本發(fā)明涉及生物醫(yī)藥及基因治療領(lǐng)域，具體涉及一種靶向人TSPAN8基因的siRNA及其在制備抗腫瘤藥物中的應(yīng)用。

背景技術(shù)：

TSPAN8的英文全稱是tetraspanin 8(四跨膜蛋白8)，又稱為CO-029，TM4SF3，位于12號染色體上(Genebank Accession：NM_004616)。TSPAN8是四跨膜超家族重要成員之一。TSPAN8通過影響吞噬細(xì)胞糖蛋白1(phagocyticglycoprotein 1，CD44)(Guo Q.ect,Tetrasoanin CO-029inhibit colorectal cancer cell movement by deregulationg cell-matrix and cell-cell adhensions,PloS One.2012；7(6)e:38464),或是影響局部粘著斑激酶(Focal Adhesion Kinase,FAK)，或是影響樁蛋白(Paxilin)(Shijing Yue等，Tspan8and CD151promote metastasis by distinct mechanisms.European Journal of Cancer(2013)49,2934–2948),進(jìn)而影響層粘連蛋白整合素(laminin-binding intergrinα3β1)和成纖維粘連蛋白整合素(fibronectin-intergrinα5β1)的表達(dá)，降低細(xì)胞的遷移和黏附能力。TSPAN8在細(xì)胞表面與整合素、生長因子受體以及其他四跨膜超蛋白形成四跨膜網(wǎng)絡(luò)，并對整合素、生長因子受體的功能產(chǎn)生影響。目前研究表面其參與細(xì)胞的黏附、遷移及增殖等眾多病理生理過程。(Wu Jin-cai等，The influence of down-regulation of Tspan8by shRNA on metastasis and invasion of hepatocellular carcinomas,China J Hepatobiliary Surg,February 2012,Vol.18,No.2)。

腫瘤是威脅人類健康的疾病之一，至今缺少理想的治療手段和藥物，開 發(fā)新的藥物迫在眉睫。基因治療是非常有前景的，在不久的將來或許會成為腫瘤治療的一個有效手段。RNA干擾技術(shù)是一種沉默基因表達(dá)的技術(shù)，兩名美國科學(xué)家Andrew Z.Fire和Craig C.Mello因?qū)Υ隧椉夹g(shù)的貢獻(xiàn)于2006年被授予諾貝爾生理學(xué)獎。RNA干擾技術(shù)的原理是較長雙鏈RNA被特異核酸酶Dicer切割加工成21-23nt的由正義和反義鏈組成的小干擾RNA。小干擾RNA隨后形成沉默復(fù)合體(RNA-induced silencing complex，RISC)解旋成單鏈。反義鏈引導(dǎo)該沉默復(fù)合體通過堿基配對特異性結(jié)合到目標(biāo)mRNA上，使mRNA分解。

小發(fā)夾RNA(short hairpin RNA，shRNA)是一種形成急轉(zhuǎn)彎結(jié)構(gòu)的RNA序列，可以經(jīng)由RNA干擾使基因沉默。

膠質(zhì)瘤是一種發(fā)生于腦或脊髓的腫瘤，最常發(fā)生部位為腦，因其來源神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞而被稱為膠質(zhì)瘤。膠質(zhì)瘤占腦和中樞神經(jīng)系統(tǒng)腫瘤的30％、占腦惡性腦腫瘤的80％，是人類健康的嚴(yán)重威脅。腦膠質(zhì)瘤的治療通常采用手術(shù)，放療和化療相結(jié)合。膠質(zhì)瘤常發(fā)生于腦，手術(shù)需要開顱，手術(shù)時間長。膠質(zhì)瘤和正常神經(jīng)組織交錯生長，邊界不清，瘤組織不易清理干凈，膠質(zhì)瘤易復(fù)發(fā)。對于化療，由于血腦屏障的存在，使普通的抗腫瘤藥物療效不佳。對于放療，也存在定位困難和對神經(jīng)損傷的擔(dān)心。目前膠質(zhì)瘤仍是醫(yī)學(xué)界的一個難題。

