本發(fā)明涉及一種基于人皮膚細胞的胰島素分泌細胞的誘導方法及應用，屬于分子細胞學技術技術領域。

背景技術：

糖尿病是一組由于胰島素分泌缺陷和/或胰島素作用障礙所導致的以高血糖為特征的代謝性疾病。持續(xù)高血糖與長期代謝紊亂等可導致全身組織器官，特別是眼、腎、心血管及神經系統(tǒng)的損害及其功能障礙，甚至衰竭。在糖尿病的治療過程中胰島素起到重要作用，尤其是對I型糖尿病患者。

目前，通過干細胞定向分化或者利用小分子藥物直接將成纖維細胞轉化為胰島素產生或者分泌細胞中時，在客觀上存在定向分化步驟繁瑣，誘導形成的細胞不具備胰島beta細胞的完全功能或者形成的細胞不夠單一，在形成的細胞中具備多種細胞的功能，例如同時產生胰島素，胰高血糖素等。現(xiàn)有技術中雖然存在將人體其他細胞或干細胞定向誘導為胰島素分泌細胞的報道，但尚無將人體皮膚細胞誘導為胰島素分泌細胞的報道。

技術實現(xiàn)要素：

為解決以上問題，本發(fā)明提供了一種基于人皮膚細胞的胰島素分泌細胞的誘導方法，所采取的技術方案如下：

本發(fā)明的目的在于提供一種基于人皮膚細胞的胰島素分泌細胞的誘導方法。該方法是將獲得的外源轉錄因子PDX1、Mafa、Ngn3、Hnf6和NeuroD1構建到慢病毒載體Psin上，再將病毒載體與包裝質粒一起轉染到病毒孵育細胞中培養(yǎng)，培養(yǎng)結束后再將病毒感染到人皮膚細胞中，培養(yǎng)后獲得胰島素分泌細胞。

所述方法的步驟如下：

1)通過克隆獲得外源轉錄因子PDX1、Mafa、Ngn3、Hnf6和NeuroD1；

2)將步驟1)所得的外源轉錄因子構建的慢病毒載體Psin上，獲得病毒載體；

3)將步驟2)所得的病毒載體與包裝質粒一起轉染到病毒孵育細胞中培養(yǎng)，培養(yǎng)結束后孵育病毒；

4)利用步驟3)所得的孵育病毒感染人皮膚細胞后進行培養(yǎng)，培養(yǎng)結束后獲得胰島素分泌細胞。

優(yōu)選地，步驟3)所述包裝質粒，是包裝質粒PMD2G和包裝質粒PSPAX2；所述病毒孵育細胞，是293T細胞；所述轉染，轉染比例是PMD2G：PSPAX2：293T＝2:2:1。

優(yōu)選地，步驟4)所述人皮膚細胞，是人皮膚成纖維細胞。

優(yōu)選地，步驟4)所述培養(yǎng)，是在感染后24h更換培養(yǎng)液，使用誘導培養(yǎng)基進行培養(yǎng)。

更優(yōu)選地，所述誘導培養(yǎng)基，是含有胰島素鐵硒傳遞蛋白ITS，10ng/ml EGF，10ng/ml bFGF的IMDM培養(yǎng)基。

所述方法的具體步驟如下：

1)克隆獲得外源轉錄因子PDX1、Mafa、Ngn3、Hnf6和NeuroD1；

2)將步驟1)所得的5個外源轉錄因子連接到慢病毒載體Psin上，獲得病毒載體；

3)以293T細胞為病毒孵育細胞，將步驟2)所得的病毒載體與包裝質粒PMD2G和PSPAX2按照PMD2G：PSPAX2：293T＝2:2:1的比例轉染到293T細胞中，培養(yǎng)后獲得孵育病毒；

4)將利用步驟3)所得的孵育病毒感染人皮膚成纖維細胞后培養(yǎng)24h，培養(yǎng)結束后更換培養(yǎng)液使用誘導培養(yǎng)基；所述誘導培養(yǎng)基，是含有胰島素鐵硒傳遞蛋白ITS，10ng/ml EGF，10ng/ml bFGF的IMDM培養(yǎng)基。

所述任一方法在胰島素分泌細胞的誘導培養(yǎng)過程中的應用也在本發(fā)明的保護范圍之內。

本發(fā)明獲得的有益效果如下：

本發(fā)明利用基因PDX1，Mafa，Ngn3作為組合核心，并在此基礎上分別加入基因Hnf6和NeuroD1，實現(xiàn)了選擇最少基因數(shù)目的組合來誘導人成纖維細胞產生胰島素。同時，本發(fā)明還成功使誘導獲得的細胞具備能夠響應葡萄糖的能力，能夠通過葡萄糖的濃度變化來調整胰島素的產生分泌。

