本案涉及一種核酸萃取方法，特別涉及一種利用殼聚糖涂布材料進行萃取的核酸萃取方法。

背景技術(shù)：

隨著科技進步及交通工具便利性，傳染性疾病的傳播速率也被加速，如SARS、禽流感、登革熱等疾病的傳染，是現(xiàn)今全球所需面對的挑戰(zhàn)。因而，提出有效的防治策略，快速的進行疑似病例的檢測與確認，進行早期隔離或確認治療的方式，是現(xiàn)在檢測醫(yī)學(xué)所努力的目標，故研發(fā)傳染性疾病的“即時就地檢測手段”，是相當(dāng)重要的議題。目前多使用快篩免疫學(xué)，雖然能在30分鐘內(nèi)進行初步篩檢，但其準確度僅有30％-60％，且僅適用于少數(shù)傳染性疾病，因此有其限制性。若采以分子檢測方法，能夠提供高準確度的檢測分析，但就目前技術(shù)上，因受限于(a)多種大型昂貴機臺需求；(b)專業(yè)人員操作復(fù)雜程序，此種技術(shù)僅能在少部分大型的研發(fā)中心與臨床分析實驗室能夠進行檢測。

“晶片實驗室”則是近年來被提出的新穎性概念，提出將不同檢測儀器設(shè)備微型化于同一平臺，達到現(xiàn)今所提出“即時就地照護(Point of Care,POC)”與“體外診斷(In Vitro Diagnostics,IVD)”的目標，其精髓便是建構(gòu)“體積小”、“準確性高”、及“即時診斷”的醫(yī)療檢測平臺。

而在核酸萃取方法上，由于公知技術(shù)多利用離液鹽(chaotropic salt)，例如鹽酸胍(guanidium hydrochloride,GuHCl)，以使DNA結(jié)合在離心管柱(spin column)的二氧化硅膜(silica membrane)上，并利用高速離心將GuHCl及乙醇或異丙醇等會影響后續(xù)DNA分析應(yīng)用的抑制劑去除。然而，在晶片微流體系統(tǒng)中，這些抑制劑的存在將會產(chǎn)生很大的問題，例如會影響PCR反應(yīng)。另一方面，公知技術(shù)亦有采用殼聚糖涂布材料的核酸萃取方法，然而其最大容量僅達150ng的DNA，萃取回收率不佳。

因此，本案發(fā)明人乃提供一種改良的核酸萃取方法，并可整合到可攜式自動化核酸檢測平臺，以期建構(gòu)可自動化進行樣品DNA萃取與純化，及后續(xù)DNA增幅與即時檢測的可攜式生物晶片。

技術(shù)實現(xiàn)要素：

本案的目的在于提供一種改良的核酸萃取方法，其避免使用公知技術(shù)所采用的離液鹽及乙醇或異丙醇等抑制劑，并提升萃取回收率。

本案的另一目的在于提供一種改良的核酸萃取方法，其可整合到可攜式自動化核酸檢測平臺，以期建構(gòu)可自動化進行樣品DNA萃取與純化，及后續(xù)DNA增幅與即時檢測的可攜式生物晶片。

為達上述目的，本案的一較佳實施方式為提供一種核酸萃取方法，包含下列步驟：(a)將一樣本與一裂解緩沖液混合，其中該裂解緩沖液的pH值小于7；(b)將該樣本與該裂解緩沖液的混合液移至包含殼聚糖涂布材料的一核酸抓取槽體，以使該樣本中的核酸與該殼聚糖涂布材料結(jié)合；(c)以一清洗緩沖液清洗該殼聚糖涂布材料，以移除殘留的蛋白質(zhì)及細胞殘渣；以及(d)以一沖提緩沖液沖提該殼聚糖涂布材料并同時對該殼聚糖涂布材料進行加熱，使得該核酸與該殼聚糖涂布材料分離，其中該沖提緩沖液的pH值大于7。

在一實施例中，該步驟(c)又包含步驟：(c1)以一第一清洗緩沖液清洗該殼聚糖涂布材料，其中該第一清洗緩沖液的pH值小于7；以及(c2)以一第二清洗緩沖液清洗該殼聚糖涂布材料，其中該第二清洗緩沖液的pH值大于7。

