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咖啡??鼘幩嵫苌锛白鳛樯窠?jīng)元修復及保護藥物的應用的制作方法

文檔序號:12241115閱讀:628來源:國知局
咖啡??鼘幩嵫苌锛白鳛樯窠?jīng)元修復及保護藥物的應用的制作方法與工藝

本發(fā)明屬生物制藥領域,特別是涉及一種咖啡??鼘幩嵫苌?,該衍生物具有對神經(jīng)元修復和保護的作用。



背景技術:

神經(jīng)退行性疾病是一種大腦和脊髓的細胞神經(jīng)元喪失的疾病狀態(tài)。大腦和脊髓由神經(jīng)元組成,神經(jīng)元有不同的功能,如控制運動,處理感覺信息,并作出決策。大腦和脊髓的細胞一般是不會再生的,所以過度的損害可能是毀滅性的,不可逆轉(zhuǎn)的。神經(jīng)退行性疾病是由神經(jīng)元或其髓鞘的喪失所致,隨著時間的推移而惡化,導致功能障礙。初步治療取決于具體疾病的診斷。目前,僅有少數(shù)幾個藥物可用于一些神經(jīng)退行性疾病。因此,尋找安全有效的治療藥物迫在眉睫。

牛蒡,為菊科牛蒡?qū)俣晟荼局参?,又名“惡實”、白肌人參或蒡翁菜等。作為抗衰老、降血糖的特種保健蔬菜和經(jīng)濟作物,牛蒡在中國有廣泛種植。牛蒡根在《藥性論》、《本草拾遺》等典籍中多有記載,有抗氧化防衰老的作用,但沒有形成中草藥類的商品,多作為牛蒡子的副產(chǎn)品而廢棄不用。近年來,國內(nèi)外學者研究發(fā)現(xiàn),牛蒡根對人體具有多種藥理作用,包括保肝,抗炎和抗氧化等,這些功效與其含有大量的咖啡??鼘幩峄衔镉嘘P。但牛蒡根中具有何種結(jié)構(gòu)的咖啡??鼘幩嵫苌飳ι窠?jīng)元所起到的作用卻未見報道。



技術實現(xiàn)要素:

發(fā)明目的:本發(fā)明的目的在于提供一種咖啡酰奎寧酸衍生物,這些衍生物均為新的化合物。

本發(fā)明的另一目的在于提供一種咖啡??鼘幩嵫苌锏闹苽浞椒ā?/p>

本發(fā)明的再一目的在于提供一種咖啡??鼘幩嵫苌镏苽溆糜谏窠?jīng)元修復和保護藥物的應用。

本發(fā)明的再一目的在于提供一種含有上述咖啡??鼘幩嵫苌锏乃幬锝M合物,和一種以上藥學可接受的載體。

技術方案:

為實現(xiàn)上述目的,本發(fā)明采用以下技術方案:

一種咖啡??鼘幩嵫苌?,具體包括具有下式結(jié)構(gòu)的化合物或其藥學上可接受的鹽:

所述的藥學上可接受的鹽可以是酸加成鹽、堿加成鹽或兩性離子存在。

例如:乙酸鹽、鹽酸鹽、硫酸鹽、苯甲酸鹽等。

本發(fā)明含有上述咖啡??鼘幩嵫苌锏乃幬锝M合物,和一種以上藥學可接受的載體。

所述載體包括各種藥用輔料、包材等。根據(jù)制劑需要進行選擇。例如輔料包括填充劑、崩解劑、粘合劑、潤滑劑等,可以適用于口服、吸入、非腸胃給藥或表面給藥;劑型包括但不限于注射劑、溶液劑、片劑、膠囊劑、顆粒劑等。

一種如上所述咖啡酰奎寧酸衍生物,可制備用于神經(jīng)元修復和保護藥物的應用。所述咖啡??鼘幩嵫苌锏膽?,可以是神經(jīng)退行性疾病、創(chuàng)傷性腦損傷、中風疾病藥物。

