本發(fā)明涉及生物醫(yī)藥領(lǐng)域，尤其涉及一種分離外泌體的方法及其試劑盒。

背景技術(shù)：

外泌體是細(xì)胞向胞外空間分泌的小囊泡(通常約30-100納米)，不同來源外泌體大小有差異。所有類型的培養(yǎng)細(xì)胞都能分泌外泌體，且在體液如血液、尿液、唾液和母乳中含量豐富(Kosaka et al.,Silence 3(2010)1-7；Mitchell et al.,PNAS 105(2008)10513-10518)，且外泌體可通過體液循環(huán)等途徑到達(dá)其他細(xì)胞或組織。外泌體中包含核酸，蛋白、脂類等多種生物分子，并可能是這些物質(zhì)在體內(nèi)轉(zhuǎn)運(yùn)的載體。相關(guān)研究認(rèn)為外泌體可能扮演了信使的角色，其通過在細(xì)胞間傳遞各種信號(hào)分子，參與細(xì)胞間通訊，從而調(diào)控多種生理過程，包括腫瘤發(fā)生與轉(zhuǎn)移、心臟病、免疫性疾病等，因此外泌體具有很好的藥物釋放系統(tǒng)開發(fā)潛力，其內(nèi)含或膜上的核酸、蛋白、脂類、酶等物質(zhì)也可能成為疾病診斷治療的標(biāo)志物。但目前對(duì)外泌體及其內(nèi)含物的產(chǎn)生途徑和功能作用的了解仍不充分，因此迫切需要一種能高質(zhì)和高效獲得外泌體及其內(nèi)含物的方法，以提供大量的高質(zhì)的外泌體，作為深入研究外泌體功能機(jī)制與以及將其應(yīng)用于疾病診斷或基因治療的基礎(chǔ)。

目前分離外泌體的方法有超速離心法和超過濾法。超速離心法主要利用外泌體大小、密度等與周圍環(huán)境物質(zhì)的差異進(jìn)行分離，其缺點(diǎn)是對(duì)離心設(shè)備要求高，成本高；需反復(fù)離心，操作步驟復(fù)雜；離心力大，可能破壞外泌體結(jié)構(gòu)，因此獲得的外泌體收率不高。而超過濾法則是利用外泌體的尺寸特征而從周圍環(huán)境中分離出來，其解決了超速離心法耗時(shí)長、要求特殊設(shè)備的缺陷，但由于周圍環(huán)境中可能存在與其尺寸范圍相同的其他物質(zhì)，因此分離的外泌體純度不高。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

本發(fā)明的一個(gè)目的是提供一種分離體液或細(xì)胞上清液或組織樣本中外泌體的試劑。

本發(fā)明提供的試劑，為親水聚合物或親水聚合物溶液。

上述試劑中，所述親水聚合物為如下3種中至少一種：PEG(聚乙二醇)、硫酸葡聚糖和PVP(聚乙烯吡咯烷酮)。

上述試劑中，所述親水聚合物溶液為水溶液、鹽溶液或有機(jī)溶液。

所述親水聚合物溶液中，所述親水聚合物濃度為10mg/ml-300mg/ml。

上述試劑中，所述PEG的分子量為6000-20000道爾頓，所述硫酸葡聚糖的分子 量為30000-50000道爾頓，所述PVP的分子量為20000-40000道爾頓；

或所述PEG的分子量具體為8000或20000道爾頓，所述硫酸葡聚糖的分子量具體為40000道爾頓，所述PVP的分子量具體為25000道爾頓或40000道爾頓。

上述試劑為如下1)-3)中任一種：

1)親水聚合物組或親水聚合物水溶液組；所述親水聚合物組或所述親水聚合物水溶液組中的親水聚合物為如下至少2種：PEG8000、PVP25000、PEG20000和硫酸葡聚糖40000；

2)親水聚合物鹽溶液，所述親水聚合物鹽溶液由溶質(zhì)和溶劑組成，所述溶質(zhì)由親水聚合物和無機(jī)鹽組成；所述親水聚合物為PEG8000或PEG20000；

3)親水聚合物或其水溶液，所述親水聚合物為PEG8000、PEG20000、硫酸葡聚糖40000、PVP25000或PVP40000。

上述試劑中，1)所述親水聚合物組或親水聚合物水溶液組為如下：

PEG8000和PVP25000；

或PEG8000水溶液和PVP25000水溶液；

或PEG20000和硫酸葡聚糖40000；

或PEG20000水溶液和硫酸葡聚糖40000水溶液；

2)所述親水聚合物鹽溶液為PEG8000鹽溶液或PEG20000鹽溶液；

所述PEG8000鹽溶液的溶質(zhì)由PEG8000和NaCl組成；

所述PEG20000鹽溶液的溶質(zhì)由PEG20000和NaCl組成。

上述試劑中，所述體液為血漿或血清或尿液或胸腔積液或脊髓液或腦髓液或唾液或乳液或關(guān)節(jié)液或精液或陰道液或羊水，所述細(xì)胞上清液源自腫瘤細(xì)胞或炎性細(xì)胞或?qū)嵸|(zhì)細(xì)胞或間質(zhì)細(xì)胞或上皮細(xì)胞或纖維細(xì)胞或成纖維細(xì)胞，所述組織為肝或肺或腦。

所述細(xì)胞上清液源自3T3細(xì)胞或A549細(xì)胞或293細(xì)胞或Hela細(xì)胞。

本發(fā)明的另一個(gè)目的是提供一種分離體液或細(xì)胞上清液或組織樣本中外泌體的試劑盒。

本發(fā)明提供的試劑盒，包括上述的試劑；

或上述的試劑或所述的試劑盒在分離體液或細(xì)胞上清液或組織樣本中外泌體中的應(yīng)用也是本發(fā)明保護(hù)的范圍；

或上述的試劑或所述的試劑盒在制備分離體液或細(xì)胞上清液或組織樣本外泌體中的應(yīng)用也是本發(fā)明保護(hù)的范圍；

上述中，所述體液具體為血漿或血清或尿液或胸腔積液或脊髓液或腦髓液或唾液或乳液或關(guān)節(jié)液或精液或陰道液或羊水，所述細(xì)胞上清液具體源自腫瘤細(xì)胞或炎性細(xì) 胞或?qū)嵸|(zhì)細(xì)胞或間質(zhì)細(xì)胞或上皮細(xì)胞或纖維細(xì)胞或成纖維細(xì)胞，所述組織具體為肝或肺或腦。所述細(xì)胞上清液具體源自3T3細(xì)胞或A549細(xì)胞或293細(xì)胞或Hela細(xì)胞。

本發(fā)明第三個(gè)目的是提供一種分離體液或細(xì)胞上清液或組織樣本外泌體的方法。

本發(fā)明提供的方法包括如下步驟：將體液或細(xì)胞上清液或組織樣本分別與上述試劑混勻，得到混合液，使所述試劑中的親水聚合物在混合液的濃度達(dá)到工作濃度，再將所述混合液靜置，靜置后收集沉淀，即得到外泌體。

上述方法中，

采用的所述試劑及所述試劑中的親水聚合物的工作濃度如下：

所述PEG8000水溶液和所述PVP25000水溶液的混合液；所述PEG8000工作時(shí)的濃度為50mg/ml，且所述PVP25000工作時(shí)的濃度為150mg/ml；

