本發(fā)明屬于化學(xué)醫(yī)藥領(lǐng)域，特別是涉及一類嘧啶類化合物以及其藥學(xué)上可接受的鹽、立體異構(gòu)體、前藥和溶劑合物，其制備方法、藥物組合物以及醫(yī)藥用途。具體而言，本發(fā)明涉及一些嘧啶化合物及其藥學(xué)上可接受的鹽、立體異構(gòu)體、前藥和溶劑合物，其制備方法，包含所述化合物、其藥學(xué)上可接受的鹽、立體異構(gòu)體、前藥和/或溶劑合物(特別是這些化合物和鹽的有用的多晶型)的藥物組合物，和所述化合物及其藥學(xué)上可接受的鹽、立體異構(gòu)體、前藥和溶劑合物在制備用于治療由各種不同形式(激活突變體和/或抗性突變體形式)的EGFR介導(dǎo)的疾病的藥物中的用途。

背景技術(shù)：

癌癥正在成為人類最為致命的“殺手”，近年來，中國每年死于癌癥的總?cè)丝?，接?00萬人。雖然各種各樣的治療途徑以及藥物的發(fā)現(xiàn)對癌癥患者帶來了希望，但這些常規(guī)治療存在諸多弊端，譬如副作用大，治療效果不佳，腫瘤術(shù)后復(fù)發(fā)，轉(zhuǎn)移等。迫切需要新的治療技術(shù)來解決癌癥治療的低成功率的現(xiàn)狀。最近出現(xiàn)的個體化化療和靶向治療給肺癌治療帶來了新的希望。腫瘤分子靶向治療是基于對腫瘤生長密切相關(guān)的關(guān)鍵分子通過化學(xué)或生物學(xué)手段選擇性殺傷腫瘤細(xì)胞的一種治療方法。靶向治療方法具有特異性高，選擇性強，毒副作用較輕的特點。當(dāng)靶向治療與傳統(tǒng)化療、放療或腫瘤免疫聯(lián)合應(yīng)用時，可大大加強療效，減少術(shù)后復(fù)發(fā)。腫瘤靶向治療在最近幾年內(nèi)得到了迅速發(fā)展，是腫瘤治療的新興領(lǐng)域和未來發(fā)展趨勢。

蛋白酪氨酸激酶(PTKs)是一類蛋白質(zhì)酶，它們能夠催化在多種重要蛋白質(zhì)的酪氨酸殘基上的酚羥基磷酸化反應(yīng)，由此激活功能性蛋白的生物活性。這個過程在細(xì)胞內(nèi)的信號傳導(dǎo)通路中占據(jù)十分重要的地位，它調(diào)節(jié)著細(xì)胞體內(nèi)生長、分化、死亡等一系列生理化學(xué)過程。蛋白酪氨酸激酶功能失調(diào)會引發(fā)生物體內(nèi)的一系列疾病。研究表明，半數(shù)以上的癌癥原基因和癌基因的激活都與蛋白酪氨酸激酶相關(guān)，蛋白酪氨酸激酶的異常表達(dá)可導(dǎo)致細(xì)胞增殖調(diào)節(jié)發(fā)生紊亂，進而導(dǎo)致腫瘤發(fā)生。此外，酪氨酸激酶的異常表達(dá)還與腫瘤的侵襲和轉(zhuǎn)移，腫瘤新生血管的生成，腫瘤的化療抗藥性密切相關(guān)。酪氨酸激酶已經(jīng)成為抗腫瘤藥物研發(fā)為的很重要靶點。

表皮生長因子受體(EGFR)是一種受體酪氨酸蛋白激酶，屬于erbB受體家族中的一種跨膜蛋白。

EGFR調(diào)控了細(xì)胞的增殖，存活，粘連，遷移與分化，它在多種腫瘤細(xì)胞中過度活化或持續(xù)活化，比如肺癌，乳腺癌，前列腺癌等細(xì)胞中。EGFR的異?；罨谀[瘤的轉(zhuǎn)化與增長中起著關(guān)鍵性的作用。阻斷EGFR的活化已被臨床證明為有效的靶向治療腫瘤細(xì)胞方法之一。EGFR在50％的NSCLC(非小型性細(xì)胞肺癌)病例中有表達(dá)。這使得EGFR及其家族成員成為靶向治療的主要候選者。吉非替尼(gefitinib)和厄洛替尼(erlotinib)是EGFR的第一代小分子抑制劑，主要用于治療晚期NSCLC的藥物。臨床結(jié)果顯示吉非替尼或厄洛替尼對大約10％的白人NSCLC和大約35％的亞裔NSCLC患者有療效。分析表明多數(shù)具有EGFR活化突變的NSCLC患者對EGFR-酪氨酸激酶抑制劑(TKI)的反應(yīng)率顯著高于EGFR野生型的NSCLC患者。

