本發(fā)明涉及一類抗腫瘤含2-氨基嘧啶的萘酰亞胺類化合物，屬于有機合成技術領域。
背景技術：
研究發(fā)現(xiàn)萘酰亞胺衍生物具有良好的抗癌活性，其中Amonafide(N-(β-二甲基氨基乙基)-3-胺基-1,8-萘酰亞胺)(Malviya V K,Liu P Y,Alberts D S,et al.Am.J.Clin.Oncol.,1992,15:41-44.)和Mitonafide(N-(β-二甲基氨基乙基)-3-硝基-1,8-萘酰亞胺)(Brana M.F,Santos A.,Roldan C.M.,et al.Eur.J.Med.Chem.Chim.Ther.,1981,16,207-212)是非常著名的兩個化合物，已經(jīng)進入二期臨床試驗。該類化合物能夠有效地抑制腫瘤細胞的生長，其作用機理是嵌插入DNA的堿基對之間，在拓撲異構酶Ⅱ的介入下誘導DNA鏈的斷裂，影響DNA正常的生理功能，從而達到抑制癌細胞增殖的作用。但是，在對Mitonafide的臨床試驗中，發(fā)現(xiàn)它有非常嚴重的中樞神經(jīng)系統(tǒng)(CNS)毒性，并且其臨床活性有限；Amonafide在臨床試驗中的表現(xiàn)也不盡如人意，引起骨髓抑制、嘔吐、皮疹以及中等程度的靜脈炎等副作用。
氨基嘧啶是具有抗腫瘤活性的潛在藥效團，科研人員對其抗腫瘤的藥效關系進行了大量研究。Sviripa等設計合成了一系列含氨基嘧啶藥效團的抗腫瘤藥物分子，一些在體內(nèi)和體外抗腫瘤實驗中展示了較高的細胞毒性，對各種肝癌和結腸癌細胞有好的抑制活性并且口服用藥生物利用率高。Xitao Li等也對含氨基嘧啶基團的化合物的構效關系進行了研究，很多結構表現(xiàn)出好的抗腫瘤活性。
技術實現(xiàn)要素：
本發(fā)明的目的是在萘酰亞胺活性位點接入氨基嘧啶基團，以此來擴展萘酰亞胺類藥物的種類，并得到更加有效、毒副作用小的抗腫瘤藥物。通過在萘酰 亞胺母體上引入2-氨基嘧啶基團，設計合成了一類含2-氨基嘧啶的萘酰亞胺衍生物。其目的是：通過氨基縮合、胺基取代等反應合成一類含2-氨基嘧啶的萘酰亞胺衍生物，一方面希望改善母體的溶解性，另一方面希望通過引入2-氨基嘧啶改變母體的電子分布情況，影響與DNA的作用方式，實驗證明其對體外腫瘤細胞生長具有抑制能力。
本發(fā)明解決上述技術問題所采用的技術方案是：一類含2-氨基嘧啶的萘酰亞胺化合物，所述化合物具有通式T的結構：
通式T中：R選自含雜原子的六元環(huán)、-NHCH2CH2OH、-NHCH2CH2N(CH3)2和-NHCH2CH2CH2CH3中的一種，所述雜原子為N、O和S原子中的至少一種，所述含雜原子的六元環(huán)中有至少一個N原子，且R通過N原子與通式T中的母核連接。
進一步的，所述含雜原子的六元環(huán)選自中的一種。
進一步的，本發(fā)明所述化合物最優(yōu)選為：N-(2’-(N’-嘧啶胺基)-乙基)-4-哌啶基-1,8-萘酰亞胺、N-(2’-(N’-嘧啶胺基)-乙基)-4-嗎啉基-1,8-萘酰亞胺、N-(2’-(N’-嘧啶胺基)-乙基)-4-硫嗎啉基-1,8-萘酰亞胺或N-(2’-(N’-嘧啶胺基)-乙基)-4-吡咯 烷基-1,8-萘酰亞胺。
本發(fā)明的另一技術目的在于提供所述化合物的制備方法，包括以下步驟：以4-溴-1,8萘酐(化合物1)為起始原料，與相應的胺反應得相應中間體4-胺基-1,8萘酐衍生物(化合物2)，化合物2與乙二胺經(jīng)氨基縮合反應得N-(2’-胺基乙基)-6-哌啶基-1,8-萘酰亞胺衍生物(化合物3)，化合物3再與2-溴嘧啶經(jīng)取代反應得到所述化合物。
合成路線如下：
本發(fā)明的另一技術目的在于提供所述化合物在制備抑制腫瘤細胞生長藥物中的應用，所述的腫瘤細胞包括乳腺癌MCF-7細胞和人宮頸癌Hela細胞。
將上述合成的含2-氨基嘧啶的萘酰亞胺類化合物分別用四氮唑鹽還原法對乳腺癌MCF-7細胞和人宮頸癌Hela細胞進行體外抑制腫瘤細胞生長活性的測定，并同時進行以上化合物對HL7702人正常肝細胞的體外抑制細胞生長活性的測定。