或所述PEG20000水溶液和所述硫酸葡聚糖40000水溶液的混合液；所述PEG20000工作時(shí)的濃度為150mg/ml，且所述硫酸葡聚糖40000工作時(shí)的濃度為50mg/ml；

或所述PEG8000鹽溶液，所述PEG8000工作時(shí)的濃度為150mg/ml，且所述NaCl工作時(shí)的濃度為0.5M；

或所述PEG20000鹽溶液，所述PEG20000工作時(shí)的濃度為150mg/ml，且所述NaCl工作時(shí)的濃度為0.5M；

或所述PEG8000水溶液，所述PEG8000工作時(shí)的濃度為150mg/ml；

或所述PEG20000水溶液，所述PEG20000工作時(shí)的濃度為150mg/ml；

或所述硫酸葡聚糖40000水溶液，所述硫酸葡聚糖40000工作時(shí)的濃度為50mg/ml；

或所述PVP25000水溶液，所述PVP25000工作時(shí)的濃度為200mg/ml；

或所述PVP40000水溶液，所述PVP40000工作時(shí)的濃度為150mg/ml；

所述體液具體為血漿或血清或尿液或胸腔積液或脊髓液或腦髓液或唾液或乳液或關(guān)節(jié)液或精液或陰道液或羊水，所述細(xì)胞上清液具體腫瘤細(xì)胞或炎性細(xì)胞或?qū)嵸|(zhì)細(xì)胞或間質(zhì)細(xì)胞或上皮細(xì)胞或纖維細(xì)胞或成纖維細(xì)胞，所述組織具體為肝或肺或腦。

所述細(xì)胞上清液具體源自3T3細(xì)胞或A549細(xì)胞或293細(xì)胞或Hela細(xì)胞。

PEG為聚乙二醇，PVP為聚乙烯吡咯烷酮，PEG和PVP后的數(shù)字表示其相對(duì)分子量。

所述細(xì)胞上清液為細(xì)胞培養(yǎng)液的上清。

所述收集沉淀為離心，離心的離心力為500g-15000g。

所述體液或細(xì)胞上清液或組織樣本與上述試劑的體積比為7：1-1：1；

所述上述試劑中，所述親水聚合物濃度為10mg/ml-300mg/ml。

在所述方法中，對(duì)分離得到外泌體進(jìn)行進(jìn)一步檢測(cè)和/或在溶液混勻之前對(duì)待測(cè)樣本進(jìn)行處理；所述檢測(cè)包括核酸檢測(cè)和/或蛋白檢測(cè)，所述處理包括裂解和/或純化。

上述方法具體為如下1)-3)中任一種：

1)將待測(cè)樣本、上述PEG8000水溶液混勻，得到混合液，使所述PEG8000在混合液中的濃度為150mg/ml，再將所述混合液靜置，靜置后收集沉淀，即得到外泌體；

2)將待測(cè)樣本、上述PEG20000水溶液混勻，得到混合液，使所述PEG20000在混合液中的濃度為150mg/ml，再將所述混合液靜置，靜置后收集沉淀，即得到外泌體；

3)將待測(cè)樣本、上述硫酸葡聚糖40000水溶液混勻，得到混合液，使所述硫酸葡聚糖40000在混合液中的濃度為50mg/ml，再將所述混合液靜置，靜置后收集沉淀，即得到外泌體；

4)將待測(cè)樣本、上述PVP25000水溶液混勻，得到混合液，使所述PVP25000在混合液中的濃度為200mg/ml，再將所述混合液靜置，靜置后收集沉淀，即得到外泌體；

5)將待測(cè)樣本、上述PVP40000水溶液混勻，得到混合液，使所述PVP40000在混合液中的濃度為150mg/ml，再將所述混合液靜置，靜置后收集沉淀，即得到外泌體；

6)將待測(cè)樣本、上述PEG8000水溶液和上述PVP25000水溶液混勻，得到混合液，使所述PEG8000在所述混合液中濃度為50mg/ml，且所述PVP25000在混合液中的濃度為150mg/ml，再將所述混合液靜置，靜置后收集沉淀，即得到外泌體；

7)將待測(cè)樣本、上述PEG20000水溶液和上述硫酸葡聚糖40000水溶液混勻，得到混合液，使所述PEG20000在所述混合液中濃度為150mg/ml，且所述硫酸葡聚糖40000在混合液中的濃度為50mg/ml，再將所述混合液靜置，靜置后收集沉淀，即得到外泌體；

8)將待測(cè)樣本、上述PEG8000鹽溶液混勻，得到混合液，使所述PEG8000在所述混合液中濃度為150mg/ml，且所述NaCl在混合液中的濃度為0.5M，再將所述混合液靜置，即得到外泌體；

9)將待測(cè)樣本、上述PEG20000鹽溶液混勻，得到混合液，使所述PEG20000在所述混合液中濃度為150mg/ml，且所述NaCl在混合液中的濃度為0.5M，再將所述混合液靜置，靜置后收集沉淀，即得到外泌體。

上述靜置的條件為0-4℃、靜置0.5-24h。

本發(fā)明的實(shí)驗(yàn)證明，本發(fā)明用多種利用親水類聚合物如聚乙二醇、葡聚糖、聚乙烯基吡咯烷酮(PVP)等均能成功分離外泌體，PEG與硫酸葡聚糖的配合使用有協(xié)同增效的效果，用親水聚合物和無機(jī)鹽配合能提高分離外泌體的收率。本發(fā)明的方法比現(xiàn)有的超高速離心法及SBI法獲得的外泌體的RNA產(chǎn)量高，且適用于多種來源的血漿，如人源、小鼠源、大鼠源的血漿；適用于多種來源的細(xì)胞上清液，如3T3、A549、293T、Hela細(xì)胞；適用于多種體液，如血清、尿液、胸腔積液。該方法操作簡單、不需特殊 設(shè)備。本發(fā)明還提供一種分離外泌體的試劑盒，其能改變外泌體在體液或細(xì)胞培養(yǎng)液中的微環(huán)境，使其易于在上述環(huán)境中沉降；獲得的外泌體收率高；有利于小體積液體樣本中的外泌體檢測(cè)；同時(shí)避免了超高速離心力對(duì)外泌體的傷害，分離得到的外泌體結(jié)構(gòu)完整、其內(nèi)含物保存完好，適宜進(jìn)行外泌體的進(jìn)一步分離或其內(nèi)含物分析；通過控制特定范圍的親水聚合物的使用條件，能最大程度地排除底層相中的非外泌體雜質(zhì)，顯著提高外泌體的純度，可有效降低后續(xù)外泌體研究中的假陽性率。

可用常規(guī)的核酸或蛋白試劑盒或方法提取分離外泌體中的核酸或蛋白，如Trizol、miRNA提取試劑盒、DNA提取試劑盒等。Agilent2200核酸質(zhì)量檢測(cè)系統(tǒng)自動(dòng)按照峰面積折算濃度。親水聚合物溶液中可加入適量的糖原或EDTA等物質(zhì)能起到提高外泌體收率與更好的富集核酸的作用，如在PEG溶液中加入終濃度為0.1mM-20mM的EDTA，和/或終濃度為0.05mg/ml-5mg/ml的糖原。組織經(jīng)合適的酶解處理都是允許的，如膠原酶、胰酶、蛋白酶K等。靜置可在室溫(25℃)或更高溫度進(jìn)行，在低溫如4℃下進(jìn)行時(shí)沉淀速度會(huì)更快以及更充分?；旌衔镬o置時(shí)間可以是任意，通常24hr以內(nèi)。樣本可在與試劑混合前做純化處理，純化方式可為過濾、離心或過篩。且可進(jìn)一步對(duì)源自外泌體的核酸、蛋白、脂類等進(jìn)行分離。