但是臨床研究表明許多患者很快(12-14個月)就對這些EGFR的小分子抑制劑藥物產(chǎn)生了抗藥性，即獲得性耐藥性?？撮T殘基(gatekeeper residue)T790M突變是EGFR 20外顯子中的一個突變點，是造成耐藥的主要機制之一。針對這些EGFR突變的新一代抑制劑研究在進來獲得了很大的成功。阿法替尼(Afatinib)是EGFR和人表皮生長因子受體2(HER2)酪氨酸激酶的強效、不可逆的雙重抑制劑。其它類似的多靶點，高活性，不可逆的抑制劑，例如，卡奈替尼(canertinib)，達(dá)克替尼(Dacomitinib)也正在后期臨床試驗中。這些新型的第二代不可逆的抑制劑對L858R及T790M突變的EGFR具有很強的抑制作用，對吉非替尼或厄洛替尼已經(jīng)產(chǎn)生抗藥性的癌癥病人有著顯著的療效?？墒沁@些第二代EGFR突變體抑制劑對野生型EGFR(WT-EGFR)也同樣具有極強的抑制性。臨床研究已經(jīng)證明對野生型EGFR的抑制在大部分患者身上會導(dǎo)致藥物毒性和副作用，譬如在人體中表現(xiàn)為皮疹或腹瀉。

要克服第二代EGFR抑制劑的毒性和副作用，就必須減少對野生型EGFR(WT-EGFR)的抑制作用。新一代的EGFR抑制劑應(yīng)該保持對EGFR L858R激活突變體、Exon19缺失激活突變體和T790M抗性突變體有較強的抑制，同時對WT-EGFR及其它酪氨酸蛋白激酶受體顯示相對較低的抑制作用。此類化合物可以用于治療有EGFR L858R激活突變體、Exon19缺失激活突變體的癌癥病人的治療，以及對第一代EGFR抑制劑如吉非替尼、厄洛替尼或?？颂婺嵋呀?jīng)產(chǎn)生抗藥性EGFR-T790M抗性突變體的癌癥病人的治療，而不用擔(dān)心第二代EGFR突變體抑制劑如阿法替尼所帶來的副作用。

本發(fā)明顯示了許多對EGFR突變體(一種或多種)具有高抑制活性，但對野生型EGFR只有相對較低的抑制性的嘧啶化合物。本發(fā)明的化合物具有較好的物理化學(xué)性質(zhì)和安全毒性參數(shù)。此類化合物在有EGFR激活突變體和/或EGFR的抗藥性突變的癌癥治療中會有較好的效果。

本發(fā)明涉及某些嘧啶化合物及其藥學(xué)上可接受的鹽，其可用于由某些變異形態(tài)的表皮生長因子受體(例如L858R激活突變體、Exon19缺失激活突變體、和T790M抗性突變體)所介導(dǎo)的疾病或病況的治療或預(yù)防。此類化合物及其藥學(xué)上可接受的鹽、立體異構(gòu)體、前藥和溶劑合物，可用于很多不同的癌癥的治療或預(yù)防。本發(fā)明還涉及包含所述化合物及其藥學(xué)上可接受的鹽、立體異構(gòu)體、前藥和溶劑合物(特別是這些化合物和鹽的有用的多晶型)的藥物組合物、所述化合物的制備中有用的中間體、和涉及利用所述化合物及其藥學(xué)上可接受的鹽、立體異構(gòu)體、前藥和溶劑合物治療由激活和/或抗性突變體形式的EGFR所介導(dǎo)的疾病的方法。

因此，迫切需要新類型的，尤其是新穎骨架的化合物來解決耐藥性，選擇性差等問題。在以下文獻(xiàn)列表中引證與專利申請最接近的現(xiàn)有技術(shù)的專利或非專利文件(期刊、雜志、手冊和書籍等)：

1、New England Journal of medicine，2008，第358卷，第1160-1174頁；

2、Chemical and Biophysical Research Communications，2004，第319卷，第1-11頁；

3、Science，2004，第304卷，第1497-1500頁；

4、New England Journalof medicine，2004，第350卷，第2129-2139頁；

5、Molecular Cancer Therapeutics,2014,第13卷，第1468-1479頁；

6、Journal of Medicinal Chemistry,2014,第57卷，第8249-8267頁；

7、WO2013014448A1，對應(yīng)于CN103702990A；

8、WO2013108754A1；

9、CN103374000A；

10、CN103804303A；

11、WO2013184766A1；

12、WO2009051822A1。

需要聲明的是上述專利或非專利文件只是代表性的文獻(xiàn)，并不是所有有關(guān)文獻(xiàn)的完整列表。上述專利或非專利文件的全部公開內(nèi)容在此通過引用并入本文，在存在矛盾或抵觸的情況下，以本文中的描述為準(zhǔn)。

目前的EGFR-TKI仍不能解決藥物耐藥性所引起的臨床難題，而且現(xiàn)有的藥物多是以喹唑啉或者喹啉胺類為基本母核的EGFR可逆或不可逆抑制劑，其對EGFR野生型細(xì)胞的選擇性差帶來的毒副作用仍然是不可避免的。因此，迫切需要新類型的，尤其是新穎骨架的化合物來解決耐藥性，選擇性差等問題。

