本發(fā)明屬于生物醫(yī)學(xué)技術(shù)領(lǐng)域，具體的說(shuō)是一種青環(huán)海蛇(Hydrophis cyanocinctus)抗菌肽QHA改造體抗菌肽HC14及其制備方法和應(yīng)用。
背景技術(shù)：
近年來(lái)傳統(tǒng)抗生素的大規(guī)模濫用導(dǎo)致越來(lái)越嚴(yán)重的病原微生物耐藥問(wèn)題，給人類健康帶來(lái)巨大的威脅。臨床上應(yīng)對(duì)耐藥微生物感染的措施是使用對(duì)耐藥微生物尚未使用過(guò)的新的或者替代性的抗生素，因此這就需要持續(xù)開(kāi)發(fā)新的抗微生物藥物。
抗菌肽是生物體基因編碼的一種天然小分子多肽，是生物體免疫系統(tǒng)的一種重要分子，對(duì)細(xì)菌、真菌、病毒甚至原蟲(chóng)均具有直接的殺滅作用。抗菌肽具有分子量小、結(jié)構(gòu)簡(jiǎn)單、抗菌活性強(qiáng)、殺菌機(jī)制獨(dú)特、毒性低和不易引起耐藥性等優(yōu)點(diǎn)，因此自發(fā)現(xiàn)之日起就被認(rèn)為是具有極大開(kāi)發(fā)潛力的新一代抗生素。到目前為止，已從不同生物體中發(fā)現(xiàn)超過(guò)1500多種不同的抗菌肽，而且其數(shù)目還在增加。
雖然抗菌肽數(shù)量增加，但活性好且穩(wěn)定性高的抗菌肽數(shù)量并不多，以天然抗菌肽為模板進(jìn)行改造，是發(fā)現(xiàn)新型理想抗菌肽最為快速高效的方法?？咕牡母脑炜梢詮陌被犴樞?、替換、增減、構(gòu)型等改變方式入手，對(duì)于合成抗菌肽而言，序列短、活性強(qiáng)、穩(wěn)定性高、毒性低是抗菌肽改造的最終目的。
抗菌肽藥物研究多數(shù)應(yīng)用于局部用藥，尤其是皮膚感染藥物研究。目前皮膚常見(jiàn)感染菌株已經(jīng)出現(xiàn)了嚴(yán)重的耐藥性，如對(duì)銅綠色假單孢菌有活性的抗菌素,包括氧哌嗪青霉素、頭孢他定、頭孢哌酮、頭孢吡圬和碳青霉烯類等抗生素出現(xiàn)了顯著耐藥，如對(duì)金黃色葡萄球菌比較敏感的抗生素只有萬(wàn)古霉素和利福平效果較好。國(guó)外很多公司在開(kāi)發(fā)抗菌肽新藥以解決越來(lái)越嚴(yán)重的抗生素耐藥性問(wèn)題，抗菌肽藥物由于其獨(dú)特的殺菌機(jī)理和廣譜的抗菌消炎活性，在未來(lái)市場(chǎng)具有非常大的發(fā)展空間。
技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：
本發(fā)明的目的在于提供一種青環(huán)海蛇(Hydrophis cyanocinctus)抗菌肽QHA改造體抗菌肽HC14及其制備方法和應(yīng)用。
改造體抗菌肽為青環(huán)海蛇(Hydrophis cyanocinctus)抗菌肽QHA改造體HC14，其是直鏈多肽，含有16個(gè)氨基酸殘基，其C末端酰胺化，分子量2022.58Da，等電點(diǎn)12.31。
所述改造體抗菌肽氨基酸序列為：Phe1Phe2Lys3Arg4Leu5Leu6Lys7Ser8Val9Arg10Arg11Ala12Val13Lys14Lys15Phe16-NH2。
改造體抗菌肽的應(yīng)用，所述改造體抗菌肽用于制備抗菌藥物、防感染藥物、防腐劑、動(dòng)物飼料或化妝品前體的用途。