一種如上所述咖啡??鼘幩嵫苌锏闹苽浞椒?,其特征在于:取牛蒡根藥材,8-20倍量的質(zhì)量百分比為55%乙醇水溶液浸泡,加熱回流提取3次,第一次2h,后兩次1h;合并提取液,減壓回收溶劑得到濃縮浸膏;將浸膏分散于適量水中,用乙酸乙酯萃取;減壓回收溶劑得到乙酸乙酯萃取物,運用色譜分離手段,對乙酸乙酯層萃取物進行提取分離,得到所述的咖啡??鼘幩嵫苌?;結(jié)合理化性質(zhì)和現(xiàn)代波譜學手段,鑒定結(jié)構(gòu)式如下:

優(yōu)點及效果:本發(fā)明的二咖啡??鼘幩嵫苌锞哂酗@著的神經(jīng)元修復和保護活性,可開發(fā)用于神經(jīng)退行性疾病、創(chuàng)傷性腦損傷、中風疾病等疾病的治療,為此類疾病的治療提供潛在的機會。

附圖說明:

1、附圖1為本發(fā)明兩個新化合物的結(jié)構(gòu)圖;

2、附圖2為MTT[3-(4,5)-雙甲基-2-噻唑-(2,5)-苯基溴化四氮唑藍]法測定的咖啡??鼘幩嵫苌飳^氧化氫介導的SH-SY5Y細胞損傷的修復結(jié)果示意圖;注:縱坐標為細胞存活率,橫坐標:con組代表空白組,其他組均加入400μM的過氧化氫,其中7.5,15,30和15,30,60分別代表不同濃度的給藥組。下同。

3、附圖3為LDH(乳酸脫氫酶)法測定的咖啡??鼘幩嵫苌? 對過氧化氫介導的SH-SY5Y細胞損傷的修復結(jié)果示意圖。

具體實施方式:

下面結(jié)合實施例和附圖對本發(fā)明作進一步的描述,但發(fā)面的實施例方式不限于此。

下面通過以下實施例進一步詳細說明本發(fā)明。

實施例1:咖啡??鼘幩嵫苌顰和B的制備。

牛蒡根藥材10.0kg,8-20倍量的質(zhì)量百分比55%乙醇水溶液浸泡過夜,加熱回流提取3次,第一次2h,后兩次1h。合并提取液,減壓回收溶劑得到濃縮浸膏。將浸膏分散于適量水中,依次用石油醚、二氯甲烷、乙酸乙酯和正丁醇萃取。減壓回收溶劑得到石油醚萃取物(15.6g),二氯甲烷萃取物(43.1g),乙酸乙酯萃取物(256.8g)和正丁醇萃取物(843.2g)。經(jīng)檢測,乙酸乙酯層活性最佳。將乙酸乙酯萃取物(256.8g)過硅膠柱,用二氯甲烷-甲醇洗脫(100:1-1:100),得到15個流份。將流份Fr.12(10g)用ODS柱色譜分離,洗脫溶劑甲醇水(10:90-100:0),得到18個流份。流份Fr.12-10用ODS柱色譜分離,洗脫溶劑甲醇水(10:90-100:0),得到10個流份。流份Fr.12-10-4(800mg)用制備液相制備,色譜條件(JASCO制備型高效液相色譜儀,YMC-Pack Pro ODS-A C18,Ф250×10mm,10μm,水:乙腈:三氟乙酸=77.5:22.5:1),得到A(18mg,rt=65min)和B(80mg,rt=48min)。