技術(shù)實現(xiàn)要素：

本發(fā)明的一個目的是提供一類下面式(I)所示的嘧啶化合物及其藥學(xué)上可接受的鹽、立體異構(gòu)體、前藥分子或溶劑合物。該類化合物可以對表皮生長因子受體(EGFR)蛋白激酶的變異形態(tài)產(chǎn)生抑制作用，因此可有效抑制多種腫瘤細(xì)胞的生長，可用于制備抗腫瘤藥物，用于很多不同的癌癥的治療或預(yù)防，并可以克服現(xiàn)有藥物吉非替尼，厄洛替尼等誘發(fā)的耐藥性。更特別地，該類化合物可用于制備用于治療或預(yù)防由某些變異形態(tài)的EGFR(例如L858R激活突變體、Exon19缺失激活突變體、和/或T790M抗性突變體)所介導(dǎo)的疾病、障礙、紊亂或病況的藥物。

本發(fā)明的另一目的是提供上述化合物的制備方法。

本發(fā)明的又一目的是提供一種藥物組合物，其包含選自上述嘧啶化合物、其藥學(xué)上可接受的鹽、立體異構(gòu)體、前藥分子和溶劑合物中的一種或多種，以及一種或多種藥學(xué)輔料。

本發(fā)明的又一目的是提供上述嘧啶化合物、其藥學(xué)上可接受的鹽、立體異構(gòu)體、前藥分子和/或溶劑合物以及上述藥物組合物在制備用于治療或預(yù)防由變異形態(tài)的EGFR所介導(dǎo)的疾病、障礙、紊亂或病況的藥物中的用途，尤其是在制備用于治療或預(yù)防一種或多種癌癥的藥物種的用途。

本發(fā)明的又一目的是提供一種治療或預(yù)防由變異形態(tài)的EGFR所介導(dǎo)的疾病、障礙、紊亂或病況，尤其是一種或多種癌癥的方法。

本發(fā)明的又一目的是提供一種癌癥聯(lián)合治療方法，即將選自上述嘧啶化合物、其藥學(xué)上可接受的鹽、立體異構(gòu)體、前藥分子和溶劑合物中的一種或多種或根據(jù)本發(fā)明的藥物組合物與常規(guī)的手術(shù)、放射療法、化學(xué)療法或腫瘤免疫療法聯(lián)合使用。

在本發(fā)明的第一方面，提供了式(I)的化合物或者其藥學(xué)上可接受的鹽、立體異構(gòu)體、前藥分子或溶劑合物：

其中:

R¹是C1-C6烷基、CD₃、或由氟取代的C1-C6烷基；

R²是

其中，R³是氫、氟、氯或溴，n是1-3的整數(shù)；R⁴是鹵素取代或未取代的C2-C6烷基、或鹵素取代或未取代的C3-C6環(huán)烷基；

并且，當(dāng)R¹是甲基，R²不能為

當(dāng)R¹是CD₃，R²不能為

在本申請的優(yōu)選方案中，在式(I)中，

R¹是C1-C3烷基、CD₃、或者由1至3個氟取代的C1-C3烷基；

R²選自以下基團：

并且，當(dāng)R¹是甲基，R²不能為

當(dāng)R¹是CD₃，R²不能為

在本申請的另一優(yōu)選方案中，在式(I)中，R¹甲基或CD₃，R²是選自下列基團：

其中，R⁴是乙基、環(huán)丙基、2,2-二氟乙基、2,2,2-三氟乙基。

在本申請的另一優(yōu)選方案中，在式(I)中，R¹是甲基或CD₃，R²是選自下列基團：

在本申請的另一優(yōu)選方案中，在式(I)中，R¹是CD₃，R²是選自下列基團：

在本申請的另一優(yōu)選方案中，在式(I)中，R¹是甲基，R²是選自下列基團：

在本申請的最優(yōu)選的實施方案中，所述式(I)的化合物選自：

本申請的第二方面，提供了制備上述式(I)所示化合物或其藥學(xué)上可接受的鹽的方法，例如，所述方法可以用下列通用反應(yīng)式所示的方法，其中某兩步或多步反應(yīng)順序可以互相交換，不一定要與下列反應(yīng)式所示的順序完全一樣。下列通用反應(yīng)式中的化合物A1、A2、A4、A6、A9等可以是市售的，或者可以根據(jù)本領(lǐng)域中已知的方法由從其他市售化合物制備。制備方法在實施例有詳細(xì)的描述。

其中，n、R¹、R³、R⁴如前定義和優(yōu)選，

在上述通用反應(yīng)序列中，2,4-二氯嘧啶化合物A1和吲哚化合物A2反應(yīng)生成化合物A3。在有對甲苯磺酸的條件下，化合物A3和A4反應(yīng)生成化合物A5。N,N,N’-三甲基乙二胺A6在有碳酸鉀的條件下取代A5中的氟原子而得到產(chǎn)品A7。催化氫化還原將硝基苯轉(zhuǎn)化成苯胺A8。在和丙烯酸酐A9反應(yīng)后，生成最終產(chǎn)物A10。產(chǎn)品A10加甲磺酸處理后可以得到甲磺酸鹽A11。酸與化合物A10的比例因分子而異，一個化合物A10可以和1-3個酸分子成鹽，其中以二酸鹽或三酸鹽居多。