本發(fā)明的有益效果在于：本發(fā)明根據(jù)青環(huán)海蛇抗菌肽QHA的氨基酸序列，利用分子改造方法設(shè)計(jì)改造體HC3-5，該改造體具有廣譜高效的抗菌活性，此外具有分子量小、結(jié)構(gòu)簡(jiǎn)單、溶血活性低、制備方法簡(jiǎn)單、穩(wěn)定性高等有益特點(diǎn)。
具體實(shí)施方式:
下面用實(shí)施例來(lái)進(jìn)一步說(shuō)明本發(fā)明的實(shí)質(zhì)性內(nèi)容，但本發(fā)明的內(nèi)容并不局限于此。
實(shí)施例1
海蛇改造體抗菌肽HC14的化學(xué)合成
青環(huán)海蛇抗菌肽QHA是基因編碼的一種直鏈多肽，含有30個(gè)氨基酸殘基，分子量3628.5Da，等電點(diǎn)12.61。青環(huán)海蛇抗菌肽QHA全序列為：Lys1Phe2Phe3Lys4Arg5Leu6Leu7Lys8Ser9Val10Arg11Arg12Ala13Val14Lys15Lys16Phe17Arg18Lys19Lys20Pro21Arg22Leu23Ile24Gly25Leu26Ser27Thr28Leu29Leu30。根據(jù)青環(huán)海蛇抗菌肽QHA的氨基酸序列，利用分子改造方法設(shè)計(jì)獲得了改造體HC14，并利用多肽固相合成的方法對(duì)其進(jìn)行了化學(xué)合成，具體制備方法如下：
Ⅰ、HC14的制備方法：根據(jù)上述HC14的氨基酸序列，用自動(dòng)多肽合成儀(433A,Applied Biosystems)合成其全序列，利用HPLC反相柱層析脫鹽。
Ⅱ、分子量測(cè)定采用基質(zhì)輔助激光解析電離飛行時(shí)間質(zhì)譜(MALDI-TOF)。
Ⅲ、純化的HC14用高效液相色譜HPLC方法鑒定其純度，分子量測(cè)定采用基質(zhì)輔助激光解析電離飛行時(shí)間質(zhì)譜(MALDI-TOF)，等電聚焦電泳測(cè)定等電點(diǎn)，用自動(dòng)氨基酸測(cè)序儀測(cè)定氨基酸序列結(jié)構(gòu)。
測(cè)定結(jié)果為：
HC14是青環(huán)海蛇抗菌肽QHA的一種改造體。HC14是一種直鏈多肽，含有16個(gè)氨基酸殘基，其C末端酰胺化，分子量2022.58Da，等電點(diǎn)12.31。HC14全序列為：Phe1Phe2Lys3Arg4Leu5Leu6Lys7Ser8Val9Arg10Arg11Ala12Val13Lys14Lys15Phe16-NH2。
實(shí)施例2
HC14藥理實(shí)驗(yàn)：
1.HC14抗菌活性測(cè)定：
(1)分別挑取保存于斜面上的試驗(yàn)菌株均勻涂布于MH固體培養(yǎng)基(購(gòu)自青島海博生物技術(shù) 有限公司)平板上，將經(jīng)過(guò)滅菌的0.5cm直徑的濾紙片置于培養(yǎng)基表面，滴加溶解于滅菌去離子水的2mg/ml的抗菌肽HC14樣品溶液10μl，于37℃倒置培養(yǎng)18－20小時(shí)，觀察抑菌圈形成與否。若樣品具有抗菌活性，則會(huì)在濾紙片周圍形成清晰透明的抑菌圈，抑菌圈越大表明樣品抗菌活性越強(qiáng)。
(2)抗菌肽HC14最小抑菌濃度(Minimum Inhibitory Concentration)測(cè)定(2倍稀釋法)：