附圖說明

圖1為血漿外泌體和3T3細(xì)胞上清外泌體各種檢測(cè)結(jié)果。

圖2為用150mg/ml的PEG8000分離獲得的血漿外泌體與用150mg/ml的PEG20000分離獲得的3T3細(xì)胞上清外泌體中的RNA含量。

圖3為50mg/ml的PEG8000與150mg/ml的PVP25000配合分離血漿中的外泌體的RNA含量和150mg/ml PEG20000與50mg/ml硫酸葡聚糖40000配合分離細(xì)胞上清中的外泌體RNA含量。

圖4用PEG鹽溶液分離血漿獲得的外泌體的RNA含量。

圖5為PEG鹽溶液分離血漿獲得的外泌體的DNA含量。

圖6為PEG20000鹽溶液分離細(xì)胞上清獲得的外泌體的RNA含量。

圖7為PEG20000鹽溶液分離細(xì)胞上清獲得的外泌體的DNA含量。

圖8為從血漿分離得到的外泌體沉淀大小比較。

圖9為與超速離心法比較分離血漿外泌體中的RNA。

圖10為與SBI離心法比較分離血漿外泌體中的RNA。

圖11為與超速離心法比較分離細(xì)胞上清外泌體中的RNA。

圖12為與SBI離心法比較分離細(xì)胞上清外泌體中的RNA。

圖13為大鼠血漿中外泌體RNA含量。

圖14為293T細(xì)胞上清中外泌體RNA含量。

圖15為胸腔積液中外泌體RNA含量。

圖16為大鼠肝組織中的外泌體RNA含量。

具體實(shí)施方式

下述實(shí)施例中所使用的實(shí)驗(yàn)方法如無特殊說明，均為常規(guī)方法。

下述實(shí)施例中所用的材料、試劑等，如無特殊說明，均可從商業(yè)途徑得到。

下述實(shí)施例中親水聚合物濃度單位為質(zhì)量/體積，計(jì)算公式：溶質(zhì)質(zhì)量(g)/溶液體積(mL)。

下述實(shí)施例中檢測(cè)核酸時(shí)的復(fù)溶體積如無特殊說明均為20ul。實(shí)施例中核酸濃度的檢測(cè)提供質(zhì)量較大的數(shù)據(jù)的圖譜。

PEG6000(81255)、PEG8000(89510)、PEG10000(92897)、PEG20000(95172)均購自Sigma；PVP k-25(分子量25000，以下稱為PVP25000)；PVP k-30(分子量40000，以下稱為PVP40000)均購自BASF；硫酸葡聚糖50000和硫酸葡聚糖40000均購自

Amresco。3T3(小鼠胚胎成纖維細(xì)胞,CRL-2752^TM)、A549(人肺腺癌細(xì)胞,CCL-185^TM)、293T(人腎上皮細(xì)胞,PTA-5554)、Hela(人子宮頸癌細(xì)胞,CCL-2^TM)細(xì)胞系均為ATCC產(chǎn)品。NaCl(S7653)和EDTA(03609)購自Sigma；糖原(Am9510)購自Life；Trizol購自Invitrogen(15596-026)、HiPure Circulating DNA Kits購自Magen(D3180-02)。DMEM購自GIBCO(C11995)、Ribonuclease A購自Takara(RNase A D202)，Exo-FBS^TM購自SB(EXO-FBS-250A-1)。CD63-Antibody-FITC購自BD(557288)、CD81-Antibody-FITC購自BD(551108)。High Sensitivity RNA Reagents購自Agilent(5067-5580)。胰酶購自Thermofisher(15400054)和蛋白酶K購自YEASEN(10401ES60)。大鼠和小鼠均從廣東省醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心獲得。

實(shí)施例1、分離外泌體所用親水聚合物的分子量優(yōu)化

一、樣本準(zhǔn)備

1、血漿

使用EDTA抗凝的采血管采集人源性外周血樣本，4℃條件下靜置3小時(shí)，4000×g，離心10min，取上清液即為血漿樣本。

2、細(xì)胞上清液

使用DMEM培養(yǎng)基(內(nèi)含10％已去除外泌體的FBS)，在37℃和5％CO₂培養(yǎng)條件下對(duì)3T3細(xì)胞進(jìn)行培養(yǎng)，正常培養(yǎng)2天后，收集(1000rpm離心2分鐘)細(xì)胞上清液樣本。

二、配置外泌體分離液

使用親水聚合物PEG8000、PEG10000、PEG20000、硫酸葡聚糖50000、硫酸葡聚糖40000、PVP25000和PVP40000溶于水配制外泌體分離液儲(chǔ)存液如下：濃度200mg/ml和400mg/ml的PEG8000水溶液、濃度200mg/ml和400mg/ml的PEG10000水溶液、濃度200mg/ml和400mg/ml的PEG20000水溶液、濃度200mg/ml和400mg/ml的硫酸葡聚糖50000水溶液、濃度200mg/ml和400mg/ml的硫酸葡聚糖40000水溶液、濃度200mg/ml和400mg/ml的PVP25000水溶液、濃度200mg/ml和400mg/ml的PVP40000水溶液。即稱量20g和40g的上述各種分子量的親水聚合物后，將其分別定容于100ml水中。

三、分離外泌體

1、血漿分離外泌體

取經(jīng)分離的人源性血漿2ml分別與上述二制備的親水聚合物濃度為200mg/ml的外泌體分離液混合(即按體積比血漿：分離液＝3：1的比例混合)，得到混合液，且使各親水聚合物的終濃度均為50mg/ml?；旌虾笊舷骂嵉?，放入4℃冰箱靜置0.5h。靜置后，4℃條件下12000×g離心2min，去上清液，收集沉淀為血漿外泌體。

2、細(xì)胞上清液分離外泌體

取收集的3T3細(xì)胞上清液20ml分別與上述二制備的親水聚合物濃度為400mg/ml的外泌體分離液混合(即按體積比血漿：分離液＝3：1的比例混合)，得到混合液，且使各親水聚合物的工作終濃度均為100mg/ml。混合后上下顛倒，放入4℃冰箱靜置過夜。過夜后取出，4℃條件下1500×g離心30min，取出倒掉上清液，收集沉淀為細(xì)胞外泌體。

四、外泌體的檢測(cè)

1、RNA含量檢測(cè)

將上述三獲得的血漿外泌體和細(xì)胞外泌體Trizol法提取RNA，使用Agilent2200核酸自動(dòng)化電泳系統(tǒng)，按照High Sensitivity RNA檢測(cè)試劑說明書指示進(jìn)行RNA濃度和質(zhì)量檢測(cè)，具體如下：

取1μL對(duì)應(yīng)的RNA sample，4μL sample buffer(共5μL)混勻?；靹虻臉悠吩赑CR儀中72℃孵育3min，孵育后在冰上放置2min，短暫離心使樣品集中在8聯(lián)管底部。把8聯(lián)管放入Agilent2200核酸自動(dòng)化電泳系統(tǒng)的樣品槽中，進(jìn)行自動(dòng)化電泳。

