本發(fā)明涉及一種用于增強動物間充質(zhì)干細胞分泌生物活性因子能力的方法，以及涉及一種提取間充質(zhì)干細胞培養(yǎng)液中生物活性因子的技術(shù)方法。

背景技術(shù)：

間充質(zhì)干細胞源于動物胚胎發(fā)育早期的中胚層和外胚層。間充質(zhì)干細胞是一種具有自我復制能力和多向分化潛能的成體干細胞，屬于非終末分化細胞，它既有間質(zhì)細胞，又有內(nèi)皮細胞及上皮細胞的特征。間充質(zhì)干細胞有體外貼壁生長的特性，利用這種特性，人們已經(jīng)從骨髓、脂肪、外周血、胎盤、臍帶等多種組織中成功將其分離培養(yǎng)出來，這些組織成為間充質(zhì)干細胞實驗研究和臨床應用的重要來源。

間充質(zhì)干細胞在體外特定的誘導條件下，可分化為脂肪、軟骨、骨、肌肉、肌腱、神經(jīng)、肝、心肌、胰島β細胞和內(nèi)皮等多種組織細胞，連續(xù)傳代培養(yǎng)和冷凍保存后仍具有多向分化潛能。不論是自體還是同種異源的間充質(zhì)干細胞，一般都不會引起宿主的免疫反應。

間充質(zhì)干細胞具有多分化潛能，可產(chǎn)生多種生長因子、細胞因子、調(diào)節(jié)肽以及干細胞特異性歸巢和營養(yǎng)因子等生物活性因子的細胞體系，所分泌的上述物質(zhì)在局部形成復雜的生物活性因子網(wǎng)絡，并受缺血、缺氧、生長因子、性別和激素調(diào)節(jié)。

現(xiàn)已證實，干細胞能表達、合成并分泌生長因子、細胞因子、調(diào)節(jié)肽及信號分子等多種生物活性因子，而且胚胎干細胞和成體干細胞以及不同來源的成體干細胞所產(chǎn)生的生物活性因子譜相似，這些生物活性因子調(diào)節(jié)代謝、免疫、細胞分化、增殖、遷移、營養(yǎng)、存活、凋亡和組織器官功能。這些研究結(jié)果提示干細胞是機體潛在的旁分泌/自分泌系統(tǒng)，植入后干細胞的分泌功能不僅直接影響植入干細胞自身的存活和分化，而且是干細胞移植發(fā)揮治療效應的重要機制之一。

干細胞所分泌的生物活性物質(zhì)在局部形成復雜的生物活性因子網(wǎng)絡，并受缺血、缺氧、生長因子、性別和激素調(diào)節(jié)。其分泌功能影響移植干細胞自身及所在組織器官的結(jié)構(gòu)、功能及其病理狀態(tài)下的修復，是干細胞改善靶器官功能、抗凋亡、抗炎等療效的重要機制之一。

體內(nèi)各組織中的氧濃度存在較大差別，且生理、病理狀態(tài)下均處于低氧環(huán)境，間充質(zhì)干細胞移植后也將處于低氧微環(huán)境。然而，目前間充質(zhì)干細胞在體外細胞培養(yǎng)時大多在常氧環(huán)境下進行，與體內(nèi)正常組織低氧環(huán)境及病理狀態(tài)下低氧狀態(tài)相差較大.低氧環(huán)境對間充質(zhì)干細胞生物學特性的影響也有一些研究進展。適度的低氧能夠促進細胞增殖、遷移，抑制凋亡，影響細胞分化。

公開號為CN101461772A的發(fā)明專利提供了一種用于美容護膚的人干細胞分泌因子的制 備方法。但是該專利方法所用的培養(yǎng)液含有胎牛血清成分。利用其技術(shù)提取的干細胞分泌生物活性因子量較少，且存在血清的安全隱患，因此應用上局限性較大，僅適用于美容護膚方面的應用，對于更深一步的醫(yī)學治療不適用。