選擇上步實(shí)驗(yàn)中具有抑菌圈的菌株進(jìn)行MIC測(cè)定實(shí)驗(yàn)。試驗(yàn)菌株接種到MH液體培養(yǎng)基(青島海博生物技術(shù)有限公司)中，37℃振蕩培養(yǎng)到對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期，而后用新鮮MH液體培養(yǎng)基將培養(yǎng)至對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的培養(yǎng)液稀釋到2×105cfu/ml待用。
在無(wú)菌96孔板各孔中預(yù)先加入100μl MH液體培養(yǎng)基，然后在第一孔中加入100μl用MH液體培養(yǎng)基稀釋到一定濃度的經(jīng)0.22μm孔濾膜過(guò)濾的的抗菌肽HC14樣品溶液，混勻后取100μl加入第2孔，依次倍比稀釋(參見(jiàn)表1)，自第9孔吸出100μl棄去，第10孔系對(duì)照管。
表1稀釋方法
將上述各管混勻后放置37℃緩慢振蕩培養(yǎng)18小時(shí)，于600nm波長(zhǎng)處測(cè)定光吸收。最小抑菌濃度為看不見(jiàn)細(xì)菌生長(zhǎng)的最低樣品濃度。結(jié)果如表2所示。
由表2可見(jiàn)，抗菌肽HC14對(duì)革蘭氏陽(yáng)性細(xì)菌、革蘭氏陰性細(xì)菌和真菌均表現(xiàn)出很強(qiáng)的抗菌活性，其中包括大量臨床分離致病菌，MIC值處于2.34-150μg/ml的范圍。而對(duì)于皮膚如燙燒傷感染常見(jiàn)菌株金黃色葡萄球菌及銅綠假單胞菌等MIC處于4.69-37.5。
表2抗菌肽HC14抗菌活性
MIC：最小抑菌濃度，以上結(jié)果為三次獨(dú)立重復(fù)實(shí)驗(yàn)平均值；實(shí)驗(yàn)菌株數(shù)字1/2等代表臨床分離的不同致病微生物。
2.HC14溶血活性測(cè)定：
將采集的兔血與阿氏液混合抗凝，生理鹽水洗滌2次并重懸成107-108cell/ml的懸浮液。上述稀釋好的紅細(xì)胞懸液與溶解于生理鹽水的HC14樣品混合，37℃保溫30min，再于1000rpm離心5min，上清液于540nm測(cè)吸收值。陰性對(duì)照使用生理鹽水，陽(yáng)性對(duì)照使用Triton X-100，溶血百分比按以下公式計(jì)算：溶血百分比H％＝A樣品-A陰性對(duì)照/A陽(yáng)性對(duì)照×100％。
結(jié)果表明樣品濃度為100μg/ml，HC14的溶血百分比為3.67％，在濃度為200μg/ml時(shí)，HC14的溶血百分比為6.50％，說(shuō)明HC14具有較低的溶血活性，不易引起哺乳動(dòng)物紅細(xì)胞破裂溶解。
實(shí)施例3
HC3-5穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn)：
人血清穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn)
用注射器抽取健康人血5ml，分裝到滅菌的離心管中，室溫放置2h，然后置于4℃冰箱過(guò)夜。2000rpm離心10min，淡黃色上清液即為人血清。用移液器吸出血清，分裝到滅菌離心管中，-20℃冰箱保存。
將Hc3-5抗菌肽樣品與人血清按一定比例混合，使Hc3-5抗菌肽樣品的濃度為200μg/ml，血清濃度為25％，陰性對(duì)照為樣品溶解液水與血清混合物。將混合物置于37℃培養(yǎng)箱孵育，于0到6h，按照實(shí)施例1中最小抑菌濃度測(cè)定方法，檢測(cè)血清處理后Hc3-5抗菌肽對(duì)大腸桿菌1的抗菌活性。
表4抗菌肽HC3-5血清穩(wěn)定性