RNA片段分布和濃度結(jié)果見表1-1與圖1A-B，圖1A為用50mg/ml的PEG8000分離獲得的血漿外泌體的RNA含量，圖1B為用100mg/ml的PEG20000分離獲得的3T3 細(xì)胞上清外泌體的RNA含量。結(jié)果表明：該分離方法(1)各種分子量的50mg/ml的親水聚合物均能分離出血漿中的外泌體；各種分子量的100mg/ml的親水聚合物均能分離出細(xì)胞上清中的外泌體；(2)能保護(hù)核酸，使用常規(guī)的RNA抽提試劑盒即可對(duì)外泌體中的RNA進(jìn)行分離和富集；(3)能有效分離小RNA，經(jīng)分離的RNA片段均勻分布在25nt-6000nt之間，以25nt到200nt為主；(4)以血漿為樣本，不同分離方法獲得的外泌體RNA收率依次為50mg/ml的PEG8000大于50mg/ml的PVP25000大于50mg/ml的硫酸葡聚糖40000，以細(xì)胞上清為樣本，不同分離方法獲得的的外泌體RNA收率依次為100mg/ml的PEG20000大于100mg/ml的硫酸葡聚糖40000大于100mg/ml的PVP40000。

表1-1 為親水聚合物分子量的優(yōu)化

用工作濃度50mg/ml的PEG8000(分離血漿樣品)及工作濃度100mg/ml的PEG20000(分離細(xì)胞上清3T3樣品)做下述的分離檢測(cè)試驗(yàn)。

2、拍照檢測(cè)

將工作濃度50mg/ml的PEG8000分離獲得的血漿外泌體和工作濃度100mg/ml的PEG20000分離獲得的3T3細(xì)胞上清外泌體分別用50ul的水重懸，用照相機(jī)拍照，結(jié)果圖1C所示，表明獲得了源自血漿及細(xì)胞上清的外泌體沉淀。

3、顯微鏡檢

將工作濃度50mg/ml的PEG8000分離獲得的血漿外泌體和工作濃度100mg/ml的PEG20000分離獲得的3T3細(xì)胞上清外泌體用50ul水重懸，再進(jìn)行200倍稀釋后，取10ul滴加在培養(yǎng)皿上，在400倍放大倍數(shù)的顯微鏡下進(jìn)行拍照，比較不同抽提方法后得到的外泌體的密度。結(jié)果如圖1D所示，表明本發(fā)明的方法能分離獲得血漿及細(xì)胞上清中的外泌體。

4、RNase處理樣本對(duì)外泌體核酸回收的影響檢測(cè)

將血漿樣品分為未經(jīng)RNase處理血漿組(制備方法同上)與RNase處理血漿組；

RNase處理血漿組處理方法如下：取經(jīng)分離血漿2ml，使用終濃度為10ng/ml Takara的RNA酶A處理，37度水浴處理1h，得到RNase處理血漿。

將2ml RNase處理血漿和2ml未經(jīng)RNase處理血漿分別與濃度200mg/ml的PEG8000水溶液混合，得到混合液，使混合液中PEG8000工作濃度為50mg/ml，分離方法同上，得到RNase處理血漿外泌體和未經(jīng)RNase處理血漿外泌體。

將上述獲得的RNase處理血漿外泌體和未經(jīng)RNase處理血漿外泌體分別用Trizol法提取RNA，使用Agilent2200核酸自動(dòng)化電泳系統(tǒng)。RNA片段分布和濃度結(jié)果見表1-2與圖1E-F所示。

圖1E為RNase處理血漿外泌體RNA含量，圖1F為未經(jīng)RNase處理血漿外泌體RNA含量。

表1-2 RNase處理對(duì)外泌體RNA回收率的影響

結(jié)果表明：該分離方法(1)能分離出經(jīng)RNA酶處理或未經(jīng)RNA酶處理的人源性血漿中的外泌體；(2)經(jīng)RNA酶處理或者未處理的外泌體中經(jīng)分離的RNA在大小分布和濃度上未見明顯差異，證明經(jīng)抽提RNA確實(shí)來自外泌體內(nèi)，而非血漿中游離的RNA，也表明上述方法分離得到的沉淀為外泌體。

5、流式細(xì)胞儀粒徑檢測(cè)

將工作濃度50mg/ml的PEG8000分離獲得的血漿外泌體和工作濃度100mg/ml的PEG20000分離獲得的3T3細(xì)胞上清外泌體用50ul水重懸，使用BD公司的Accuri C6流式細(xì)胞儀，進(jìn)行粒徑分析，以正常Hela 3T3細(xì)胞水懸液、Hela 3T3細(xì)胞上清液為對(duì)照，按照Accuri C6流式細(xì)胞儀操作手冊(cè)指示，進(jìn)行前向角散射(forward scatter,FSC)和散角射(side scatter,SSC)分析，統(tǒng)計(jì)畫門內(nèi)細(xì)胞數(shù)目及其百分比。每個(gè)測(cè)試至少運(yùn)行10000個(gè)events。結(jié)果如圖1G-H(1G是血漿，1H是上清；第一列為粒徑和顆粒復(fù)雜程度圖，第二列為粒徑圖，第三列為顆粒復(fù)雜程度圖)所示，未經(jīng)分離的3T3細(xì)胞的粒徑在8-12um，經(jīng)分離的細(xì)胞上清中的外泌體在40-100nm。圖1G顯示血漿中分離的外泌體懸液中外泌體約為93.5％；圖1H顯示未分離的細(xì)胞上清中外泌體 約為21.4％，分離后的細(xì)胞上清外泌體約為94.9％，表明本方法能很好的分離、富集外泌體。

6、抗體標(biāo)記流式細(xì)胞儀檢測(cè)

將工作濃度50mg/ml的PEG8000分離獲得的血漿外泌體和工作濃度100mg/ml的PEG20000分離獲得的3T3細(xì)胞上清外泌體使用BD公司的CD63-Antibody-FITC和CD81-Antibody-FITC兩個(gè)外泌體特異性表面抗原的抗體，根據(jù)使用說明書的指示對(duì)經(jīng)分離的外泌體進(jìn)行抗體標(biāo)記。按照Accuri C6流式細(xì)胞儀操作手冊(cè)指示，進(jìn)行FITC的488nm通道檢測(cè)分析，以未經(jīng)分離的細(xì)胞上清作為對(duì)照，分析抗體的陽性細(xì)胞數(shù)目及其百分比。每個(gè)測(cè)試至少運(yùn)行10000個(gè)events。

結(jié)果如圖1I-J(第一列為粒徑和顆粒復(fù)雜程度，第二列為CD63抗體檢測(cè)，橫坐標(biāo)為從左到右依次為10¹、10²、10³、10⁴、10⁵、10⁶、10^7.2，第三列為CD81抗體檢測(cè)，橫坐標(biāo)為從左到右依次為10¹、10²、10³、10⁴、10⁵、10⁶、10^7.2；圖1J中第一行為分離前的細(xì)胞上清外泌體抗體檢測(cè)，第二行為分離后的外泌體抗體檢測(cè)；豎線右邊表示抗體檢測(cè)陽性，豎線左邊表示抗體檢測(cè)陰性)，圖1I為血漿外泌體流式抗體檢測(cè)圖，圖1J為3T3細(xì)胞上清外泌體流式抗體檢測(cè)圖，可以看出，本發(fā)明分離的血漿和細(xì)胞上清中的外泌體均表達(dá)CD63和CD81兩個(gè)特異性的表面標(biāo)記物，抗體染色呈陽性。因此，標(biāo)記物檢測(cè)結(jié)果表明本方法高效分離出了血漿和細(xì)胞上清中的外泌體。