在一實施例中，該第一清洗緩沖液的pH值介于4-7之間，且該第二清洗緩沖液的pH值介于7-11之間。

在一實施例中，該第一清洗緩沖液包含三羥甲基氨基甲烷(Tris)、雙(2-羥乙基)氨基(三羥甲基)甲烷(Bis-Tris)、1,3-雙(三羥甲基甲氨基)丙烷(Bis-Tris Propane)及3-嗎啉丙磺酸(MOPS)。

在一實施例中，該第二清洗緩沖液包含2-氨基-2-甲基-1-丙醇(AMP)、三羥甲基氨基甲烷(Tris)、N,N-二羥乙基甘氨酸(BICINE)及4-羥乙基哌嗪乙磺酸(HEPES)。

在一實施例中，該步驟(c1)重復(fù)一次。

在一實施例中，該裂解緩沖液的pH值介于4-7之間。

在一實施例中，該裂解緩沖液包含三羥甲基氨基甲烷(Tris)、雙(2-羥乙基)氨基(三羥甲基)甲烷(Bis-Tris)、1,3-雙(三羥甲基甲氨基)丙烷(Bis-Tris Propane)及3-嗎啉丙磺酸(MOPS)。

在一實施例中，該裂解緩沖液包含可將細胞裂解的清潔劑。

在一實施例中，該沖提緩沖液的pH值介于7-11之間。

在一實施例中，該沖提緩沖液包含2-氨基-2-甲基-1-丙醇(AMP)、三羥甲基氨基甲烷(Tris)、N,N-二羥乙基甘氨酸(BICINE)及4-羥乙基哌嗪乙磺酸(HEPES)。

在一實施例中，該步驟(d)的加熱溫度35-65℃。

在一實施例中，該核酸抓取槽體的底部具有一加熱板件，以對該殼聚糖涂布材料進行加熱。

在一實施例中，該核酸萃取方法整合至一生物晶片卡夾。

在一實施例中，該生物晶片卡夾包含一樣本存放槽體、至少一清洗液存放槽體、一沖提液存放槽體、該核酸抓取槽體及一廢液槽體。

本案的核酸萃取方法，可避免公知技術(shù)因采用離液鹽及乙醇或異丙醇等抑制劑而影響后續(xù)DNA分析應(yīng)用的缺點，且通過利用pH值大于7的第二清洗緩沖液進行清洗，并在沖提步驟進行加熱，可提升沖提效率，使本案的核酸萃取方法可萃取出更高產(chǎn)量及純度的核酸。

附圖說明

圖1為本案核酸萃取方法的流體配置示意圖。

圖2為本案生物晶片卡夾的爆炸圖。

圖3為本案生物晶片卡夾的組合圖。

圖4為本案生物晶片卡夾的上視圖。

圖5為本案核酸萃取方法的流程圖。

圖6A及圖6B顯示利用本案的核酸萃取方法實際進行DNA萃取的結(jié)果分析。

圖7顯示利用本案的核酸萃取方法進行人類細胞DNA萃取的結(jié)果分析。

其中，附圖標記說明如下：

11：樣本存放槽體

12：第一清洗緩沖液存放槽體

121：第一清洗緩沖液存放子槽體

122：第一清洗緩沖液存放子槽體

13：第二清洗緩沖液存放槽體

14：沖提緩沖液存放槽體

15：核酸抓取槽體

150：殼聚糖涂布材料

16：廢液槽體

17：核酸收集槽體

2：生物晶片卡夾

21：上板件

22：卡夾上部

23：軟硅膠部

24：卡夾下部

25：下板件

26：加熱板件

S51：步驟S51

S52：步驟S52

S53：步驟S53

S54：步驟S54

具體實施方式

體現(xiàn)本案特征與優(yōu)點的一些典型實施例將在后段的說明中詳細敘述。應(yīng)理解的是本案能夠在不同的方式上具有各種的變化，然其皆不脫離本案的范圍，且其中的說明及附圖在本質(zhì)上當(dāng)作說明之用，而非用以限制本案。