本申請的第三方面，提供了一種藥物組合物，其包含治療有效量的選自上述式(I)中的一種或多種化合物、其藥學(xué)上可接受的鹽、立體異構(gòu)體、前藥分子和/或溶劑合物以及一種或多種藥學(xué)輔料。上述藥物組合物為用于治療或預(yù)防由激活突變體或抗性突變體形式EGFR介導(dǎo)的疾病、障礙、紊亂或病況，尤其是用于治療或預(yù)防一種或多種癌癥的藥物。

上述藥物根據(jù)治療目的可以選擇多種藥物制劑形式，一般包括：片劑、丸劑、膠囊劑、顆粒劑、混懸液、溶液、霜劑、軟膏、粉劑、栓劑、氣霧劑和注射劑等。

本申請的第四方面，提供了上述式(I)所示化合物、其藥學(xué)上可接受的鹽、立體異構(gòu)體、前藥分子和/或溶劑合物在制備治療或預(yù)防由激活或抗性突變體形式的EGFR介導(dǎo)的障礙或疾病的藥物中的用途。所述障礙或疾病包括但不限于:卵巢癌、宮頸癌、結(jié)腸直腸癌(例如，結(jié)腸腺癌)、乳腺癌、胰腺癌、膠質(zhì)瘤、膠質(zhì)母細(xì)胞瘤、黑色素瘤、前列腺癌、白血病、淋巴瘤、非霍奇金淋巴瘤、胃癌、肺癌(例如，非小細(xì)胞肺癌)、肝細(xì)胞癌、胃腸道基質(zhì)瘤(GIST)、甲狀腺癌、膽管癌、子宮內(nèi)膜癌、腎癌、間變性大細(xì)胞淋巴瘤、急性髓細(xì)胞白血病(AML)、多發(fā)性骨髓瘤或間皮瘤。

在本發(fā)明中，所述激活突變體或抗性突變體形式的EGFR可以為例如L858R激活突變體、Exon19缺失激活突變體和/或T790M抗性突變體。因此，由激活突變體或抗性突變體形式的EGFR介導(dǎo)的疾病、障礙、紊亂或病況可以為例如L858R激活突變體、Exon19缺失激活突變體和/或T790M抗性突變體所介導(dǎo)的疾病、障礙、紊亂或病況。

根據(jù)本發(fā)明的式(I)的化合物、其藥學(xué)上可接受的鹽、立體異構(gòu)體、前藥分子和溶劑合物或根據(jù)本發(fā)明的藥物組合物尤其可以用于由激活突變體或抗性突變體形式的EGFR介導(dǎo)的疾病、障礙、紊亂或病況的預(yù)防或治療，例如由L858R激活突變體、Exon19缺失激活突變體和/或T790M抗性突變體所介導(dǎo)的疾病、障礙、紊亂或病況的預(yù)防或治療，比如可以用于對吉非替尼、厄洛替尼、或?？商婺嵋呀?jīng)產(chǎn)生抗藥性的癌癥病人的預(yù)防或治療。

在本發(fā)明的又一方面，提供了一種癌癥聯(lián)合治療方法，其包括給需要治療的個體施用治療有效量的選自根據(jù)本發(fā)明的式(I)的嘧啶化合物、其藥學(xué)上可接受的鹽、立體異構(gòu)體、前藥分子和溶劑合物中的一種或多種或治療有效量的根據(jù)本發(fā)明的藥物組合物，同時聯(lián)合使用常規(guī)的手術(shù)或放射療法或化學(xué)療法或免疫腫瘤療法。

所述的化學(xué)療法或免疫腫瘤療法與本發(fā)明化合物可以并列、同時地、序貫地、或分別地給藥，并且可包含但不限制于以下類型的抗腫瘤劑的一種或多種：烷化劑(例如卡鉬、奧沙利鉬、順鉬、環(huán)磷酰胺、亞硝基脲類、氮芥、美法侖)，抗代謝藥(例如吉西他濱)，和抗葉酸劑(例如5-氟尿嘧啶和替加氟、雷替曲塞、甲氨喋呤、阿糖胞苷、羥基脲)，拓?fù)洚悩?gòu)酶抑制劑(例如依托泊苷、托泊替康、喜樹堿)，抗有絲分裂劑(例如長春新堿、長春堿、長春瑞濱,紫杉醇、泰索帝)，抗腫瘤抗生素(例如阿霉素、博來霉素、多柔比星、道諾霉素、絲裂霉素C、放線菌素)，抗雌激素藥(例如他莫昔芬、氟維司群、托瑞米芬、雷洛昔芬、屈洛昔芬)，抗雄激素藥(例如比卡魯胺、氟他胺、尼魯米特)、LHRH拮抗劑或LHRH激動劑(例如戈舍瑞林、亮丙瑞林、和布舍瑞林)，芳香酶抑制劑(例如阿那曲唑、來曲唑)，CYP17裂解酶抑制劑(例如阿比特龍)，抗erbB2抗體曲妥珠單抗[赫賽汀]，抗EGFR抗體西妥昔單抗[Erbitux]；酪氨酸激酶,絲氨酸/蘇氨酸激酶的抑制劑(例如伊馬替尼和尼洛替尼、索拉非尼、trametinib、克唑替尼)細(xì)胞周期蛋白依賴性激酶抑制劑(例如CDK4抑制劑palbociclib)，抗人血管內(nèi)皮細(xì)胞生長因子抗體貝伐珠單抗(阿瓦斯丁)以及VEGF受體酪氨酸激酶抑制劑(阿帕替尼)，免疫腫瘤治療方法，例如抗PD-1抗體(pembrolizumab，nivolumab)、抗PD-L1抗體、抗LAG-3抗體、抗CTLA-4抗體、抗4-1BB抗體、抗GITR抗體、抗ICOS抗體、白細(xì)胞介素2。