當(dāng)前有關(guān)TSPAN8的研究主要集中在肝癌消化道癌領(lǐng)域，在膠質(zhì)瘤基因治療領(lǐng)域還是一片空白。

技術(shù)實現(xiàn)要素：

本發(fā)明的目的在于提供了一種靶向人TSPAN8基因的siRNA，本發(fā)明的另一目的在于提供該siRNA在制備抗腫瘤藥物中的應(yīng)用。

本發(fā)明人經(jīng)實驗證明惡性程度較高的膠質(zhì)瘤，TSPAN8的表達(dá)量也較高，調(diào)節(jié)TSPAN8的表達(dá)能影響膠質(zhì)瘤細(xì)胞的增殖。

本發(fā)明結(jié)合TSPAN8分子在瘤細(xì)胞中的功能，利用RNA干擾技術(shù)開發(fā)新的治療藥物。

本發(fā)明設(shè)計靶向TSPAN8基因的siRNA，特異性抑制TSPAN8基因的表達(dá)，從而抑制膠質(zhì)瘤的增殖。進(jìn)一步地本發(fā)明提供了包含該siRNA的shRNA分子，也具有抑制TSPAN8的表達(dá)的作用，可能成為治療膠質(zhì)瘤的藥物。

本發(fā)明的第一方面，是提供一種靶向人TSPAN8基因，并特異性抑制TSPAN8基因表達(dá)的siRNA或shRNA。

本發(fā)明提供了一種靶向人TSPAN8基因并特異性抑制TSPAN8基因表達(dá)的siRNA，包括正義鏈和反義鏈，siRNA的序列如下：

正義鏈：5’-GCAAUGACUCUCAAGCAA-3’ (SEQ ID NO.1)

反義鏈:5’-CGUUACUGAGAGUUCGUU-3’ (SEQ ID NO.2)

本發(fā)明提供了一種包含上述的siRNA序列的shRNA序列，包括正義鏈和反義鏈，此shRNA序列為：

正義鏈：

5’-CCGGGCAAUGACUCUCAAGCAACUCGAGUUGCUUGAGAGUCAUUGC-3’(SEQ ID NO.3)

反義鏈：

5’-AAUUCAAAAAAGCAAUGACUCUCAAGCAACUCGAGUUGCUUGAGAGUCAUUGC-3’(SEQ ID NO.4)

進(jìn)一步地，本發(fā)明提供了一種轉(zhuǎn)錄上述的shRNA的DNA序列，DNA序列為：

轉(zhuǎn)錄正義鏈DNA:5’-CCGGGCAATGACTCTCAAGCAACTCGAGTTGCTTGAGAGTCATTGC-3’(SEQ ID NO.5)

轉(zhuǎn)錄反義鏈DNA:5’- AATTCAAAAAAGCAATGACTCTCAAGCAACTCGAGTTGCTTGAGAGTCATTGC-3’(SEQ ID NO.6)

本發(fā)明的第二方面，提供了一種重組載體，含有如上所述的靶向人TSPAN8基因的siRNA或shRNA。

所述的重組載體，載體可選自質(zhì)粒、慢病毒載體、腺病毒載體等，優(yōu)選為質(zhì)粒pLKD-CMV-GFP-U6。

本發(fā)明的第三方面，是提供上述的siRNA、shRNA，或DNA序列在制備TSPAN8基因表達(dá)抑制劑中的應(yīng)用。

進(jìn)一步地，本發(fā)明還提供了上述的siRNA、shRNA，或DNA序列在制備抗腫瘤藥物中的應(yīng)用。

所述的腫瘤為膠質(zhì)瘤。

本發(fā)明主要技術(shù)方案是：

1.siRNA的設(shè)計和干擾載體的制備；

2.干擾慢病毒顆粒的包裝；

3.干擾效率在蛋白水平的驗證；

4.MTT法檢測干擾TSPAN8后細(xì)胞系增殖的影響；

5.克隆形成檢測干擾TSPAN8后對細(xì)胞系增殖的影響。

本發(fā)明涉及的干擾RNA能在信使RNA水平和蛋白水平有效抑制人TSPAN8基因的表達(dá)，從而抑制膠質(zhì)瘤細(xì)胞系U87和U251的增殖，為膠質(zhì)瘤的治療提供了新的途徑。