化合物A的HR-MS數(shù)據(jù)和NMR數(shù)據(jù):HR-TOF-MS m/z(rel.int.):645.1453[M-H+]-(calcd.645.1456for C30H29O16);1H-NMR(600MHz,CD3OD):δ:7.60,7.55(each 1H,d,J=15.8Hz,H-7″,7″′),7.07,7.05(each 1H,d,J=1.9Hz,H-2″,2″′),6.98,6.96(each 1H,dd,J=1.9,8.1Hz,H-6″,6″′),6.79,6.77(each 1H,d,J=8.1Hz,H-5″,5″′),6.32,6.23(each 1H,d,J=15.8Hz,H-8″,8″′),5.58(1H,m,H-5),5.10(1H,dd,J=3.2,8.5Hz,H-4),4.54(1H,m,H-3′),4.44(1H,m,H-3),3.70(OCH3),2.78(1H,d,J =5.2,16.0Hz,H-2′a),2.60(1H,d,J=5.2,16.0Hz,H-2′b),2.60(1H,m,H-6a),2.50(1H,m,H-2a),2.50(1H,m,H-2b),2.16(1H,m,H-6b).13C-NMR(150MHz,CD3OD):δ:174.9(C-1′),171.2(C-7),169.9(C-4′),168.1(C-9″),168.0(C-9″′),149.7(C-4″),149.1(C-4″′),147.7(C-7″),147.7(C-7″′),146.8(C-3″),146.8(C-3″′),127.8(C-1″),127.7(C-1″′),123.1(C-6″),123.1(C-6″′),116.5(C-5″),116.5(C-5″′),115.3(C-2″),115.2(C-2″′),115.1(C-8″),114.7(C-8″′),80.5(C-1),75.5(C-4),68.4(C-2′),68.3(C-5),67.2(C-3),52.8(OCH3),40.2(C-3′),37.4(C-6),35.7(C-2).

化合物B的HR-MS數(shù)據(jù)和NMR數(shù)據(jù):HR-TOF-MS m/z(rel.int.):669.1439[M+Na]+(calcd.669.1432for C30H30O16Na);1H-NMR(600MHz,CD3OD):δ:7.62,7.61(each 1H,d,J=15.8Hz,H-7″,7″′),7.10,7.07(each 1H,d,J=1.9Hz,H-2″,2″′),7.00,6.96(each1H,dd,J=1.9,8.3Hz,H-6″,6″),6.81,6.79(each 1H,d,J=8.2Hz,H-5″,5″′),6.35,6.30(each 1H,d,J=15.8Hz,H-8″,8″′),5.47(1H,m,H-3),5.43(1H,m,H-5),4.47(1H,m,H-2')3.95(each 1H,dd,J=3.7,9.4Hz,H-4),3.56(OCH3),2.77(1H,m,H-2a)2.71(2H,m,H-3'),2.62(1H,m,H-6a),2.45(1H,m,H-2b),2.00(1H,m,H-6b).13C-NMR(150MHz,CD3OD):δ:175.0(C-1′),174.0(C-7),171.3(C-4′),168.6(C-9″′),167.7(C-9″),149.8(C-4″),149.6(C-4″′),148.1(C-7″),147.4(C-7″′),146.8(C-3″),146.7(C-3″′),127.7(C-1″),127.6(C-1″′),123.3(C-6″),123.0(C-6″′),115.3(C-8″),115.3(C-2″),115.2(C-8″′),115.2(C-2″′),115.0(C-5″),114.9(C-5″′),80.5(C-1),73.2(C-3),71.6(C-4),71.0(C-5),68.2(C-2′),52.8(OCH3),40.3(C-3′),37.9(C-6),32.7(C-2).

實施例2:咖啡??鼘幩嵫苌矬w外神經(jīng)細胞的修復和保護活性研究。

本發(fā)明采用MTT和LDH活性測試法測定咖啡??鼘幩嵫苌飳^氧化氫介導的SH-SY5Y細胞損傷的保護作用,結(jié)果表明咖啡??鼘幩嵫苌锞哂酗@著的修復神經(jīng)細胞的作用,因此可以用于研究開發(fā)治療神經(jīng)退行性疾病、中風及創(chuàng)傷性腦損傷藥物。

(1)儀器與試劑:DMEM培養(yǎng)基購自Hyclone公司,胎牛血清為Hyclone產(chǎn)品;CKX31型倒置顯微鏡(日本奧林巴斯公司);恒溫CO2培養(yǎng)箱(美國Thermo公司);5810R型臺式高速低溫離心機(德國Eppendorf公司);全自動酶標儀(美國Biotek集團);過氧化氫(國藥集團化學試劑有限公司);LDH試劑盒(南京建成)