實(shí)施例2、分離外泌體所用親水聚合物濃度的優(yōu)化

一、樣本準(zhǔn)備

1、血漿：與實(shí)施例1相同；

2、細(xì)胞上清液：與實(shí)施例1的方法相同，不同的是細(xì)胞為A549；

二、配置外泌體分離液

由于實(shí)施例1摸索出親水聚合物PEG8000、PEG20000、硫酸葡聚糖40000、PVP25000和PVP40000為效果好的外泌體分離液，因此，用水溶解配制外泌體分離液儲(chǔ)存液如下：

用于血漿分離的外泌體分離液：濃度400mg/ml的PEG8000水溶液、濃度400mg/ml的硫酸葡聚糖40000、濃度400mg/ml的PVP25000；

用于細(xì)胞上清液分離的外泌體分離液：濃度400mg/ml的PEG20000、濃度400mg/ml的硫酸葡聚糖40000、濃度400mg/ml的PVP40000。

三、分離外泌體

1、血漿分離外泌體：將血漿分別與不同的用于血漿分離的外泌體分離液混合，得到混合液，按照實(shí)施例1的三的方法分離，得到血漿分離外泌體；

上述不同的用于血漿分離的外泌體分離液及其工作濃度如下：

濃度400mg/ml PEG8000水溶液，PEG8000在混合液中的濃度為50mg/ml、150mg/ml、200mg/ml；

濃度400mg/ml硫酸葡聚糖40000水溶液，硫酸葡聚糖40000在混合液中的濃度為50mg/ml、150mg/ml、200mg/ml；

濃度400mg/ml PVP25000水溶液，PVP25000在混合液中的濃度為50mg/ml、150mg/ml、200mg/ml。

2、細(xì)胞上清液分離外泌體：將細(xì)胞上清液分別與不同用于細(xì)胞上清液分離的外泌體分離液混合，得到混合液，按照實(shí)施例1的三的方法分離，得到細(xì)胞外泌體；

上述不同的用于細(xì)胞上清液分離的外泌體分離液及其工作濃度如下：

濃度400mg/ml PEG20000水溶液，PEG20000在混合液中的濃度為50mg/ml、150mg/ml、200mg/ml；

濃度400mg/ml硫酸葡聚糖40000水溶液，硫酸葡聚糖40000在混合液中的濃度為50mg/ml、150mg/ml、200mg/ml；

濃度400mg/ml PVP40000水溶液，PVP40000在混合液中的濃度為50mg/ml、150mg/ml、200mg/ml。

四、外泌體的檢測(cè)

1、顯微檢測(cè)：檢測(cè)方法與實(shí)施例1相同，結(jié)果證明的得到外泌體。

2、RNA含量檢測(cè)

將上述三獲得的各種血漿外泌體和各種細(xì)胞外泌體Trizol法提取RNA，使用Agilent2200核酸自動(dòng)化電泳系統(tǒng)，

RNA片段分布和濃度結(jié)果見表2與圖2，其中，圖2A為150mg/ml的PEG8000分離獲得的血漿外泌體的RNA含量，圖2B為150mg/ml的PEG20000分離獲得的3T3細(xì)胞上清外泌體的RNA含量，結(jié)果表明：該分離方法(1)各種濃度的親水聚合物均能分離出血清及細(xì)胞上清中的外泌體；(2)以血漿為樣本，不同的分離方法獲得的外泌體RNA收率依次為150mg/ml的PEG8000大于200mg/ml的PVP25000大于50mg/ml的硫酸葡聚糖40000；以細(xì)胞上清為樣本，不同的分離方法獲得的外泌體RNA收率依次為150mg/ml的PEG20000大于50mg/ml的硫酸葡聚糖40000大于150mg/ml的PVP40000。

表2 親水聚合物濃度的優(yōu)化

上述表中，PEG8000用于血漿分離的外泌體，PEG20000用于細(xì)胞上清液分離的外泌體；PVP25000用于血漿分離的外泌體，PVP40000用于細(xì)胞上清液分離的外泌體，硫酸葡聚糖40000用于從血漿和細(xì)胞上清中分離外泌體。

實(shí)施例3、親水聚合物配合使用分離外泌體

一、樣本準(zhǔn)備

1、血漿：與實(shí)施例1相同；

2、細(xì)胞上清液：與實(shí)施例1的方法相同，不同的是細(xì)胞為Hela；

二、配置外泌體分離液

由于實(shí)施例2摸索出分離血漿外泌體最佳的親水聚合物為PEG8000和PVP25000，分離細(xì)胞上清液外泌體最佳的親水聚合物為PEG20000和硫酸葡聚糖40000，因此，可以將2種親水聚合物混合配制外泌體分離液儲(chǔ)存液，如下：

用于血漿分離的外泌體分離液：濃度300mg/ml的PEG8000水溶液、濃度300mg/ml的PVP25000；

用于細(xì)胞上清液分離的外泌體分離液：濃度300mg/ml的PEG20000、濃度300mg/ml的硫酸葡聚糖40000。

用PEG8000和/或PVP25000處理血漿樣本；

用PEG20000和/或硫酸葡聚糖40000處理細(xì)胞上清樣本。

三、分離外泌體

1、血漿分離外泌體：將血漿分別與不同的用于血漿分離的外泌體分離液混合，得到混合液，按照實(shí)施例1的三的方法分離，得到從血漿中分離的外泌體；

上述不同用于血漿分離的外泌體分離液及其工作濃度如下：

濃度300mg/ml的PEG8000水溶液，PEG8000在混合液中的濃度為50mg/ml；

濃度300mg/ml的PVP25000水溶液，PVP25000在混合液中的濃度為150mg/ml；

濃度300mg/ml的PEG8000水溶液和濃度300mg/ml的PVP25000水溶液，PEG8000在混合液中的濃度為50mg/ml，且PVP25000在混合液中的濃度為150mg/ml。

2、細(xì)胞上清液分離外泌體：將血漿分別與不同用于細(xì)胞上清液分離的外泌體分離液混合，得到混合液，按照實(shí)施例1的三的方法分離，得到細(xì)胞上清液分離外泌體；

上述不同用于細(xì)胞上清液分離的外泌體分離液及其工作濃度如下：

濃度300mg/ml的PEG20000水溶液，PEG20000在混合液中的濃度為150mg/ml；

濃度300mg/ml的硫酸葡聚糖40000水溶液，硫酸葡聚糖40000在混合液中的濃度為50mg/ml；

濃度300mg/ml的PEG20000水溶液和濃度300mg/ml的硫酸葡聚糖40000水溶液，PEG20000在混合液中的濃度為150mg/ml，且硫酸葡聚糖40000在混合液中的濃度為50mg/ml。

四、外泌體的檢測(cè)

1、顯微檢測(cè)：檢測(cè)方法與實(shí)施例1相同，結(jié)果證明的得到外泌體。

2、RNA含量檢測(cè)