附圖說明

圖1采用Western blot檢測TSPAN8干擾慢病毒感染U87細(xì)胞，對目的基因蛋白表達(dá)的敲減效果

圖2為MTT法檢測干擾TSPAN8抑制U87和U251細(xì)胞系生長的折線圖；

圖3為Transwell法檢測TSPAN8抑制U87和U251細(xì)胞侵襲的照片圖；

圖4為克隆形成法檢測干擾TSPAN8抑制U87和U251形成克隆的照片圖。

圖2-4中含有空載體的病毒(Negative control)和干擾TSPAN8的病毒(sh TSPAN8)，Blank是指沒有經(jīng)過病毒處理的細(xì)胞。

具體實施方式

下面結(jié)合附圖對本發(fā)明進(jìn)一步說明。以下實施方式只是較佳的實施方式中的一種，并非對本發(fā)明的限制。其他的任何未背離本發(fā)明的精神實質(zhì)與原理下所作的改變、修飾、替代、組合、簡化，均應(yīng)為等效的置換方式，都包含在本發(fā)明的保護(hù)范圍之內(nèi)。未作特殊說明的實驗試劑和方法，均指常規(guī)試劑和方法。

本發(fā)明所用試劑和原料均市售可得或可按文獻(xiàn)方法制備。下列實施例中未注明具體條件的實驗方法，通常按照常規(guī)條件如Sambrook等人《分子克?。簩嶒炇抑改稀?New York：Cold Spring Harbor Laboratory Press，1989)中所述的條件，或按照常規(guī)條件，或按照制造廠商所建議的條件。

實施例1TSPAN8siRNA序列設(shè)計與干擾質(zhì)粒構(gòu)建

在ensembl網(wǎng)站(http://www.ensembl.org/index.html)搜索并下載TSPAN8的cDNA序列，使用Life technologies公司的BLOCK-iT RNA Designer軟件(http://rnaidesigner.lifetechnologies.com/rnaexpress/)在線設(shè)計與TSPAN8cDNA互補的siRNA序列肆條。選取得分最高的siRNA序列，如下：

siRNA1～4的序列如下：

siRNA1

正義鏈：5’-GCAAUAUGGGUACGAGUAA-3’ (SEQ ID NO.7)

反義鏈:5’-UUACUCGUACCCAUAUUGC-3’ (SEQ ID NO.8)

siRNA2

正義鏈：5’-GCAAUGACUCUCAAGCAA-3’ (SEQ ID NO.1)

反義鏈:5’-CGUUACUGAGAGUUCGUU-3’ (SEQ ID NO.2)

siRNA3

正義鏈：5’-GGAAGCCAUAAUUGUGUUU-3’ (SEQ ID NO.9)

反義鏈:5’-AAACACAAUUAUGGCUUCC-3’ (SEQ ID NO.10)

siRNA4

正義鏈：5’-GAGUUUAAAUGCUGCGGUU-3’ (SEQ ID NO.11)

反義鏈:5’-AACCGCAGCAUUUAAACUC-3’ (SEQ ID NO.12)

輸入到NCBI網(wǎng)站的Standard Nuceotide BLAST界面，與人的轉(zhuǎn)錄序列比對，確認(rèn)目的基因與除TSPAN8以外的轉(zhuǎn)錄本無高度同源性(16個堿基以上)，排除偏靶效應(yīng)。然后按照“AgeI酶切位點粘性末端-正義鏈-莖環(huán)-反義鏈-編碼終止序列-EcoRI酶切位點粘性末端”的順序，將siRNA1～4組裝入shRNA1～4(Y2037，Y2038，Y2039，Y2040)正義鏈和反義鏈。

shRNA1(Y2037):

轉(zhuǎn)錄正義鏈DNA:5’-CCGGGCAATATGGGTACGAGTAATTCAAGAGATTACTCGTACCCATATTGCTTTTTTG-3’ (SEQ ID NO.13)

轉(zhuǎn)錄正義鏈DNA:5’-AATTCAAAAAAGCAATATGGGTACGAGTAATCTCTTGAATTACTCGTACCCATATTGC-3’ (SEQ ID NO.14)

shRNA2(Y2038):

轉(zhuǎn)錄正義鏈DNA:5’-CCGGGCAATGACTCTCAAGCAACTCGAGTTGCTTGAGAGTCATTGC-3’(SEQ ID NO.5)

反義鏈DNA:5’-AATTCAAAAAAGCAATGACTCTCAAGCAACTCGAGTTGCTTGAGAGTCATTGC-3’(SEQ ID NO.6)

shRNA3(Y2039):

