(biāo)記的膠體金溶液能夠有效檢測出H1N1、H3N2型甲流病毒，而對其他靶標(biāo)無交叉反應(yīng)。