(2)細胞培養(yǎng):將復蘇后的細胞轉(zhuǎn)移至培養(yǎng)瓶中,37℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)(5%CO2,相對濕度90%),隔天更換培養(yǎng)液。待細胞長滿瓶壁的80-90%左右時,進行傳代或下步試驗,控制細胞密度在1×105cells/mL左右。

(3)MTT法測定生物活性:取指數(shù)生長期的SH-SY5Y細胞,接種于96孔培養(yǎng)板中,細胞數(shù)密度為1×105個/mL,每孔加入100μL,置37℃,5%CO2孵箱中培養(yǎng)12h,細胞貼壁后每孔加入100ul400umol/L過氧化氫損傷8h,損傷結(jié)束后棄去培養(yǎng)液,分別加入不同濃度(20ug/ml,40ug/ml,80ug/ml)的新化合物培養(yǎng)液200ul,每個濃度設3個復孔,置37℃、5%CO2孵箱中培養(yǎng)24h。24h后每孔加入MTT(5mg/mL)20μl,繼續(xù)在孵箱中孵育4h。棄去上清,每孔加入150μlDMSO,在490nm處測定吸光值(OD值)。按照下式計算活細胞的比例:

活細胞所占比例(Cell Viability)=(加藥組OD值)/(對照組OD)值×100%

結(jié)果如下:如圖2所示,與損傷組相比較,加藥組的細胞生存率明顯高于損傷組,化合物A在7.5,15和30μM濃度下的細胞存活率為52%,64%和78%;化合物B在15,30和60μM濃度下的細胞存活率為58%,69%和82%。

(4)LDH法測定活性:取指數(shù)生長期的SH-SY5Y細胞,接種于 96孔培養(yǎng)板中,細胞數(shù)密度為1×105個/mL,每孔加入100μL,置37℃,5%CO2孵箱中培養(yǎng)12h,細胞貼壁后每孔加入100ul 400umol/L過氧化氫損傷6h,損傷結(jié)束后棄去培養(yǎng)液,分別加入不同濃度(20ug/ml,40ug/ml,80ug/ml)的新化合物的培養(yǎng)液200ul,每個濃度設3個復孔,置37℃、5%CO2孵箱中培養(yǎng)24h。24h后取上清液,按照LDH試劑盒說明書要求進行反應。反應結(jié)束后,在酶標儀450nm處測定OD值。

LDH釋放量的結(jié)果表示為相當于空白組的百分數(shù)。

結(jié)果顯示:如圖3所示,與損傷組相比較,加藥組的LDH釋放量明顯低于損傷組,化合物A在7.5,15和30μM濃度下的LDH釋放量為230%,130%和110%;化合物B在15,30和60μM濃度下的LDH釋放量為294%,231%和139%。

上述結(jié)果表明:咖啡??鼘幩嵫苌锞哂休^好的神經(jīng)細胞修復活性,且在一定劑量范圍內(nèi)呈現(xiàn)良好的劑量依賴性關系。

實施例3:藥物組合物的制備

化合物A 6.5g

糊精 80g

按常規(guī)方法,將上述物質(zhì)混合均勻后,分1000等份分別裝入普通明膠膠囊,得到1000顆膠囊。

實施例4:藥物組合物的制備

化合物B 6.5g

糊精 80g

按常規(guī)方法,將上述物質(zhì)混合均勻后,分1000等份分別裝入普通明膠膠囊,得到1000顆膠囊。

上述實施例3、4所述載體為糊精,載體也可以包括各種藥用輔料、包材等。根據(jù)制劑需要進行選擇,例如輔料包括填充劑、崩解劑、粘合劑、潤滑劑等,可以適用于口服、吸入、非腸胃給藥或表面給藥;劑型包括但不限于注射劑、溶液劑、片劑、膠囊劑、顆粒劑等。

上述實施例為本發(fā)明較佳的實施方式,但本發(fā)明的實施方式并不受上述實施例的限制,其他的任何未背離本發(fā)明的精神實質(zhì)與原理下所做的改變、修飾、替代、組合、簡化均應為等效的置換方式,都包含在本發(fā)明的框架包含范圍之內(nèi)。

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