轉(zhuǎn)錄正義鏈DNA:5’-CCGGGGAAGCCATAATTGTGTTTCTCAAGAGAAAACACAAT TATGGCTTCCTTTTTTG-3’(SEQ ID NO.15)

轉(zhuǎn)錄正義鏈DNA:5’-AATTCAAAAAAGGAAGCCATAATTGTGTTTTCTCTTGAGAAACACAATTATGGCTTCC-3’(SEQ ID NO.16)

shRNA4(Y2040):

轉(zhuǎn)錄正義鏈DNA:5’-CCGGGAGTTTAAATGCTGCGGTTCTCAAGAGAAACCGCAGCATTTAAACTCTTTTTTG-3’(SEQ ID NO.17)

轉(zhuǎn)錄正義鏈DNA:5’-AATTCAAAAAAGAGTTTAAATGCTGCGGTTTCTCTTGA GAACCGCAGCATTTAAACTC-3’(SEQ ID NO.18)

把以上信息交invitrogen公司合成得到DNAOligo。

DNA Oligo加入ddH₂O溶解，濃度10mM。各別取22.5μl的DNA Oligo與5μl的10×退火緩沖液(成分為100mMTris-HCl(pH 7.5)，10mM EDTA，1mM NaCl)混合，95℃水浴12min后拿出，在室溫下冷卻至室溫。

25℃下，用T4連接酶(日本TAKARA公司生產(chǎn))將互補雙鏈與AgeI、EcoRI酶切的載體連接30min，體系按說明書配制(DNA 4μl,載體2μl,PEG40002μl,10×T4buffer 2μl,T4連接酶1μl,ddH2O 9μl)。取連接產(chǎn)物加入裝有大腸桿菌DH5α感受態(tài)細(xì)胞的1.5ml規(guī)格離心管使其混合，置于冰上30分鐘，然后放入42℃水浴90秒，再放回冰上2分鐘后加入800μl不含抗生素的培養(yǎng)基，置37℃細(xì)菌培養(yǎng)箱中搖1小時。4500轉(zhuǎn)/分離心收集得到的細(xì)菌后涂固體LB培養(yǎng)基平板，37℃細(xì)菌培養(yǎng)箱過夜培養(yǎng)至長出菌落。

挑取菌落溶于含20μl抗性培養(yǎng)基的離心管中，進(jìn)行菌落PCR鑒定，鑒定所用的引物為：

PLKD-F：CCTATTTCCCATGATTCCTTCATA(SEQ ID NO.19)

PLKD-R：GAAATACGGTTATCCACGCG(SEQ ID NO.20)

轉(zhuǎn)化成功的取樣送測序(華大基因有限公司提供測序服務(wù)),測序使用的引物是：PLKD-F：CCTATTTCCCATGATTCCTTCATA(SEQ ID NO.21)。測序結(jié)果比對正確后，應(yīng)將菌液加入含15ml氨芐青霉素LB培養(yǎng)基的50ml離心管中。將離心管放入37℃搖床培養(yǎng)20小時。用質(zhì)粒小提中量試劑盒(天根公 司)抽取質(zhì)粒，測定DNA濃度后備用。

實施例2：干擾慢病毒顆粒的包裝

在37℃5％CO₂的細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)HEK 293T細(xì)胞(下簡稱293T,購自中國科學(xué)院典型培養(yǎng)物保藏委員會細(xì)胞庫)，培養(yǎng)基使用添加了10％胎牛血清(美國紐約Gibco公司生產(chǎn))的DMEM(美國紐約Gibco公司生產(chǎn))培養(yǎng)基.傳代培養(yǎng)293T細(xì)胞于直徑為10cm的培養(yǎng)皿中，當(dāng)細(xì)胞長到匯合度為50％左右，用無血清的培養(yǎng)基培養(yǎng)4小時。

按Lipofectamine 2000(美國Invitrogen公司生產(chǎn))說明書操作，準(zhǔn)備好22.5g上面得到的pLKD-CMV-GFP-U6-shRNA質(zhì)粒(或不含shRNA的空載體質(zhì)粒)、7.9g病毒外殼質(zhì)粒psPAX2(中國上海紐恩生物科技有限公司提供)、14.6g包裝質(zhì)粒pMD2.G(中國上海紐恩生物科技有限公司提供)的轉(zhuǎn)染混合物。