本發(fā)明提供一種核酸萃取方法，主要利用殼聚糖涂布材料(chitosan coating material)在酸性環(huán)境下與DNA結(jié)合，并于堿性環(huán)境下進行沖提，而將樣本中的DNA萃取出來。由于不需使用傳統(tǒng)萃取方法所采用的鹽酸胍(guanidium hydrochloride)、乙醇(ethanol)、及異丙醇(isopropanol)等，故沒有抑制性化學(xué)物質(zhì)存在于緩沖系統(tǒng)中，因此可提升高純度核酸的萃取產(chǎn)量，也 不會影響后續(xù)DNA的分析應(yīng)用。

在本發(fā)明的萃取方法中，核酸主要是在低PH及具有高離子強度的裂解緩沖液(lysis buffer)中與殼聚糖結(jié)合，而緩沖系統(tǒng)中的高離子強度有助于殼聚糖的質(zhì)子化(protonation)，亦即質(zhì)子會轉(zhuǎn)移至殼聚糖的葡萄糖胺鏈(glucosamine chain)上而使殼聚糖帶正電，故會增加殼聚糖與帶負電的核酸之間的親和力，使得核酸容易結(jié)合到殼聚糖上。不同于裂解緩沖液，沖提緩沖液(elution buffer)則為高PH且具有低離子強度，以消除殼聚糖的葡萄糖胺鏈的質(zhì)子化現(xiàn)象，一旦殼聚糖恢復(fù)不帶電的中性狀態(tài)，核酸即會被釋放至沖提緩沖液中。

請參閱圖1，其為本案核酸萃取方法的流體配置示意圖。本案的核酸萃取方法將整合至一生物晶片卡夾(biochip cartridge)，以進行核酸的自動化萃取。如圖1所示，本案的核酸萃取晶片上包含樣本存放槽體11、第一清洗緩沖液存放槽體12、第二清洗緩沖液存放槽體13、沖提緩沖液存放槽體14、核酸抓取槽體15、廢液槽體16、及核酸收集槽體17。

樣本存放槽體11存放樣本(sample)及裂解緩沖液(lysis buffer)，其中樣本可為血液、尿液、汗液、唾液或自棉棒刮下的檢體，且樣本體積約為20-50μl。裂解緩沖液的pH值小于7，例如pH值介于4-7之間，且包含三羥甲基氨基甲烷(Tris)、雙(2-羥乙基)氨基(三羥甲基)甲烷(Bis-Tris)、1,3-雙(三羥甲基甲氨基)丙烷(Bis-Tris Propane)及3-嗎啉丙磺酸(MOPS)等溶液，但不以此為限。裂解緩沖液包含可將細胞裂解的清潔劑，例如但不限于Tween-20、Tween-80、CHAPS、NP-40、Igepal CA-630等，且可選擇性包含鹽類，例如但不限于NaCl、KCl、NaF、CaCl₂、MgCl₂等。在一實施例中，裂解緩沖液的pH值介于4-6之間，較佳為5，且所使用的裂解緩沖液體積約為150μl，但不以此為限。

第一清洗緩沖液存放槽體12存放第一清洗緩沖液(wash buffer 1)，其pH值小于7，例如pH值介于4-7之間，且包含三羥甲基氨基甲烷(Tris)、雙(2-羥乙基)氨基(三羥甲基)甲烷(Bis-Tris)、1,3-雙(三羥甲基甲氨基)丙烷(Bis-Tris Propane)及3-嗎啉丙磺酸(MOPS)等溶液，但不以此為限。第一清洗緩沖液的pH值利用HCl進行調(diào)整，在一實施例中，第一清洗緩沖液的pH值介于4-6之間，較佳為5，且每一槽體中所使用的第一清洗緩沖液體積約為380μl， 但不以此為限。

第二清洗緩沖液存放槽體13存放第二清洗緩沖液(wash buffer 2)，其pH值大于7，例如pH值介于7-11之間，且包含2-氨基-2-甲基-1-丙醇(AMP)、三羥甲基氨基甲烷(Tris)、N,N-二羥乙基甘氨酸(BICINE)及4-羥乙基哌嗪乙磺酸(HEPES)等溶液，但不以此為限。第二清洗緩沖液的pH值利用NaOH或KOH進行調(diào)整，在一實施例中，第二清洗緩沖液的pH值介于9-11之間，較佳為10，且所使用的第二清洗緩沖液體積約為200μl，但不以此為限。