技術(shù)實現(xiàn)要素：

鑒于以上方法的缺點，本發(fā)明采取了較安全的無血清培養(yǎng)液對擬提取生物活性因子的干細胞進行培養(yǎng)，并且增強了間充質(zhì)干細胞在體外培養(yǎng)過程中分泌生物活性因子的能力。

本發(fā)明解決其技術(shù)問題所采用的技術(shù)方案是：制備原代動物間充質(zhì)干細胞——無血清低氧培養(yǎng)、擴增——收集廢棄間充質(zhì)干細胞培養(yǎng)液——生物活性因子提取、濃縮、滅菌——高純度干細胞生物活性因子提取液。

本發(fā)明選用無血清培養(yǎng)液培養(yǎng)間充質(zhì)干細胞。

優(yōu)選地，選用Invitrogen公司STEMPRO MSC SFM培養(yǎng)液培養(yǎng)間充質(zhì)干細胞。

本發(fā)明采用低氧培養(yǎng)技術(shù)增加間充質(zhì)干細胞分泌生物活性因子的能力。

優(yōu)選地，低氧培養(yǎng)間充質(zhì)干細胞所選用的氧氣濃度為1％～2％。

本發(fā)明定期對培養(yǎng)的間充質(zhì)干細胞的無血清培養(yǎng)液進行更換。

優(yōu)選地，間充質(zhì)干細胞每培養(yǎng)3-4天對培養(yǎng)液進行半量更換，并收集廢棄培養(yǎng)液。

本發(fā)明對收集到的間充質(zhì)干細胞廢棄培養(yǎng)液進行生物活性因子的超濾和濃縮。

優(yōu)選地，選用50KD中空纖維超濾柱進行超濾濃縮。

本發(fā)明對濃縮后的間充質(zhì)干細胞生物活性因子提取液進行過濾除菌。

優(yōu)選地，選用孔徑為0.22μm的濾膜進行過濾除菌。

本發(fā)明的有益效果是：

1.對間充質(zhì)干細胞的培養(yǎng)使用無血清培養(yǎng)液，避免了血清源性污染。

2.使用不含動物源性成分的無血清培養(yǎng)液培養(yǎng)間充質(zhì)干細胞，所提取到的生物活性因子在應用上不受血清等動物源性成分的應用限制。

3.采用低氧培養(yǎng)技術(shù)，特異性地增加間充質(zhì)干細胞分泌生物活性因子的能力，降低傳統(tǒng)方法生產(chǎn)間充質(zhì)干細胞生物活性因子的成本。