將上述三獲得的各種血漿外泌體和各種細(xì)胞外泌體Trizol法提取RNA，使用Agilent2200核酸自動(dòng)化電泳系統(tǒng)，

RNA片段分布和濃度結(jié)果見表3與圖3，圖3A為50mg/ml的PEG8000與150mg/ml的PVP25000配合分離血漿中的外泌體的RNA含量，圖3B為150mg/ml PEG20000與50mg/ml硫酸葡聚糖40000配合分離細(xì)胞上清中的外泌體RNA含量，通過RNA的濃度代表外泌體的數(shù)量，結(jié)果表明：采用2種親水聚合物配合使用的外泌體分離液分離，比單獨(dú)使用親水聚合物分離外泌體效果好(通過RNA的濃度體現(xiàn))，其中對(duì)于血漿最佳的外泌體分離液為PEG8000和PVP25000水溶液，且PEG8000工作時(shí)的濃度為50mg/ml，PVP25000工作時(shí)的濃度為150mg/ml，對(duì)于細(xì)胞上清液最佳的外泌體分離液為PEG20000和硫酸葡聚糖40000水溶液，且PEG20000工作時(shí)的濃度為150mg/ml，硫酸葡聚糖40000工作時(shí)的濃度為50mg/ml。

表3 親水配合物的配合使用

實(shí)施例4、親水聚合物與無機(jī)鹽配合使用分離外泌體

A、親水聚合物與無機(jī)鹽配合使用分離血漿外泌體

一、樣本制備

1、血漿：與實(shí)施例1相同；

二、配置外泌體分離液儲(chǔ)存液

多種鹽濃度梯度PEG8000鹽溶液：將PEG8000、不同含量的NaCl和水混勻，得到PEG8000鹽溶液，其中PEG8000的濃度為450mg/ml、NaCl的濃度分別為300mM、1.5M與3M。

三、分離外泌體

將2ml血漿分別與多種鹽濃度梯度PEG8000鹽溶液混合，得到混合液，使混合液中PEG8000和NaCl的濃度分別如下：

PEG8000濃度為150mg/ml，NaCl濃度為100mM；

PEG8000濃度為150mg/ml，NaCl濃度為0.5M；

PEG8000濃度為150mg/ml，NaCl濃度為1M；

按照實(shí)施例1的三的方法分離，得到不同鹽濃度分離的血漿外泌體。

將2ml血漿分別與450mg/ml的PEG8000水溶液混合，得到混合液，使混合液中PEG8000的濃度為150mg/ml，按照實(shí)施例1的三的方法分離，得到不加鹽分離獲得的血漿外泌體。

四、外泌體的檢測(cè)

1、顯微檢測(cè)：檢測(cè)方法與實(shí)施例1相同，結(jié)果證明的得到外泌體。

2、RNA含量檢測(cè)

將上述三獲得的從血漿中分離獲得的外泌體用Trizol法提取RNA，使用Agilent2200核酸自動(dòng)化電泳系統(tǒng)。RNA片段分布和濃度結(jié)果見表4與圖4(PEG8000濃度為150mg/ml，NaCl濃度為0.5M)，結(jié)果表明：該分離方法(1)分離液中鹽離子濃度為0-2M時(shí)均能分離出血漿中的外泌體；(2)鹽離子終濃度為1M時(shí)，得到的外泌體RNA濃度和產(chǎn)量最高。因此，采用親水聚合物與無機(jī)鹽配合使用的外泌體分離液分離，比單獨(dú)使用親水聚合物分離外泌體效果好(通過RNA的濃度體現(xiàn))，分離血漿外泌體最佳分離液為PEG8000鹽溶液，且PEG8000工作濃度為150mg/ml，NaCl工作濃度為0.5M。

表4 血漿中外泌體的RNA回收率

3、DNA含量檢測(cè)

將PEG8000鹽溶液(NaCl工作濃度0.5M)分離得到的血漿的外泌體，按照Magen的HiPure Circulating DNA Kits說明書指示進(jìn)行DNA的抽提，使用Agilent2200核酸自動(dòng)化電泳系統(tǒng)進(jìn)行DNA檢測(cè)。

DNA片段分布和濃度結(jié)果見表5與圖5(PEG8000濃度為150mg/ml，NaCl濃度為0.5M)，結(jié)果表明：該分離方法(1)能保護(hù)核酸，使用常規(guī)的DNA抽提試劑盒即可對(duì)外泌體中的DNA進(jìn)行分離和富集；(2)能有效分離DNA，經(jīng)分離的DNA片段分布均分布在100nt-1500nt。

表5 血漿中外泌體的DNA回收率

B、親水聚合物與無機(jī)鹽配合使用分離細(xì)胞上清液外泌體

一、樣本制備

1、細(xì)胞上清液：與實(shí)施例1相同，僅替換為293T細(xì)胞；

二、配置外泌體分離液

配制外泌體分離液儲(chǔ)存液：

多種鹽濃度梯度PEG20000鹽溶液：將PEG20000、不同量的NaCl和水混勻，得到PEG20000鹽溶液，其中PEG20000的濃度為450mg/ml、NaCl的濃度為300mM、1.5M與3M。

三、分離外泌體

將20ml 293T細(xì)胞上清液分別與多種鹽濃度梯度PEG20000鹽溶液混合，得到混合液，使混合液中PEG20000和NaCl的濃度分別如下：

PEG20000濃度為150mg/ml，NaCl濃度為100mM；

PEG20000濃度為150mg/ml，NaCl濃度為0.5M；

PEG20000濃度為150mg/ml，NaCl濃度為1M；

按照實(shí)施例1的三的方法分離，得到不同鹽濃度分離的細(xì)胞上清液外泌體。

將20ml細(xì)胞上清液分別與450mg/ml的PEG20000水溶液混合，得到混合液，使混合液中PEG20000的濃度為150mg/ml，得到不加鹽分離的細(xì)胞上清液外泌體。

四、外泌體的檢測(cè)

1、顯微檢測(cè)：檢測(cè)方法與實(shí)施例1相同，結(jié)果證明的得到外泌體

2、RNA含量檢測(cè)

將上述三獲得的細(xì)胞上清液外泌體Trizol法提取RNA，使用Agilent2200核酸自動(dòng)化電泳系統(tǒng)。

RNA片段分布和濃度結(jié)果見表6與圖6(PEG20000濃度為150mg/ml，NaCl濃度為0.5M)，結(jié)果表明：該分離方法(1)分離液中鹽離子濃度為0-2M時(shí)均能分離出血漿中的外泌體；(2)鹽離子終濃度為1M時(shí)，得到的外泌體RNA濃度和產(chǎn)量最高。因此，采用親水聚合物與無機(jī)鹽配合使用的外泌體分離液分離，比單獨(dú)使用親水聚合物分離外泌體效果好(通過RNA的濃度體現(xiàn))，分離細(xì)胞上清液外泌體最佳分離液為PEG20000鹽溶液，且PEG20000工作濃度為150mg/ml，NaCl工作濃度為0.5M。

表6 細(xì)胞上清中外泌體RNA回收率

3、DNA含量檢測(cè)

將PEG20000鹽溶液(NaCl工作濃度0.5M)從細(xì)胞上清中分離的外泌體提取DNA，使用Agilent2200核酸自動(dòng)化電泳系統(tǒng)。