沖提緩沖液存放槽體14存放沖提緩沖液(elution buffer)，其pH值大于7，例如pH值介于7-11之間，且包含2-氨基-2-甲基-1-丙醇(AMP)、三羥甲基氨基甲烷(Tris)、N,N-二羥乙基甘氨酸(BICINE)及4-羥乙基哌嗪乙磺酸(HEPES)等溶液，但不以此為限。沖提緩沖液的pH值利用NaOH或KOH進行調(diào)整，在一實施例中，沖提緩沖液的pH值介于9-11之間，較佳為9.5，且所使用的沖提緩沖液體積約為150μl，但不以此為限。沖提緩沖液亦可選擇性包含鹽類，例如但不限于NaCl、KCl、NaF等。

核酸抓取槽體15存放殼聚糖涂布材料(chitosan coating materail)150，用以與核酸結(jié)合，以萃取出樣本中的核酸。在一實施例中，殼聚糖涂布材料可為殼聚糖珠(chitosan bead)或殼聚糖膜(chitosan membrane)，但不以此為限。本案的殼聚糖涂布材料可在室溫至56℃下穩(wěn)定存放至少三個月。另外，廢液槽體16用來收集萃取過程中的廢液，核酸收集槽體17則用來收集萃取出來的純化核酸。

每一槽體經(jīng)由槽體的氣動開口(pneumatic port)而與壓電式微型泵浦(piezoelectric micropump)連接，以提供氣體壓力源，并由電磁閥(electromagnetic valve)控制氣體輸入生物晶片卡夾各槽體的開關(guān)，以驅(qū)動流體在生物晶片卡夾的槽體間流動。由于壓電式微型泵浦及電磁閥是微流體晶片所常用，故在此不贅述。

請參閱圖2及圖3，其分別為本案生物晶片卡夾的爆炸圖及組合圖。如圖所示，生物晶片卡夾2包含由上而下依序組裝的上板件21、卡夾上部22、軟硅膠部23、卡夾下部24、下板件25及加熱板件26。上板件21會與卡夾上部22黏合，而下板件25會與卡夾下部24黏合，以使管道密封。卡夾上部22、軟硅膠部23及卡夾下部24在組合時會相互卡緊，以使每個相對應(yīng)的 孔洞具有足夠的氣密性。其中，軟硅膠部23的背側(cè)具有凸環(huán)干涉設(shè)計(未圖示)，用以增加卡夾上部22及卡夾下部24結(jié)合后的每個槽體氣密性。

卡夾下部24包含樣本存放槽體11、第一清洗液存放槽體12、第二清洗液存放槽體13、沖提液存放槽體14、核酸抓取槽體15及廢液槽體16，且此等槽體開口于卡夾上部22。另外，核酸收集槽體17則可以外接管件方式(未圖示)連接于卡夾上部22的核酸收集槽體17開口下方，以利直接取用所收集到的核酸進行下一步的放大增幅或分析檢測。在一實施例中，外接管件可為離心管(eppendorf tube)，但不以此為限。

此外，在下板件25對應(yīng)核酸抓取槽體15位置上更設(shè)有一加熱板件26，其可對核酸抓取槽體15進行加熱。

圖4為本案生物晶片卡夾的上視圖，其中上板件已被移除。在本實施例中，因單一槽體容量考量，第一清洗液存放槽體12又包含兩個第一清洗液存放子槽體121、122。當(dāng)然，兩個第一清洗液存放子槽體121、122的存在必非必要，亦可放大單一槽體容量或通過連續(xù)供液方式來達成同樣清洗效果。以下將配合圖4及圖5說明本案的核酸萃取方法，其中圖5為本案核酸萃取方法的流程圖。