有益效果

本發(fā)明的式(I)的化合物展示了對EGFR激活突變體或抗性突變體形式(一種或多種)具有高抑制活性，但對野生型EGFR抑制相對較低的一類嘧啶化合物。本發(fā)明的化合物 具有較好的物理化學(xué)性質(zhì)和安全毒性參數(shù)。此類化合物在由EGFR激活突變和/或抗藥性突變介導(dǎo)的疾病(包括癌癥)的治療會有較好的臨床效果。

具體實施方式

以下實施例對本發(fā)明做進一步的描述，但下列實施例并非用于限制本發(fā)明的保護范圍。

實施例121

1.中間體121-3的合成

氮氣保護下，向100毫升(mL)三口瓶中在室溫下，將原料121-1(3.0克(g)，25.6毫摩爾(mmol))溶于50mL 1,2-二氯乙烷(DCE)中，將混合物降至0℃，在0℃下將甲基溴化鎂(8.5mL，25.6mmol)逐滴加入到反應(yīng)體系中，加完后恒溫繼續(xù)反應(yīng)30分鐘(min)，0℃下再將121-2(5.4g，36.3mmol)加入到反應(yīng)體系中，升溫至室溫后反應(yīng)過夜。反應(yīng)完全后，向反應(yīng)混合物中加入100毫升冰水淬滅反應(yīng)，混合物用100mL二氯甲烷萃取3次，有機相合并后用100毫升飽和食鹽水洗滌3次，用無水硫酸鈉干燥后濃縮，粗品用硅膠柱層析提純(乙酸乙酯(EA)/石油醚(PE)＝1:10-1:5)，得到2.0g產(chǎn)品121-3(34％)，為黃色固體。

液相色譜質(zhì)譜(LCMS)：229.0。

2.中間體121-5的合成

在氮氣保護下，向250mL三口瓶中依次加入121-4(10g，63.7mmol)，100mL無水N,N-二甲基甲酰胺(DMF)，K₂CO₃(1.3g，9.34mmol)，氘代碘甲烷(11g，75.9mmol)，然后在油浴中加熱到50℃后反應(yīng)2小時(h)。將反應(yīng)降溫到室溫，用100mL冰水淬滅，100mL EA萃取三次，過濾，有機相用200mL飽和食鹽水洗3次。無水硫酸鈉干燥，濃縮干燥，得9.7g產(chǎn)品121-5(88％)，為黃色固體。

3.中間體121-6的合成

向500mL單口瓶中依次加入121-5(9.7g,55.7mol)，240mL甲醇，鈀碳(12g，5％)，置換三次氫氣，室溫下過夜反應(yīng)。過濾掉鈀碳，濾液濃縮干燥，得7.2g產(chǎn)品121-6(90％)，為淺色液體。

LCMS：145.1。

4.中間體121-7的合成

在氮氣保護下，向250mL三口瓶中依次加入121-6(7.2g，49.9mmol)，64mL濃硫酸，冷卻到0-10℃后分批加入濃硝酸(HNO₃)(5.05g，50.0mmol)，用15分鐘加完。室溫下反應(yīng)過夜。將反應(yīng)混合物加入到500mL冰水中淬滅反應(yīng)，用氨水調(diào)pH為10，用100mL EA萃取三次，再用200mL飽和食鹽水洗3次。無水硫酸鈉干燥后，濃縮干燥，得到5.1g產(chǎn)品121-7(54％)，為黃色固體。

LCMS：190.1。

5.中間體121-9的合成

氮氣保護下，在100mL三口瓶中，室溫下將原料121-3(3.0g，13.0mmol)溶于30毫升N,N-二甲基甲酰胺中，加料完畢后將反應(yīng)體系降溫到0℃，然后分批加入氫化鈉 (NaH)(786mg，18.5mmol)，0℃下反應(yīng)0.5小時后加入三氟甲磺酸三氟乙酯121-8(3.65g，15mmol)，加料完畢回至室溫反應(yīng)2小時，檢測反應(yīng)完全。將反應(yīng)液倒入200mL冰水中淬滅，有紅色固體析出，將所得混合物過濾，收集固體，烘干得4.2g產(chǎn)品121-9，為紅色固體。LCMS：312.0。

6.中間體121-10的合成

氮氣保護下，在250mL三口瓶中，室溫下將原料121-9(1.8g，5.77mmol)溶于50mL異丙醇(i-PrOH)中，再依次將121-7(1.1g，5.82mmol)，對甲苯磺酸(1.3g，7.55mmol)加入到反應(yīng)體系中，加料完畢后將反應(yīng)體系升溫至105℃反應(yīng)6小時。檢測反應(yīng)完全后將反應(yīng)體系降到室溫，混合物過濾，收集濾餅，固體烘干得3g粗品121-10，為黃色固體。LCMS：465.1。