所述四氮唑鹽還原法實驗步驟如下：
1、接種細胞
分別將乳腺癌MCF-7細胞、人宮頸癌Hela細胞和HL7702人正常肝細胞收集到培養(yǎng)基中，將細胞稀釋每孔接種約5000個細胞，最外圍加入200μLPBS，提供充足的水分保證細胞的生長環(huán)境，將培養(yǎng)板放至CO2培養(yǎng)箱中溫育一到兩天。
2、添加藥物
當細胞培育至對數(shù)生長期時即可加藥物，用培養(yǎng)基將本發(fā)明所述化合物分別稀釋成2μM、20μM、40μM、80μM四個梯度濃度，向細胞中加入藥物，每個藥物濃度設置4個復孔，減小誤差，并設置對照組，放回CO2培養(yǎng)箱中，培育24h。
3、存活細胞數(shù)的檢測
在所有孔中均加入20μL MTT，放到CO2培養(yǎng)箱中溫育4h；棄去孔中的溶液加入200μL DMSO，溶解形成的結晶。在酶標儀上測定各孔吸光度記錄結果，按下列公式計算出被測物的IC50值。
本發(fā)明的有益效果：
本發(fā)明通過在萘酰亞胺母體接入2-氨基嘧啶基團，設計合成了一類含2-氨基嘧啶的萘酰亞胺類化合物，該類化合物對乳腺癌和宮頸癌等多種不同組織來源的腫瘤細胞具有抑制生長的活性，而對人體正常細胞的抑制活性較小，具有較好的選擇性，在制備抑制腫瘤細胞生長藥物中具有廣闊的前景。
具體實施方式
下述非限制性實施例可以使本領域的普通技術人員更全面地理解本發(fā)明，但不以任何方式限制本發(fā)明。
實施例1
N-(2’-(N’-嘧啶胺基)-乙基)-4-哌啶基-1,8-萘酰亞胺(化合物T1)的合成：
(1)4-哌啶基-1.8-萘酐(中間體2)合成
在100mL兩口瓶中加入5g(18.1mmol)的4-溴-1,8萘酐，加入40mL乙二醇單甲醚攪拌溶解，將2mL(20.2mmol)哌啶加入反應體系，加熱至回流，磁力攪拌4h后停止反應，室溫下冷卻，將冷水加入反應液中，析出黃色沉淀，過濾后干燥，用硅膠柱層析提純(洗脫液為CH2Cl2)得黃色固體4.77g，產(chǎn)率：93.6％。
(2)N-(2’-胺基乙基)-6-哌啶基-1,8-萘酰亞胺(中間體3)的合成
在100mL兩口瓶中，加入20mL無水乙醇和20mL(0.3mol)乙二胺，磁力攪拌下，將4g(14.2mmol)的4-哌啶基-1,8-萘酐分批緩慢加入混合溶液中，升溫至90℃反應1h。TLC跟蹤至反應完全，加熱停止，冷卻后將反應體系倒入冷水中，靜置析出黃色沉淀，抽濾，烘干。烘干后的固體鹽酸水溶液重結晶，干燥得黃色產(chǎn)物2.45g。產(chǎn)率：57.4％。
(3)化合物T1的合成
在50mL兩口瓶中，加入1.0g(3.1mmol)中間體3，加入20mL乙醇攪拌使溶解，再向反應瓶中加入0.49g(3.1mmol)2-溴嘧啶，磁力攪拌，加熱至乙醇回流，反應3h，停止加熱，冷卻后將500mL左右冷水加入中反應體系，析出黃色沉淀，抽濾，水洗后烘干。硅膠柱層析提純(洗脫液為CH3OH:CH2Cl2＝1:22)得黃綠色固體0.95g。產(chǎn)率：76.7％。熔點：143.2-143.9℃。
+ESI MS(M+H):C23H23N5O2,計算值：401.19，實測值：401.28。
1H NMR(500MHz,CDCl3)δ8.57(dd,J＝7.3,1.1Hz,1H),8.49(d,J＝8.1Hz,1H),8.38(dd,J＝8.4,1.1Hz,1H),8.25(s,2H),7.72(dd,J＝5.7,3.3Hz,1H),7.66(dd,J＝8.4,7.3Hz,1H),7.53(dd,J＝5.7,3.3Hz,0H),7.16(d,J＝8.1Hz,1H),4.55–4.48(m,2H),4.31(t,J＝6.7Hz,1H),3.81(s,2H),3.29–3.17(m,4H),1.72(dq,J＝9.0,6.7Hz,4H),1.53–1.37(m,2H).