4.通過超濾除菌等步驟，保證了間充質(zhì)干細胞生物活性因子提取物的安全性。

5.用本方法技術(shù)所得到的間充質(zhì)干細胞生物活性因子提取液可應用于醫(yī)學治療、美容保健等各個領域。

附圖說明

圖1為顯示利用本發(fā)明方法培養(yǎng)的臍帶間充質(zhì)干細胞培養(yǎng)液中SCF(干細胞因子)含量與常氧組的差異。

圖2為顯示利用本發(fā)明方法培養(yǎng)的臍帶間充質(zhì)干細胞培養(yǎng)液中SDF-1(基質(zhì)細胞衍生 因子)含量與常氧組的差異。

圖3為顯示利用本發(fā)明方法培養(yǎng)的臍帶間充質(zhì)干細胞VEGF(血管表皮生長因子)含量與常氧組的差異。

圖4為顯示利用本發(fā)明方法培養(yǎng)的臍帶間充質(zhì)干細胞bFGF(堿性纖維細胞生長因子)含量與常氧組的差異。

圖5為顯示利用本發(fā)明方法培養(yǎng)的臍帶間充質(zhì)干細胞G-CSF(粒細胞集落刺激因子)含量與常氧組的差異。

具體實施方式

下面結(jié)合具體實施例進一步闡述本發(fā)明。應理解，這些實施例僅用于說明本發(fā)明而不用于限制本發(fā)明的應用范圍。

實施例1：

對人臍帶間充質(zhì)干細胞進行低氧培養(yǎng)。按如下步驟操作：(1)無菌條件下，將人臍帶切成0.7mm³左右大小的組織塊；(2)用Hank’s液沖洗后去除組織塊上殘留的血液并分離血管；(3)將處理后的組織塊用胰蛋白酶消化，觀察到細胞大部分分散時終止消化；(4)對消化后的物質(zhì)過濾；(5)將所得濾液低速離心；(6)用Hank’s液對間充質(zhì)干細胞混懸液離心清洗5次；(7)在離心后的濾液中加入細胞培養(yǎng)液，制成細胞混懸液。(8)在2％氧氣濃度條件下，對臍帶間充質(zhì)干細胞進行培養(yǎng)。細胞傳至第3代，用流式細胞儀檢測培養(yǎng)所得細胞表面標志物，結(jié)果CD31、HLA-DR、CD34、CD45陰性，CD44、CD73、CD90和CD105陽性，證實為臍帶間充質(zhì)干細胞。

實施例2：

取人臍帶間充質(zhì)干細胞為實驗材料。分為低氧濃度組(2％O₂、5％CO₂、93％N₂)和正常氧濃度組(20％O₂、5％CO₂、75％N₂)，具體操作如下：將人臍帶間充質(zhì)干細胞以1X10⁴/cm²接種到6孔培養(yǎng)板上，每孔中加入培養(yǎng)液2ml(STEMPRO MSC SFM)。將常氧組各培養(yǎng)板放入20％O₂濃度的培養(yǎng)箱中，低氧組各培養(yǎng)板放入2％O₂濃度的三氣培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，分別于培養(yǎng)后第24h、48h、72h，吸出相應培養(yǎng)孔的上清液，離心后分裝于EP管中，標記后置于零下20度冰箱中待測。取凍存的人臍帶間充質(zhì)細胞的培養(yǎng)基上清液，并于常溫下解凍融化。酶聯(lián)免疫分析人臍帶間充質(zhì)干細胞細胞因子SCF、SDF-1、VEGF、bFGF、G-CSF的表達情況。結(jié)果如下：

低氧組培養(yǎng)基上清液中SCF含量在24h低于常氧組，且差異存在統(tǒng)計學意義，但隨時間延長，兩者差距逐漸縮小，48小時兩組SCF含量差異無統(tǒng)計學意義，72h低氧組SCF含量較常氧組顯著增高(圖1)。

與常氧組比較，培養(yǎng)后24h低氧組SDF-1濃度較常氧組低而后低氧組SDF-1濃度隨時間逐漸升高，并于72h明顯高于常氧組(圖2)。

與常氧組比較，低氧組VEGF濃度于培養(yǎng)后24h、48h兩組VEGF濃度差異不明顯，后隨培養(yǎng)時間的延長逐漸升高，56h開始明顯高于常氧組(圖3)。

與常氧組比較，培養(yǎng)后24h兩組bFGF濃度差異不顯著，后隨低氧組bFGF濃度不斷升高，48h開始明顯高于常氧組(圖4)。

與常氧組比較，低氧組G-CSF濃度于72h明顯高于常氧組(圖5)。

實施例3：

將用本發(fā)明方法提取的臍帶間充質(zhì)干細胞生物活性因子或干細胞內(nèi)生物活性物質(zhì)加入到培養(yǎng)基中，并以此種濃度的培養(yǎng)基培養(yǎng)正常傳代至第8代的臍帶間充質(zhì)干細胞(此代細胞的增殖能力減弱，活性降低)，以不加生物活性提取因子的培養(yǎng)基培養(yǎng)傳至第8代的臍帶間充質(zhì)干細胞作為對照組。顯微鏡下觀察細胞的生長狀態(tài)，并于第3天收集細胞，與對照組相比，添加臍帶間充質(zhì)干細胞生物活性因子的組別，間充質(zhì)干細胞增殖能力顯著增強。