把混合物添加到已經(jīng)饑餓培養(yǎng)過的細(xì)胞中進(jìn)行轉(zhuǎn)染，4-6小時后更換為正常的培養(yǎng)基。分別在換液培養(yǎng)24和48小時后收集培養(yǎng)基，經(jīng)0.22μm孔徑的膜過濾后，再用CP 80MX離心機(日本日立公司生產(chǎn))經(jīng)4℃、100000g超速離心2小時，得到病毒沉積塊。用OPTI-MEM(美國紐約Gibco公司生產(chǎn))培養(yǎng)基重懸收集得到慢病毒。

通過以上方法包裝得到含有空載體的病毒(control)和干擾TSPAN8的病毒(shTSPAN8：Y2037，Y2038，Y2039，Y2040)。慢病毒的滴度測定采用稀釋計數(shù)法,把293T細(xì)胞鋪96孔板，每孔約5000個細(xì)胞，過夜培養(yǎng)。準(zhǔn)備好用培養(yǎng)基10倍梯度稀釋的病毒共10份，即最低、最高濃度分別為原液的1/10^-10、1/10^-1,每份100μl換掉對應(yīng)孔的培養(yǎng)基培養(yǎng)過夜后更換正常培養(yǎng)基。換掉新鮮培養(yǎng)基再培養(yǎng)兩天后，置熒光顯微鏡下觀察最后兩個有熒光的孔的熒光細(xì)胞的克隆數(shù)，用以下公式計算病毒滴度：滴度(TU/ml)＝(X+Y*10)*10/(2*Z)其中X是指倒數(shù)第二個有熒光的孔的熒光細(xì)胞克隆 數(shù)，Y是指倒數(shù)第一個有熒光的孔的熒光細(xì)胞克隆數(shù)，Z是指X對應(yīng)孔所加病毒的稀釋率。

實施例3：干擾效率在蛋白水平的驗證

蛋白樣品的制備：

在直徑6cm培養(yǎng)皿中培養(yǎng)細(xì)胞至大約30％匯合度，分別加入對照慢病毒感染顆粒和干擾TSPAN8的病毒感染顆粒(感染復(fù)數(shù)為10)，繼續(xù)培養(yǎng)細(xì)胞4天。實驗分為5組，分別為：陰性對照病毒感染組(Control),Y2037病毒感染組，Y2038病毒感染組，Y2039病毒感染組和Y2040病毒感染組。收細(xì)胞時先轉(zhuǎn)移培養(yǎng)基至空的15ml規(guī)格離心管，用PBS漂洗兩次細(xì)胞，每次用PBS 3ml，然后用2ml 0.25％胰蛋白酶消化細(xì)胞，待細(xì)胞都變圓漂浮后把之前吸走的培養(yǎng)基倒回培養(yǎng)皿。把消化下來的細(xì)胞隨培養(yǎng)基轉(zhuǎn)移到15ml規(guī)格離心管中，1200轉(zhuǎn)/分離心5分鐘收集細(xì)胞。棄掉上清，加入含有1×PMSF(中國南通碧云天公司生產(chǎn))和1×蛋白酶抑制劑cocktail(美國Thermo Scientific公司生產(chǎn))的RIPA細(xì)胞裂解液(中國南通碧云天公司生產(chǎn))。吹打混勻細(xì)胞和裂解液，放于冰上裂解1小時，每20分鐘用漩渦混合器振蕩混勻。最后離心，離心機設(shè)置為：4℃、13000轉(zhuǎn)/分、15分鐘。吸取離心后的上清液至潔凈的離心管中即為提得的蛋白樣品。把蛋白樣品和等體積的2×蛋白上樣緩沖液(二硫蘇糖醇(DTT)：0.1572g,溴酚藍(lán)；0.01g,Tris-HCl(1M pH 6.8)：0.5ml,10％SDS：2ml,甘油：1ml,H₂O：定容至10ml)混合煮沸5分鐘，完成樣品制備。

Tris(1M pH 6.8)緩沖液的配制方法：稱取Tris Base 24.228g溶于約160ml超純水，充分?jǐn)嚢枞芙?，用鹽酸調(diào)節(jié)pH至6.8，同時用超純水定容至200ml。