13C NMR(126MHz,CDCl3)δ167.70(s,1H),165.00(s,2H),164.49(s,2H),162.45(s,2H),157.85(s,10H),157.41(s,2H),132.91(s,5H),131.22(s,6H),130.90(s,4H),130.70(s,5H),130.01(s,2H),128.85(s,3H),126.21(s,2H),125.31(s,5H),122.94(s,2H),114.69(s,5H),54.54(s,11H),40.70(s,5H),39.37(s,5H),26.24(s,11H),24.36(s,5H).
實施例2
N-(2’-(N’-嘧啶胺基)-乙基)-4-嗎啉基-1,8-萘酰亞胺(化合物T2)的合成：
除步驟(1)中用嗎啉代替哌啶外，其他同實施例1的操作，得目標化合物T2。
+ESI MS(M+H):C22H21N5O3,計算值：403.16，實測值：403.22。
1H NMR(500MHz,CDCl3)δ8.59(d,J＝7.2Hz,1H),8.52(d,J＝8.0Hz,1H),8.37(d,J＝8.3Hz,1H),8.23(d,J＝3.7Hz,2H),7.73–7.69(m,1H),7.23(d,J＝8.1Hz,1H),6.49(t,J＝4.8Hz,1H),6.03(s,1H),4.51(t,J＝5.9Hz,2H),3.83(dd,J＝11.6,5.7Hz,2H),3.54–3.45(m,4H),3.05–2.89(m,4H).
13C NMR(101MHz,CDCl3)δ164.97(s,1H),164.50(s,1H),162.35(s,1H),157.97(s,9H),155.87(s,2H),132.92(s,4H),131.53(s,4H),130.32(s,4H),130.05(s,1H),126.05(d,J＝23.8Hz,5H),123.20(s,1H),116.99(s,1H),115.05(s,4H),110.60(s,2H),67.07(s,8H),53.55(s,14H),40.78(s,2H),39.49(s,3H)
實施例3
N-(2’-(N’-嘧啶胺基)-乙基)-4-硫嗎啉基-1,8-萘酰亞胺(化合物T3)的合成：
除步驟(1)中用嗎啉代替哌啶外，其他同實施例1的操作，得目標化合物T3。
+ESI MS(M+H):C22H21N5O2S,計算值：419.14，實測值：419.20。
1H NMR(500MHz,CDCl3)δ8.59(d,J＝7.2Hz,1H),8.52(d,J＝8.0Hz,1H),8.37(d,J＝8.3Hz,1H),8.23(d,J＝3.7Hz,2H),7.73–7.69(m,1H),7.23(d,J＝8.1Hz,1H),6.49(t,J＝4.8Hz,1H),6.03(s,1H),4.51(t,J＝5.9Hz,2H),3.83(dd,J＝11.6,5.7Hz,2H),3.51–3.42(m,4H),2.89–2.34(m,4H).