7.中間體121-11的合成

氮氣保護下，在100mL三口瓶中，室溫下將原料121-10(3.0g，6.46mmol)溶于30mL N-甲基環(huán)己酰胺(NMP)中，再依次將N,N,N’-三甲基乙二胺(860mg，8.42mmol)，無水碳酸鉀(2.7g，19.5mmol)加入到反應(yīng)體系中，加料完畢后將反應(yīng)體系升溫到100℃。反應(yīng)2小時后檢測反應(yīng)完全，將反應(yīng)體系降至室溫，將反應(yīng)液倒入100mL冰水中淬滅，將混合物抽濾，收集濾餅并烘干，得到1.7g(48％)產(chǎn)品121-11，為紅色固體。LCMS：547.2。

8.中間體121-12的合成

氮氣保護下，在250mL單口瓶中，室溫下，依次加入甲醇50mL，二氯甲烷(DCM)50mL，原料121-11(1.7g，3.11mmol)，含水鈀碳(1.7g，10％)，甲酸銨(1.7g)，加料完畢后將體系室溫反應(yīng)3小時，檢測反應(yīng)完全。反應(yīng)體系抽濾，收集濾液，濃縮至干。所得殘余物用200mL二氯甲烷溶解，200mL NaHCO₃水溶液反洗1次，再用200mL飽和食鹽水洗1次，有機相用無水硫酸鈉干燥后濃縮至干后得到0.8g(50％)產(chǎn)品121-12，為黃色固體。LCMS：517.3。

9.化合物121的合成

氮氣保護下，在100mL三口瓶中，室溫下將原料121-12(800mg，1.55mmol)溶于50mL三氯甲烷中，將反應(yīng)混合物降溫到0℃，將丙烯酸酐(195mg，1.55mmol)滴加到反應(yīng)體系中，加完后在0℃反應(yīng)約1小時。檢測反應(yīng)完全后，直接將反應(yīng)混合物濃縮至干，所得殘余物用制備色譜柱層析(色譜柱：silica gel,流動相：CHCl₃/EtOH,20-60％乙醇；20min；檢測波長：254nm)純化。將所得產(chǎn)品有機相濃縮至干，得到300mg化合物121。

將300mg化合物121于20mL乙腈中，將甲磺酸(297.7mg，2.00equiv，2.0eq)滴加到體系中，保溫攪拌1小時后將反應(yīng)混合物在低溫下濃縮至干，將所得殘余物加水重新溶解后冷凍干燥后得466mg(39％)121的甲磺酸鹽，為黃色固體。

LRMS(母分子)C₂₉H₂₉D₃F₃N₇O₂:(ES,m/z):571.3[M+H]⁺。

¹H-NMR(甲磺酸鹽):1H-NMR:(300MHz,DMSO-D₆,ppm)：δ9.50(s,1H),9.26(br s,1H),8.75(s,1H),8.47(m,1H),8.36-8.34(m,2H),7.76(d,J＝8.1Hz,1H),7.43(d,J＝6.0Hz,1H),7.36-7.31(m,1H),7.24-7.18(m,1H),7.07(s,1H),6.75-6.66(m,1H),6.33-6.27(m,1H),5.80(d,J＝11.7Hz,1H),5.41-5.32(m,2H),3.33(m,4H),2.84(d,J＝4.8Hz,6H),2.67(s,3H),2.35(s,5H).

實施例122

1.中間體122-1的合成

氮氣保護下，向500mL三口瓶中加入5-氟吲哚(10g，74.0mmol)，100mL重蒸無水四氫呋喃，將溫度降至0℃，滴加37.1mL甲基溴化鎂乙醚溶液(3.0M),滴加完畢后，保持0℃反應(yīng)約30min，0℃下分批加入2,4-二氯嘧啶(16.5g，111mmol)，加料完畢后將反應(yīng)體系自然回到室溫反應(yīng)過夜。檢測反應(yīng)完全后，向反應(yīng)體系中滴加100mL氯化銨水溶液將反應(yīng)淬滅，向所得混合物用100mL乙酸乙酯萃取2次，合并有機相，用100mL飽和食鹽水反洗1次，無水硫酸鈉干燥后濃縮至干，所得固體用100mL乙腈洗1次，抽濾，收集濾餅烘干得到6g(33％)產(chǎn)品122-1，為黃色固體。LCMS：248.0。

2.中間體122-2的合成

氮氣保護下，向100mL三口瓶中室溫下將原料122-1(2.0g，8.08mmol)溶于50mL無水DMF中，然后降溫至0℃分批加入NaH(65％，445mg，12.1mmol)，加料完畢后將反應(yīng)體系保持0℃反應(yīng)30min。然后0℃下滴加三氟甲磺酸三氟乙酯(2.8g，12.1mmol)，滴加完畢后將體系保持0℃反應(yīng)1小時，檢測反應(yīng)完全后，將反應(yīng)混合物倒入100mL冰水中淬滅反應(yīng)，析出固體，將混合物過濾，收集濾餅并烘干得3g粗產(chǎn)品122-2，為黃色固體。LCMS：330.0。