Western Blot方法檢測蛋白表達(dá)：

準(zhǔn)備好配制凝膠需要的試劑：

30％acrylamide mix的配制方法：稱取丙烯酰胺29.2g，甲叉雙丙烯酰胺0.8g，用超純水溶解并定容至100ml。

Tris(1.5M pH 8.8)配制方法：稱取Tris Base 36.342g溶于約160ml超純水，充分?jǐn)嚢枞芙?，用鹽酸調(diào)節(jié)pH至8.8，同時用超純水定容至200ml。

Tris(0.5M pH 6.8)緩沖液的配制方法：稱取Tris Base 12.114g溶于約160ml超純水，充分?jǐn)嚢枞芙?，用鹽酸調(diào)節(jié)pH至6.8，同時用超純水定容至200ml。

10％SDS的配制方法：稱取5g十二烷基硫酸鈉(sodium dodecyl sulfate，SDS)，溶于超純水至50ml。

10％APS的配制方法：稱取5g過硫酸銨(Ammonium persulfate，APS)，溶于超純水至50ml。

TEMED是指N,N,N',N'-Tetramethylethylenediamine，中文名N,N,N',N'-四甲基二乙胺。

準(zhǔn)備好電泳裝置(中國上海天能科技有限公司生產(chǎn)的VE-180型垂直電泳槽)和配制1.5mm厚凝膠的玻璃板(中國上海天能科技有限公司生產(chǎn))。把玻璃板用洗潔精、清水洗滌干凈，再用去離子水沖洗一遍，放入電熱鼓風(fēng)干燥箱中烘干。待玻璃板全干后組裝好配膠裝置，配制10％分離膠(ddH₂O：4.0ml,30％acrylamide mix：3.3ml,Tris(PH 8.8 1.5M)：2.5ml,10％SDS：100μl,10％APS：100μl,TEMED：4μl)，將其注入至玻璃板，加入后用300μl超純水封住上表面。

室溫放置30分鐘以上，待水和凝固的分離膠兩相界面變清晰，準(zhǔn)備好5％濃縮膠(ddH₂O：2.7ml,30％acrylamide mix：0.67ml,Tris(PH 6.8 0.5M)：0.5ml,10％SDS：40μl,10％APS：40μl,TEMED：4μl)，倒掉玻璃板中的水，注入濃縮膠，插上梳子，室溫放置20分鐘待其凝固后即可使用。

電泳：

配制10×電泳液(Tris：30.3g,甘氨酸：144.0g,SDS：10.0g,去離子水： 定容至1000ml)，將50ml 10×電泳液與450ml H₂O₂混合即得到500ml 1×電泳液。

安裝好電泳裝置并用清水沖洗干凈，拔掉梳子。倒上500ml電泳液，保持電泳槽內(nèi)槽充滿電泳液，樣品在6000轉(zhuǎn)/分條件下離心1s收集后加入泳道，鄰近樣品放的其中一個空白孔加入預(yù)染marker(加拿大Fermentas公司生產(chǎn)，貨號SM0671)。電泳時電源限定條件：恒流15-20mA。待指示劑顯示樣品接近凝膠下邊界時停止電泳。

轉(zhuǎn)膜：

配制10×轉(zhuǎn)膜液(Tris：30.3g,甘氨酸：144.0g,H₂O：定容至：1000ml)。

接下來配制好1×轉(zhuǎn)膜液(10×轉(zhuǎn)膜液：80ml,甲醇：160ml,H₂O：定容至800ml)。準(zhǔn)備好轉(zhuǎn)膜裝置，兩組9×8cm規(guī)格濾紙，每組三張。把PVDF膜先浸泡在甲醇中約20秒待其浸透無白點，再放入轉(zhuǎn)膜液中平衡后，轉(zhuǎn)移至裝有轉(zhuǎn)膜液的小盒中備用。然后用塑料片輕輕切去濃縮膠，再切割分離膠兩端和與玻璃接觸的面。用塑料片蘸少許轉(zhuǎn)膜液，塞入分離膠下使其松動，然后將其倒扣至裝有轉(zhuǎn)膜液的塑料盆中輕輕搖晃，分離膠即從玻璃上脫離到轉(zhuǎn)膜液中。