DNA片段分布和濃度結(jié)果見表7與圖7(PEG20000濃度為150mg/ml，NaCl濃度為0.5M)，結(jié)果表明：該分離方法(1)能保護(hù)核酸，使用常規(guī)的DNA抽提試劑盒即可對(duì)外泌體中的DNA進(jìn)行分離和富集；(2)能有效分離DNA，經(jīng)分離的DNA片段分布均分布在100nt-1500nt。

表7 細(xì)胞上清中外泌體的DNA回收率

實(shí)施例5、親水聚合物與無機(jī)鹽配合使用分離外泌體的應(yīng)用

下面的實(shí)施例均采用親水聚合物與無機(jī)鹽配合使用分離外泌體：

A、比較親水聚合物與無機(jī)鹽配合使用(Ribo)、超高速離心法及SBI法分離血漿外泌體

一、樣本制備

1、血漿：與實(shí)施例1相同；

二、配置外泌體分離液

配制外泌體分離液儲(chǔ)存液：

PEG8000鹽溶液：將PEG8000、NaCl和水混勻，得到PEG8000鹽溶液，其中PEG8000的濃度為450mg/ml、NaCl的濃度為1.5M。

三、分離外泌體

采用如下三種方法分離血漿外泌體：

1、本發(fā)明親水聚合物與無機(jī)鹽配合使用分離(簡稱Ribo法)

將2ml血漿與PEG8000鹽溶液混合，得到混合液，使混合液中PEG8000工作濃度為150mg/ml，NaCl工作濃度為0.5M，按照實(shí)施例1的三的方法分離，得到親水聚合物與無機(jī)鹽配合使用分離的源自血漿的外泌體。

2、SBI法

將2ml血漿使用SBI的Exosome抽提試劑ExoQuick serum exosome precipitation solution和ExoQuick TC進(jìn)行操作，得到SBI法分離的血漿外泌體。

四、外泌體的檢測(cè)

1、拍照檢測(cè)

將上述三中方法1和2分離得到外泌體沉淀分別用50ul的水重懸，用照相機(jī)拍照，比較不同抽提方法后得到的外泌體的量。

結(jié)果如圖8所示，可以看出，本發(fā)明的方法比SBI試劑分離得到的外泌體沉淀大小大，即其外泌體收率更高。

2、RNA含量檢測(cè)

將上述三各種分離方法獲得的外泌體Trizol法提取RNA，使用Agilent2200核酸自動(dòng)化電泳系統(tǒng)。

RNA片段分布和濃度結(jié)果如下：

(1)與超高速離心法比對(duì)

RNA片段分布和濃度結(jié)果見表8與圖9(Ribo)，結(jié)果表明：本方法能高效回收血漿外泌體中的RNA，其回收率是常規(guī)超高速離心法的9.5倍以上。

表8 血漿中Ribo法分離外泌體RNA回收率高

(2)與SBI法比對(duì)

RNA片段分布和濃度結(jié)果見表9與圖10(Ribo)，結(jié)果表明：本方法能高效回收血漿外泌體中的RNA，其回收率是SBI法的2.4倍。

表9 血漿中Ribo法分離外泌體RNA回收率高

因此，采用本發(fā)明的方法，比SBI方法分離外泌體效果好(通過RNA的濃度體現(xiàn))。

3、Small RNA高通量測(cè)序檢測(cè)

將上述各種分離方法獲得的外泌體提取RNA,使用Illumina公司的Small RNA Sample Prep Kit試劑盒進(jìn)行small RNA的文庫構(gòu)建，主要步驟為3'adaptor連接；5'adaptor連接；第一鏈cDNA合成；PCR擴(kuò)增；片段大小選擇，并用Agilent 2200TapeStation進(jìn)行文庫質(zhì)檢。通過質(zhì)檢的文庫，按照pooling比例進(jìn)行混合，pooling后的濃度為2.1nM；使用Illumina的Rapid SBS Kit-HS(50Cycles)和Rapid SR Cluster Kit試劑，按照HiSeq 2500User Guide的指示進(jìn)行上機(jī)操作，并運(yùn)行標(biāo)準(zhǔn)測(cè)序程序；測(cè)序程序運(yùn)行完畢，對(duì)所得數(shù)據(jù)進(jìn)行生物信息學(xué)分析。

結(jié)果如表10與表11所示，本發(fā)明方法(1)分離獲得的血漿中外泌體的miRNA數(shù)目約是SBI法的1.54倍；(2)分離獲得的血漿中外泌體的miRNA在小RNA中的比例比約為SBI法的1.67倍。

表10 血漿外泌體中檢測(cè)到miRNA的個(gè)數(shù)

上述表10中的SBI-1和SBI-2為2次重復(fù)，上述表10中的Ribo-1和Ribo-2為2次重復(fù)。

表11 血漿中的小RNA分布

上述表11中的SBI-1和SBI-2為2次重復(fù)，上述表10中的Ribo-1和Ribo-2為2次重復(fù)。

B、比較水聚合物與無機(jī)鹽配合使用(Ribo)及SBI法分離細(xì)胞上清中外泌體

一、樣本制備

細(xì)胞上清液：與實(shí)施例1相同，不同的僅是細(xì)胞換為Hela細(xì)胞。

二、配置外泌體分離液

配制外泌體分離液儲(chǔ)存液：

PEG20000鹽溶液：將PEG20000、NaCl和水混勻，得到PEG20000鹽溶液，其中PEG20000的濃度為450mg/ml、NaCl的濃度為1.5M。

三、分離外泌體

采用如下方法分離血漿外泌體：

1、本發(fā)明親水聚合物與無機(jī)鹽配合使用分離(簡稱Ribo法)

將20ml Hela細(xì)胞上清液與PEG20000鹽溶液混合，得到混合液，使混合液中PEG20000工作濃度為150mg/ml，NaCl工作濃度為0.5M，按照實(shí)施例1的三的方法分離，得到親水聚合物與無機(jī)鹽配合使用分離的細(xì)胞上清液外泌體。

2、超高速離心法：

將20ml Hela細(xì)胞上清液參考超速離心的方法進(jìn)行離心操作(Thery et al.,Cum Protoc.Cell.Biol.,Chapter 3,Unit 3:22(2006))，得到超高速離心分離的細(xì)胞上清液外泌體。

3、SBI法

將20ml Hela細(xì)胞上清液使用SBI的Exosome抽提試劑ExoQuick serum exosome precipitation solution和ExoQuick TC進(jìn)行操作，得到SBI法分離的細(xì)胞上清液外泌體。

四、外泌體的檢測(cè)

RNA含量檢測(cè)

將上述三各種分離方法獲得的外泌體Trizol法提取RNA，使用Agilent2200核酸自動(dòng)化電泳系統(tǒng)。

RNA片段分布和濃度結(jié)果如下：

(1)與超高速離心法比較

RNA片段分布和濃度結(jié)果見表12與圖11(Ribo)，結(jié)果表明：本方法能高效回收細(xì)胞上清外泌體中的RNA，其回收率是常規(guī)超高速離心法的2.1倍以上。

表12 細(xì)胞上清中Ribo法分離外泌體RNA回收率高

(2)與SBI法比較

RNA片段分布和濃度結(jié)果見圖12(Ribo)與表13，結(jié)果表明：本方法能高效回收細(xì)胞上清外泌體中的RNA，其回收率是SBI法的1.7倍以上。