首先，將樣本與裂解緩沖液混合，其中裂解緩沖液的pH值小于7(步驟S51)。樣本與裂解緩沖液充分混合后移至樣本存放槽體11中靜置一段時間，以使細胞裂解并釋出核酸。接著，將樣本與裂解緩沖液的混合液移至包含殼聚糖涂布材料的核酸抓取槽體15，以使樣本中的核酸與殼聚糖涂布材料結(jié)合(步驟S52)。此步驟施加正壓于樣本存放槽體11，以將樣本與裂解緩沖液的混合液自樣本存放槽體11推進至核酸抓取槽體15。經(jīng)一段反應(yīng)時間(例如但不限于20-200秒)，待核酸與殼聚糖涂布材料結(jié)合后，再施加正壓于樣本存放槽體11同時施加負壓于廢液槽體16，以使廢液流至廢液槽體16。

之后，以清洗緩沖液清洗殼聚糖涂布材料，以移除殘留的蛋白質(zhì)及細胞殘渣(步驟S53)。此步驟又可分為兩個子步驟，包括以第一清洗緩沖液清洗殼聚糖涂布材料，其中第一清洗緩沖液的pH值小于7(步驟S531)，以及以第二清洗緩沖液清洗殼聚糖涂布材料，其中第二清洗緩沖液的pH值大于7(步驟S532)。

步驟S531施加正壓于第一清洗緩沖液存放子槽體121一段時間(例如但 不限于2-60秒)，以將第一清洗緩沖液自第一清洗緩沖液存放子槽體121推進至核酸抓取槽體15。接著再施加正壓于第一清洗緩沖液存放子槽體121同時施加負壓于廢液槽體16一段時間(例如但不限于2-60秒)，以使液體自第一清洗緩沖液存放子槽體121經(jīng)核酸抓取槽體15連續(xù)流動至廢液槽體16，藉此移除殘留的蛋白質(zhì)及細胞殘渣。

為使清洗更完全，上述步驟S531可再重復(fù)一次，其利用第一清洗緩沖液存放子槽體122中存放的第一清洗緩沖液再次清洗。亦即，先施加正壓于第一清洗緩沖液存放子槽體122一段時間(例如但不限于2-60秒)，以將第一清洗緩沖液自第一清洗緩沖液存放子槽體122推進至核酸抓取槽體15。接著再施加正壓于第一清洗緩沖液存放子槽體122同時施加負壓于廢液槽體16一段時間(例如但不限于2-60秒)，以使液體自第一清洗緩沖液存放子槽體122經(jīng)核酸抓取槽體15連續(xù)流動至廢液槽體16，藉此移除殘留的蛋白質(zhì)及細胞殘渣。

接著進行步驟S532，以第二清洗緩沖液清洗殼聚糖涂布材料，其中第二清洗緩沖液的pH值大于7。此步驟施加正壓于第二清洗緩沖液存放槽體13同時施加負壓于廢液槽體16，以使液體自第二清洗緩沖液存放槽體13經(jīng)核酸抓取槽體15連續(xù)流動至廢液槽體16，除可移除殘留的蛋白質(zhì)及細胞殘渣外，由于第二清洗緩沖液的pH值大于7，將可使核酸抓取槽體15的pH值提升至接近7。

之后，以沖提緩沖液沖提殼聚糖涂布材料并同時對殼聚糖涂布材料進行加熱，使得核酸與殼聚糖涂布材料分離，其中沖提緩沖液的pH值大于7(步驟S54)。此步驟施加正壓于沖提緩沖液存放槽體14，以將沖提緩沖液自沖提緩沖液存放槽體14推進至核酸抓取槽體15，并等待約5-15分鐘，在此同時，核酸抓取槽體15底部的加熱板件26會進行加熱，使核酸抓取槽體15內(nèi)的殼聚糖涂布材料的溫度提升至35-65℃，例如45-55℃，且較佳為50℃，使得核酸與殼聚糖涂布材料分離。接著再施加正壓于沖提緩沖液存放槽體14同時施加負壓于核酸收集槽體17，以使包含純化核酸的沖提緩沖液流至核酸收集槽體17。

在本案實驗設(shè)計中，第二清洗緩沖液可先使核酸抓取槽體15的pH值提升至接近7，以避免在沖提步驟還須中和pH值而導(dǎo)致沖提效率不佳。再者， 本案于沖提步驟時同時進行加熱，亦可提升沖提效率，使本案核酸萃取方法的沖提效率大幅提升，可萃取出更高產(chǎn)量及純度的核酸。