打開轉(zhuǎn)膜用的塑料板，浸沒到轉(zhuǎn)膜液中，在轉(zhuǎn)膜液中按如下順序組裝：負(fù)極板(黑)放上海綿→一組濾紙(三張)→分離膠→PVDF膜→一組濾紙(三張)→海綿→正極板。然后夾持好裝置，倒上轉(zhuǎn)膜液，確保轉(zhuǎn)膜的三明治樣結(jié)構(gòu)完全浸沒在轉(zhuǎn)膜液中，蓋上帶有電源線的蓋子，整個電泳裝置置于塑料盆中，電泳盒外圍加上冰水混合物即可開始轉(zhuǎn)膜。轉(zhuǎn)膜時電源限定條件：U＝100V；I＝350mA；t＝75min。

封閉：

配制好10×TBS緩沖液(1L含Tris 24.23g、NaCl 80.06g，HCl調(diào)pH至7.6)，然后用去離子水稀釋10倍得到1×TBS，再加入0.5％(v/v)的吐溫- 20配制成TBST。準(zhǔn)備好5％脫脂奶，將5g脫脂牛奶(中國內(nèi)蒙古伊利實業(yè)集團(tuán)股份有限公司)溶于100ml TBST溶液中。轉(zhuǎn)膜完畢后，取出PVDF膜裝入自封袋，倒入20ml的5％脫脂牛奶，用封口機封牢，置于脫色搖床上搖20分鐘，再轉(zhuǎn)至4℃冰箱過夜存放。

一抗孵育：

從冰箱取出PVDF膜后，先用1×TBST洗滌3次，每次5分鐘。按1：1000稀釋率取用抗體TSPAN8(英國Abcam公司生產(chǎn)，ab22453)及1：8000稀釋率取用抗體HRP偶聯(lián)的GAPDH(上海康成公司生產(chǎn)，KC-5G5)，加入到5ml TBST中，搖勻即得到抗體工作液。把洗滌后的膜裝入自封袋，倒入配好的抗體工作液，中速運轉(zhuǎn)的脫色搖床上孵育120分鐘。一抗孵育完后，若一抗上已經(jīng)有辣根過氧化物酶標(biāo)記(如內(nèi)參蛋白GAPDH的抗體)，則直接跳至顯影步驟，若沒有，則需要二抗孵育。

二抗孵育：

先用1×TBST洗滌3次，每次5分鐘。吸取辣根過氧化物酶標(biāo)記的兔免疫球蛋白抗體(即二抗，美國Cell Signaling Technology公司生產(chǎn)，稀釋率為1:2000)，加入到5ml 1×TBST中搖勻。把洗滌后的膜裝入自封袋，倒入配好的二抗工作液，封口機封住，搖床上搖120分鐘。

顯影：

二抗孵育結(jié)束后，用1×TBST洗滌6次，前3次每次10分鐘，后3次每次5分鐘。在此期間準(zhǔn)備好顯影液、定影液、自來水、膠片、顯影暗匣，剪刀，衛(wèi)生紙。以下操作在顯影暗室中紅光燈輔助下完成。分別吸取400μl顯影底物A和B(中國天根生化科技有限公司生產(chǎn))混勻，平衡至室溫。把PVDF膜放在潔凈的剪開的自封袋內(nèi)表面上。迅速加上顯影底物，孵育1-5分鐘,若肉眼可見明顯條帶，則終止孵育。棄掉顯影底物液體，把膜轉(zhuǎn)移至三面剪開的自封袋中，合上自封袋，用衛(wèi)生紙小心吸掉多余的液體，放入顯影暗匣，用絕緣膠帶固定。放上膠片，膠片曝光一定時間(5～30秒)后，依 次放入顯影液、定影液各20秒，然后把膠片放在清水中。最后在自來水下洗凈膠片，晾干，掃描至計算機，得到檢測結(jié)果。

顯影后的膜用1×TBST洗10分鐘后，可放入有抗體洗脫緩沖液的自封袋中，密封后放入50～60℃的水浴鍋中孵育30分鐘。再用1×TBST洗2次，每次10分鐘。洗完后用脫脂奶封閉即可重復(fù)上面的步驟檢測其它蛋白如內(nèi)參蛋白GAPDH。

Western Blot的結(jié)果如圖1所示，表明本發(fā)明用到的干擾RNA(Y2038)能顯著降低TSPAN8的蛋白水平。

經(jīng)實驗發(fā)現(xiàn)：siRNA2的干擾效果最好。shRNA2(Y 2038)的干擾效果最好。

上述的siRNA序列的shRNA序列，包括正義鏈和反義鏈，此shRNA序列為：

正義鏈：5’-CCGGGCAAUGACUCUCAAGCAACUCGAGUUGCUUGAGAGUCAUUGC-3’(SEQ ID NO.3)