3.中間體122-4的合成

在氮氣保護下，向2000mL三口瓶中依次加入122-3(100g，709mmol)和800mL濃硫酸(H₂SO₄)，降溫至0℃，維持溫度在0-10℃之間分批加入硝酸鉀(KNO₃)(71.6g，708mmol)，用時1小時，最后在室溫下反應(yīng)過夜。反應(yīng)結(jié)束后，向三口瓶中加入2升(L)冰水以淬滅反應(yīng)。低溫下將反應(yīng)混合物用氨水調(diào)到pH為10，用1L二氯甲烷(DCM)萃取3次。有機相合并后，用3L飽和食鹽水反洗3次，用無水硫酸鈉干燥，旋干。所得粗產(chǎn)品經(jīng)硅膠柱層析(洗脫劑乙酸乙酯(EA):石油醚(PE)＝1:4-1:1)，洗脫液旋干后得到79g 122-4(產(chǎn)率：60％)，為黃色固體。

LCMS：187.0。

4.中間體122-5的合成

氮氣保護下，在100mL三口瓶中，室溫下將原料122-2(3g，9.10mmol)溶于30mL異丙醇中，再依次將122-4(1.7g，9.13mmol)，對甲苯磺酸(2g，11.6mmol)加入到 反應(yīng)體系中，加料完畢后將反應(yīng)體系升溫至105℃反應(yīng)6h。檢測反應(yīng)完全后將反應(yīng)體系降到室溫，混合物過濾，收集濾餅，固體烘干得2.4g(55％)產(chǎn)品122-5，為黃色固體。LCMS：480.1。

5.中間體122-6的合成

氮氣保護下，在100mL三口瓶中，室溫下將原料122-5(2.4g，5.01mmol)溶于30mL NMP中，再依次將N,N-三甲基乙二胺(770mg，7.54mmol)，無水碳酸鉀(2.1g，15.2mmol)加入到反應(yīng)體系中，加料完畢后將反應(yīng)體系升溫到100℃。反應(yīng)2h后檢測反應(yīng)完全，將反應(yīng)體系降至室溫，將反應(yīng)液倒入100mL冰水中淬滅，將混合物抽濾，收集濾餅并烘干，得到1.5g(53％)產(chǎn)品122-6，為紅色固體。LCMS：562.2。

6.中間體122-7的合成

氮氣保護下，在250mL單口瓶中，室溫下，依次加入甲醇50mL，二氯甲烷50mL，原料122-6(1.5g，2.67mmol)，含水鈀碳(10％，1.5g)，甲酸銨(1.5g)，加料完畢后將體系室溫反應(yīng)3h，檢測反應(yīng)完全。反應(yīng)體系抽濾，收集濾液，濃縮至干。所得殘余物用200mL二氯甲烷溶解，200mL碳酸氫鈉水溶液反洗1次，再用200mL飽和食鹽水洗1次，有機相用無水硫酸鈉干燥后濃縮至干后得到1.1g(77％)產(chǎn)品122-7，為黃色固體。LCMS：532.2。

7.化合物122的合成

氮氣保護下，在100mL三口瓶中，室溫下將原料122-7(1.1g，2.07mmol)溶于30mL三氯甲烷中，將反應(yīng)混合物降溫到0℃，將丙烯酸酐(260mg，2.06mmol)滴加到反應(yīng)體系中，加完后在0℃反應(yīng)約1小時。檢測反應(yīng)完全后，直接濃縮至干，所得殘余物用硅膠柱層析(色譜柱：silica gel,流動相：CHCl₃/EtOH)；20-60％乙醇；20min；檢測波長：254nm)純化。將所得產(chǎn)品有機相濃縮至干，得到590mg化合物122。

將960mg化合物122于10mL乙腈中，將甲磺酸(96mg，1.00mmol，1.0eq)滴加到體系中，保溫攪拌1小時后將反應(yīng)混合物在低溫下濃縮至干，將所得殘余物加水重新溶解后冷凍干燥后得629.4mg(45％)122的甲磺酸鹽，為黃色固體。

LRMS(母分子)C₂₉H₃₁F₄N₇O₂:(ES,m/z):586.2[M+H]⁺。

¹H-NMR(甲磺酸鹽):(300MHz,DMSO-D₆,ppm):δ9.45(s,1H),9.39(br s,1H),8.60(s,2H),8.35-8.34(m,2H),8.11(d,J＝8.7Hz,1H),7.74-7.71(m,1H),7.25(d,J＝5.4Hz,1H),7.19-7.12(m,1H),7.03(s,1H),6.78-6.70(m,1H),6.27(dd,J＝1.8Hz,17.1Hz,1H),5.79-5.75(m,1H),5.37-5.28(m,2H),3.87(s,3H),3.30(s,4H),2.82(d,J＝4.5Hz,6H),2.68(s,3H),2.33(s,3H)。

實施例123

1.中間體123-1的合成

氮氣保護下，向100mL三口瓶中室溫下將原料122-1(2.5g，10.1mmol)溶于50mL無水DMF中，然后降溫至0℃分批加入NaH(65％，560mg，15.2mmol)，加料完畢后將反應(yīng)體系保持在0℃反應(yīng)30分鐘。然后0℃下滴加1,1-二氟-2-溴乙烷(2.9g，20.0mmol)，滴加完畢后將體系回到室溫反應(yīng)過夜。檢測反應(yīng)完全后，將反應(yīng)混合物倒入200mL冰水中淬滅反應(yīng)，析出固體，將混合物過濾，收集濾餅，用50mL乙腈洗1次，并烘干得1.6g(51％)產(chǎn)品123-1，為黃色固體。LCMS：312.0。