表13 細(xì)胞上清中Ribo法分離外泌體RNA回收率高

C、分離不同來源血漿中外泌體的核酸

一、樣本制備

血漿：使用EDTA抗凝的采血管采集人源性外周血樣本、大鼠源性外周血樣本和小鼠源性外周血樣本，4℃條件下靜置3小時(shí)，4000×g，離心10min，取上清液即為人源血漿、大鼠血漿和小鼠血漿。

二、配置外泌體分離液

配制外泌體分離液儲(chǔ)存液：

PEG8000鹽溶液：將PEG8000、NaCl和水混勻，得到PEG8000鹽溶液，其中PEG8000的濃度為450mg/ml、NaCl的濃度為1.5M。

三、分離外泌體

將2ml不同來源的血漿與PEG8000鹽溶液混合，得到混合液，使混合液中PEG8000工作濃度為150mg/ml，NaCl工作濃度為0.5M，按照實(shí)施例1的三的方法分離，得到人血漿外泌體、大鼠血漿外泌體和小鼠血漿外泌體。

四、外泌體的檢測(cè)

RNA含量檢測(cè)

將上述三獲得的人血漿外泌體、大鼠血漿外泌體和小鼠血漿外泌體分別用Trizol法提取RNA，使用Agilent2200核酸自動(dòng)化電泳系統(tǒng)。

RNA片段分布和濃度結(jié)果見表14與圖13(Ribo)，結(jié)果表明：該分離方法(1)均能分離出人、大鼠和小鼠源性血漿中的外泌體；(2)人、大鼠和小鼠源性血漿分離的片段分布和RNA濃度略有不同。

表14 不同來源血漿中外泌體的RNA回收率

D、分離不同來源細(xì)胞上清外泌體

一、樣本制備

細(xì)胞上清液：與實(shí)施例1相同，不同的僅是細(xì)胞為3T3、A549、293T、Hela。

二、配置外泌體分離液

配制外泌體分離液儲(chǔ)存液：

PEG20000鹽溶液：將PEG20000、NaCl和水混勻，得到PEG20000鹽溶液，其中PEG20000的濃度為450mg/ml、NaCl的濃度為1.5M。

三、分離外泌體

分別將20ml 3T3細(xì)胞上清液、A549細(xì)胞上清液、293T細(xì)胞上清液、Hela細(xì)胞上清液與PEG20000鹽溶液混合，得到混合液，使混合液中PEG20000工作濃度為150mg/ml，NaCl工作濃度為0.5M，按照實(shí)施例1的三的方法分離，得到3T3細(xì)胞上清液外泌體、A549細(xì)胞上清液外泌體、293T細(xì)胞上清液外泌體、Hela細(xì)胞外泌體。

四、外泌體的檢測(cè)

RNA含量檢測(cè)

將上述3T3細(xì)胞上清液外泌體、A549細(xì)胞上清液外泌體、293T細(xì)胞上清液外泌體、Hela細(xì)胞外泌體用Trizol法提取RNA，使用Agilent2200核酸自動(dòng)化電泳系統(tǒng)。

RNA片段分布和濃度結(jié)果見表15與圖14(293T細(xì)胞)，結(jié)果表明：該分離方法

(1)均能分離出3T3、A549、293T和Hela細(xì)胞上清液中的外泌體；(2)3T3、A549、293T和Hela細(xì)胞上清液分離的外泌體RNA的片段分布和RNA濃度略有不同。

表15 為不同來源細(xì)胞上清中外泌體的RNA回收率

E、分離多種體液外泌體

一、樣本制備

1、血清分離：使用不加抗凝劑的采血管采集人源性外周血樣本，4℃條件下靜置4小時(shí)，可見血塊析出。4000×g，離心10min，可見淡黃色血清，取上清液也即為血清。取出上清后可再使用2000×g離心10min，以最大程度保證血清質(zhì)量。

2、尿液分離：收集人源性尿液，4000×g，離心15min，去除細(xì)胞和沉淀雜質(zhì)，取上清液，得到尿液上清液。

3、胸腔積液分離：收集人源性的胸腔積液，4000×g，離心15min，去除細(xì)胞和沉淀雜質(zhì)，取上清液，得到胸腔積液上清液。

二、配置外泌體分離液

配制外泌體分離液儲(chǔ)存液：

PEG8000鹽溶液：將PEG8000、NaCl和水混勻，得到PEG8000鹽溶液，其中PEG8000的濃度為450mg/ml、NaCl的濃度為1.5M。

PEG20000鹽溶液：將PEG20000、NaCl和水混勻，得到PEG20000鹽溶液，其中PEG20000的濃度為450mg/ml、NaCl的濃度為1.5M。

PEG8000鹽溶液分離血清。

PEG20000鹽溶液分離尿液上清液和胸腔積液上清液。

三、分離外泌體

1、將2ml血清與PEG8000鹽溶液混合，得到混合液，使混合液中PEG8000工作濃度為150mg/ml，NaCl工作濃度為0.5M，按照實(shí)施例1的三的方法分離，得到血清外泌體。

2、將20ml尿液上清液與PEG20000鹽溶液混合，得到混合液，使混合液中PEG20000工作濃度為150mg/ml，NaCl工作濃度為0.5M，按照實(shí)施例1的三的方法分離，得到尿液上清液外泌體。

3、將20ml胸腔積液上清液與PEG20000鹽溶液混合，得到混合液，使混合液中PEG20000工作濃度為150mg/ml，NaCl工作濃度為0.5M，按照實(shí)施例1的三的方法分離，得到胸腔積液上清液外泌體。

四、外泌體的檢測(cè)

RNA含量檢測(cè)

將上述三獲得的血清外泌體、尿液上清液外泌體和胸腔積液上清液外泌體分別用Trizol法提取RNA，使用Agilent2200核酸自動(dòng)化電泳系統(tǒng)。

RNA片段分布和濃度結(jié)果見表16與圖15(胸腔積液)，結(jié)果表明：該分離方法(1)均能分離出人源血清、尿液、胸腔積液中的外泌體；(2)不同來源的體液分離的外泌體RNA濃度略有不同。

表16 不同來源體液中外泌體的RNA回收率

F分離組織樣本中外泌體的RNA

一、樣本制備

大鼠和小鼠肝臟作為鼠源的組織樣本。

二、配置外泌體分離液

配制外泌體分離液儲(chǔ)存液：

PEG20000鹽溶液：將PEG20000、NaCl和水混勻，得到PEG20000鹽溶液，其中PEG20000的濃度為450mg/ml、NaCl的濃度為1.5M。

三、分離外泌體

將20mg大鼠肝組織與小鼠肝組織剪碎勻漿后，分別用0.35％胰酶、蛋白酶K(20mg/ml)37度消化0.5小時(shí)，消化后經(jīng)1200rpm離心2min取上清，再與PEG20000鹽溶液混合，得到混合液，使PEG20000的終濃度為150mg/ml，NaCl的終濃度為0.5M；按照實(shí)施例1的三的方法分離，得到組織來源的外泌體。

四、外泌體RNA含量檢測(cè)

將上述三獲得的組織樣本外泌體用Trizol法提取RNA，使用Agilent2200核酸自動(dòng)化電泳系統(tǒng)。RNA片段分布和濃度結(jié)果見表17與圖16(大鼠肝)，結(jié)果表明：該分離方法能分離組織樣本的外泌體。

表17 組織樣本中外泌體的RNA含量