反義鏈：5’-

AAUUCAAAAAAGCAAUGACUCUCAAGCAACUCGAGUUGCUUGAGAGUCAUUGC-3’(SEQ ID NO.4)

實施例4：MTT法檢測干擾TSPAN8后對U87和U251細(xì)胞系增殖的影響

膠質(zhì)瘤U87細(xì)胞系、膠質(zhì)瘤U251細(xì)胞系，購自中科院細(xì)胞所。

在直徑6cm培養(yǎng)皿中培養(yǎng)細(xì)胞至大約30％匯合度，分別加入對照慢病毒感染顆粒(標(biāo)記為Negative control組)和干擾TSPAN8的病毒感染顆粒(標(biāo)記為Y2038組，感染復(fù)數(shù)為10)，以未加入病毒的細(xì)胞培養(yǎng)為空白對照組(標(biāo)記為Blank組)，繼續(xù)培養(yǎng)細(xì)胞4天。后用96孔板(美國Corning公司生產(chǎn))培養(yǎng)，每孔約1500個細(xì)胞，每孔培養(yǎng)基150μl。分別在如圖3所示的 時間點，每孔加入15μl濃度為5mg/ml的MTT(上海生工生物工程公司生產(chǎn))繼續(xù)孵育4小時。然后吸掉培養(yǎng)物，每孔加入150μl DMSO，在酶標(biāo)儀(美國Bio-Rad公司生產(chǎn)，iMark168-1130型)的490nm波長下測定吸光度。

結(jié)果如圖2所示，表明干擾TSPAN8能明顯抑制U87、U251細(xì)胞的生長。

實施例5：Transwell法檢測干擾TSPAN8后對U87和U251細(xì)胞系侵襲的影響

Transwell侵襲實驗使用Matrigel Invasion Chamber(8μm，24-well cell culture inserts)(BD Biosience公司)。預(yù)先用無菌鑷子將侵襲小室夾持懸掛在24孔培養(yǎng)板上，室溫下放置30分鐘，使基質(zhì)膠凝固。在小室上方加入500μl無血清培養(yǎng)基，37℃孵育2小時，以水化基質(zhì)膠。消化細(xì)胞，通過細(xì)胞計數(shù)，用無血清培養(yǎng)基配置1x10⁵個細(xì)胞/ml的細(xì)胞懸液。吸去侵襲小室上方的無血清培養(yǎng)基，加入500μl血清培養(yǎng)基。培養(yǎng)22個小時后，用棉簽擦盡小室中膜正面的細(xì)胞，用甲醇固定膜背面的細(xì)胞15分鐘，再用0.5％結(jié)晶紫染色15分鐘。對于U87和U251細(xì)胞，在100x鏡下隨機拍攝9個視野；對于C6細(xì)胞，在200x鏡下隨機拍攝9個視野。得到9個視野中細(xì)胞數(shù)的平均值。

遷移實驗結(jié)果如圖3所示，表明干擾TSPAN8能明顯抑制U87和U251細(xì)胞侵襲結(jié)果。

實施例6：Transwell法檢測干擾TSPAN8后對U87和U251細(xì)胞系遷移的影響

Transwell侵襲遷移實驗使用孔徑8μm的24孔細(xì)胞培養(yǎng)池(BD Biosience公司)。與侵襲實驗的區(qū)別在于無基質(zhì)膠包被，無凝固和水化步驟。用無血清培養(yǎng)基配置5x10⁵個細(xì)胞/ml的細(xì)胞懸液，在小室上方加入100μl懸液，即5x10⁴個細(xì)胞，并在小室下方加入500μl血清培養(yǎng)基。培養(yǎng)4小時后結(jié)束實 驗。后續(xù)處理同Transwell侵襲實驗。實驗結(jié)果如圖4所示，表明干擾TSPAN8能明顯抑制U87和U251細(xì)胞的遷移。

上述實施例為本發(fā)明較佳的實施方式，但本發(fā)明的實施方式不受上述實施例的限制。其他任何不脫離本發(fā)明之精神和原理下所作的變形，均應(yīng)認(rèn)為是本發(fā)明的保護(hù)范圍。