13C NMR(101MHz,CDCl3)δ164.90(s,3H),164.41(s,3H),162.09(s,3H),157.85(s,13H),156.91(s,3H),132.77(s,7H),131.49(s,8H),130.07(d,J＝23.1Hz,10H),129.56(s,1H),126.52(s,5H),125.98(s,7H),123.09(s,3H),116.98(s,3H),115.99(s,7H),110.57(s,8H),55.60(s,14H),53.49(s,10H),40.70(s,8H),39.40(s,7H),28.18(s,13H).
實施例4
N-(2’-(N’-嘧啶胺基)-乙基)-4-吡咯烷基-1,8-萘酰亞胺(化合物T4)的合成：
除步驟(1)中用嗎啉代替哌啶外，其他同實施例1的操作，得目標化合物T4。
+ESI MS(M+H):C22H21N5O2,計算值：387.17，實測值：387.22。
1H NMR(400MHz,CDCl3)δ8.58(dd,J＝7.8,4.5Hz,2H),8.42(d,J＝8.6Hz, 1H),8.24(d,J＝4.0Hz,2H),7.55–7.49(m,1H),6.80(d,J＝8.7Hz,1H),6.48(t,J＝4.8Hz,1H),6.04(s,1H),4.51(t,J＝5.8Hz,2H),3.84–3.80(m,2H),3.72(d,J＝7.0Hz,4H),2.10(t,J＝6.3Hz,4H).
13C NMR(101MHz,CDCl3)δ165.47(s,8H),164.61(s,10H),162.38(s,8H),157.99(s,48H),152.86(s,9H),133.83(s,21H),132.23(s,23H),131.44(s,31H),122.86(d,J＝49.7Hz,30H),122.55–122.48(m,1H),122.42(s,8H),110.49(d,J＝10.1Hz,26H),108.62(d,J＝4.9Hz,18H),53.32(s,65H),41.12(s,14H),39.33(s,18H),26.22(s,44H)
實施例5
體外抑制腫瘤細胞和正常細胞生長活性測定：
用四氮唑鹽(microculture tetrozolium，MTT)還原法對Hela宮頸癌細胞、MCF-7乳腺癌細胞和HL7702人正常肝細胞進行體外抑制細胞生長活性測定。
四氮唑鹽(MTT)還原法的具體操作是：
(1)接種細胞、培養(yǎng)細胞：當細胞處于對數(shù)生長期時，用胰蛋白酶將貼壁生長的細胞消化下來，收集到含血清的培養(yǎng)基中并稀釋細胞懸液濃度為大約4×105～6×105個/mL。將上述培養(yǎng)液接種到無菌96孔板中，每孔加入100μL細胞懸液(每孔大約5000個細胞)，最外圍每孔加入200μL的PBS緩沖液，為細胞生長環(huán)提供充足的水分環(huán)境。將接種后的培養(yǎng)板放至37℃、5％CO2環(huán)境的培養(yǎng)箱中溫育24h，當細胞處于對數(shù)生長期時即可加藥物。
(2)添加藥物：用培養(yǎng)基將藥物稀釋成2μM，20μM，40μM，80μM四個梯度濃度。每個濃度設置4個復孔來減小誤差。每孔加入100μL藥物溶液(此時藥物濃度稀釋一倍)，對照組設置8～10個復孔，對照組不加藥物用培養(yǎng)基代替。培養(yǎng)板放回培養(yǎng)箱中溫育，使藥物作用24h。
(3)檢測存活細胞數(shù)：取出培養(yǎng)板，每孔加入20μL MTT。放回培養(yǎng)箱中培養(yǎng)4h。吸出所有孔中的培養(yǎng)基和MTT，注意不要吸走孔底部的紫色結晶。每孔中加入200μL DMSO溶解甲臜結晶，在搖床上震蕩10分鐘。將96孔板放入酶標儀中測定每個孔吸光度。波長為490nm，570nm，625nm。計算細胞生長抑 制率和IC50值。
對化合物T1～4的體外生測結果如下：
表1.化合物T1-4對Hela，MCF-7和HL7702細胞株的IC50值
從表1可以看出化合物T1-4對腫瘤細胞株Hela、MCF-7都表現(xiàn)出良好的抑制增殖效果，對正常細胞HL7702的抑制活性較小，具有選擇性。