當(dāng)然，上述各步驟的反應(yīng)時間、體積、pH值等可根據(jù)實驗設(shè)計及測試而有不同實施方式，而不受限于上述的實施方式。

圖6A及圖6B顯示利用本案的核酸萃取方法實際進行DNA萃取的結(jié)果分析。如圖6A所示，將3000ng的大鼠基因體DNA(rat genomic DNA)利用本案的核酸萃取方法進行萃取，可看出本案的核酸萃取方法的萃取回收率約為40％。另外，代表核酸及蛋白質(zhì)比值的260/280比值及代表核酸及有機物質(zhì)比值的260/230比值若介于1.8-2.0之間，表示萃取核酸的純度及品質(zhì)相當(dāng)優(yōu)良。由圖6A結(jié)果亦可看出，利用本案的核酸萃取方法所萃取而得的DNA其260/280比值及260/230比值皆介于或靠近1.8-2.0，顯示本案方法可萃取出純度及品質(zhì)相當(dāng)優(yōu)良的核酸。

圖6B則觀察本案核酸萃取方法的線性效果。將90-12000ng的大鼠基因體DNA利用本案的核酸萃取方法進行萃取，并進一步利用NanoDrop超微量分光光度計及qPCR進行定量分析，結(jié)果顯示具有3000ng以下的DNA樣本的萃取率同樣接近40％，呈現(xiàn)相當(dāng)好的線性效果。然而具有6000ng DNA樣本的萃取率為30.44％，而具有12000ng DNA樣本的萃取率則僅有20.54％，推測是因為已經(jīng)超過殼聚糖涂布材料的最大容量，且殼聚糖涂布材料的最大容量應(yīng)介于3000-6000ng之間。另一方面，本案的核酸萃取方法亦可萃取具有90ng甚至以下的DNA樣本，顯示本案的核酸萃取方法可進行微量萃取及檢測。換言之，本案的核酸萃取方法可對具有90-6000ng的DNA樣本進行核酸萃取，顯示本案的核酸萃取方法能夠用于核酸萃取的范圍量是很廣的。

圖7顯示利用本案的核酸萃取方法進行人類細胞DNA萃取的結(jié)果分析。將人類細胞(HCT116 cell line)分別利用本案的殼聚糖涂布材料萃取方法及市售的spin column萃取套組進行萃取，并利用qPCR進行定量分析。由實驗結(jié)果可知，雖然萃取率低于市售的spin column萃取套組，但本案的殼聚糖涂布材料萃取方法確實可從人類細胞中萃取出DNA。

根據(jù)上述實驗結(jié)果可知，本案的殼聚糖涂布材料萃取方法可有效萃取出樣本中的核酸，萃取率達40％，且可萃取的最大容量達3000ng，相較于公知的殼聚糖涂布材料萃取方法所能萃取的最大容量高出許多，且具有良好的 線性關(guān)系，可用來做定量分析，亦可進行微量萃取及檢測。

綜上所述，本案提供一種改良的核酸萃取方法，其利用殼聚糖涂布材料進行萃取，可避免公知技術(shù)因采用離液鹽及乙醇或異丙醇等抑制劑而影響后續(xù)DNA分析應(yīng)用的缺點，且通過利用pH值大于7的第二清洗緩沖液進行清洗，并在沖提步驟進行加熱，可提升沖提效率，使本案的核酸萃取方法可萃取出更高產(chǎn)量及純度的核酸。再者，本案的核酸萃取方法可整合至生物晶片卡夾，并利用微流體控制技術(shù)，達成可自動化進行樣品DNA萃取與純化，及后續(xù)DNA增幅與即時檢測。因此，本案技術(shù)預(yù)期將可廣泛應(yīng)用于快速臨床診斷及準確篩檢，深具商品化的潛力，且可改善現(xiàn)今傳染性疾病診斷的缺陷，提供即時就地檢測的目標，造就全體人類福祉的愿景。因此，本案極具產(chǎn)業(yè)價值，爰依法提出申請。

本案得由本領(lǐng)域技術(shù)人員任施匠思而為諸般修飾，然皆不脫如附權(quán)利要求所欲保護者。