另外，本發(fā)明首次確定了利用PDX1，Mafa，Ngn3，Hnf6與NeuroD15個轉錄因子能夠有效的將人成纖維細胞誘導分化為具備完全功能的胰島beta細胞，并且誘導形成的細胞在體內不會成瘤，只具備單一分泌胰島素的能力，在體內能夠有效的降低血糖的水平。

附圖說明

圖1為實施例2電泳檢測圖。

圖2為實施例2細胞熒光檢測圖。

圖3為實施例3RT-PCR檢測圖。

圖4為實施例3細胞免疫熒光檢測圖。

圖5為不同葡萄糖濃度對胰島素水平的影響。

具體實施方式

下面結合具體實施例對本發(fā)明做進一步說明，但本發(fā)明不受實施例的限制。

以下實施例所用試劑、材料、儀器和方法，未經特殊聲明，均為本技術領域中常規(guī)試劑、材料、儀器和方法，均可以通過商業(yè)渠道獲得。

生物及細胞樣品：NOD-SCID小鼠，細胞樣品為人包皮成纖維細胞以及誘導形成的胰島beta細胞。

培養(yǎng)基：IMDM培養(yǎng)基。

實施例1外源轉錄因子感染人包皮成纖維細胞胰島素分泌細胞的誘導

在本實施例中，發(fā)明人將基因首先構建到慢病毒載體Psin上，與PMD2G和PSPAX2包裝質粒在293T細胞中進行轉染，轉染比例為2:2:1。在轉染病毒48小時后，收集病毒。將病毒感染到人成纖維細胞中，24小時后進行換液。在細胞感染病毒2天后，使用特定的培養(yǎng)基進行培養(yǎng)(IMDM+1×ITS+10ng/ml EGF+10ng/ml bFGF)。

實施例2胰島素分泌測定

RT-PCR實驗：在病毒感染人成纖維細胞20天時，收集細胞利用Trizol進行裂解，抽提RNA，利用逆轉錄試劑盒對RNA進行逆轉錄，利用PCR的方式對相關基因進行PCR，通過電泳檢測，觀察相關基因表達水平。如圖1所示。

細胞免疫熒光：在病毒感染人成纖維細胞20天時，使用4％多聚甲醛(PFA)固定細胞10分鐘，Triton-100穿孔處理15分鐘，2％BSA封閉孵育1小時，一抗(緩沖液為2％BSA)孵育2小時，ALEXA-二抗(帶有熒光的二抗)孵育1小時后封片。在熒光顯微鏡下觀察胰島素的產生情況，如圖2所示。

實施例3細胞葡萄糖響應實驗

RT-PCR實驗步驟如實施2，結果如圖3所示。

細胞免疫熒光實驗步驟如實施2，結果如圖4所示。

胰島素體外分泌實驗：培養(yǎng)的細胞首先用KRB緩沖液進行多次洗滌。然后預孵育含有2mM葡萄糖的KRB緩沖液2小時除去殘留在培養(yǎng)基中的胰島素。細胞再次用KRB緩沖液洗2次，然后用含有2mM葡萄糖的KRB緩沖液孵育30min，收集上清。然后細胞再次用KRB緩沖液洗2次，然后用含有20mM葡萄糖的KRB緩沖液孵育30min，收集上清。細胞用BCA法進行蛋白標準定量；用人胰島素檢測試劑盒檢測2mM葡萄糖以及20mM葡萄糖下細胞釋放胰島素的水平。結果如圖5所示。

實施例4小鼠降血糖實驗

在對5因子誘導形成的細胞進行克隆篩選，并且進行擴大培養(yǎng)。用1％的巴比妥對NOD-SCID小鼠(該小鼠被STZ處理過，成為糖尿病小鼠)進行麻醉后，在其腰腹處進行剃 毛處理，然后用70％的酒精進行擦拭，這樣能夠更加方便看到小鼠腎所在的位置。在小鼠腎所在位置剪開一個大約1-2cm的傷口，然后剪開肌肉層，找到腎臟后，通過擠壓的方式，使腎臟從傷口處出來。用無菌的PBS對腎臟進行潤濕，防止腎臟過于干涸。然后利用注射器的針頭輕輕的在腎臟上劃出一個開口，輕輕的將注射針頭推進腎囊中，然后慢慢注射細胞。每個腎臟注射50萬的細胞量。注射完畢后，縫合肌肉層與表皮，放在37℃恒溫器上，加快小鼠的蘇醒。每隔相應的時間取小鼠尾靜脈血檢測血糖水平。實驗結果發(fā)現(xiàn)注射了5因子誘導的細胞后，能夠有效的降低糖尿病小鼠中的血糖水平。

雖然本發(fā)明已以較佳的實施例公開如上，但其并非用以限定本發(fā)明，任何熟悉此技術的人，在不脫離本發(fā)明的精神和范圍內，都可以做各種改動和修飾，因此本發(fā)明的保護范圍應該以權利要求書所界定的為準。