2.化合物123的合成

從中間體123-1合成化合物123及其甲磺酸鹽的實驗步驟及反應(yīng)條件與上述實施例122中第四步至第七步的化學(xué)反應(yīng)相同。不同的是這里用中間體123-1取代了實施例122中的中間體122-2。

化合物123的數(shù)據(jù)：

LRMS(母分子)C₂₉H₃₂F₃N₇O₂:(ES,m/z):568.3[M+H]⁺。

¹H-NMR(甲磺酸鹽):(300MHz,DMSO-D₆,ppm):δ9.43(br s,2H),8.79(s,1H),8.60(s,2H),8.35-8.26(m,2H),8.00(br s,1H),7.75-7.71(m,1H),7.19-7.13(m,1H),7.09(s,1H),7.03(s,1H),6.50-6.21(m,2H),5.78-5.74(m,1H),4.91-4.81(m,2H),3.84(s,3H),3.33(s,4H),2.82(d,J＝4.8Hz,6H),2.67(s,3H),2.34(s,6H)。

實施例124

1.中間體124-1的合成

氮氣保護下，向250mL三口瓶中加入6-氟吲哚(5g，37.0mmol)，100mL無水四氫呋喃，將溫度降至0℃，滴加18.5mL甲基溴化鎂乙醚溶液(3.0M),滴加完畢后，保持0℃反應(yīng)約30分鐘，0℃下分批加入2,4-二氯嘧啶(8.28g，55.6mmol)，加料完畢后將反應(yīng)體系自然回到室溫反應(yīng)過夜。檢測反應(yīng)完全后，向反應(yīng)體系中滴加100mL氯化銨水溶液將反應(yīng)淬滅，向所得混合物用100mL乙酸乙酯萃取2次，合并有機相，用100mL飽和食鹽水反洗1次，無水硫酸鈉干燥后濃縮至干，所得固體用50mL乙腈洗1次，抽濾，收集濾餅烘干得到6.1g(67％)124-1，為黃色固體。LCMS：248.0。

2.中間體124-2的合成

氮氣保護下，向250mL三口瓶中室溫下將原料124-1(6.1g，24.6mmol)溶于100mL無水DMF中，然后降溫至0℃分批加入NaH(65％，1.4g，37.9mmol)，加料完畢后將反應(yīng)體系保持0℃反應(yīng)30分鐘。然后0℃下滴加三氟甲磺酸三氟乙酯(8.6g，37.1 mmol)，滴加完畢后將體系保持0℃反應(yīng)2小時，檢測反應(yīng)完全后，將反應(yīng)混合物倒入200mL冰水中淬滅反應(yīng)，析出固體，將混合物過濾，收集濾餅并烘干得3g(37％)產(chǎn)品124-2，為黃色固體。LCMS：330.0。

3.化合物124的合成

從中間體124-2合成化合物124及其甲磺酸鹽的實驗步驟及反應(yīng)條件與上述實施例122中第四步至第七步的化學(xué)反應(yīng)相同。不同的是這里用中間體124-2取代了實施例122中的中間體122-2。

化合物124的數(shù)據(jù)：

LRMS(母分子)C₂₉H₃₁F₄N₇O₂:(ES,m/z):586.2[M+H]⁺。

¹H-NMR(甲磺酸鹽):(300MHz,DMSO-D₆,ppm)：δ9.70(br s,1H),8.67(br s,1H),8.55(s,1H),8.39-8.34(m,2H),8.11(s,1H),7.65(dd,J＝2.1Hz,9.9Hz,1H),7.26(d,J＝5.4Hz,1H),7.06-6.99(m,2H),6.72-6.63(m,1H),6.32-6.22(m,1H),5.78-5.77(m,1H),5.37-5.25(m,2H),3.89(s,3H),3.31-3.07(m,4H),2.65-2.56(m,8H),2.32(s,3H)。

實施例125

1.中間體125-1的合成

氮氣保護下，向100mL三口瓶中室溫下將原料124-1(2.5g，10.1mmol)溶于50mL無水DMF中，然后降溫至0℃分批加入NaH(65％，560mg,15.2mmol)，加料完畢后將反應(yīng)體系保持0℃反應(yīng)30分鐘。然后0℃下滴加1,1-二氟-2-溴乙烷(2.9g，20.0mmol)，滴加完畢后將體系回到室溫反應(yīng)過夜。檢測反應(yīng)完全后，將反應(yīng)混合物倒入100mL冰水中淬滅反應(yīng)，析出固體，將混合物過濾，收集濾餅，用50mL乙腈洗1次，烘干得1.5g(48％)產(chǎn)品125-1，為黃色固體。LCMS：312.0。

2.化合物125的合成

從中間體125-1合成化合物125及其甲磺酸鹽的實驗步驟及反應(yīng)條件與上述實施例122中第四步至第七步的化學(xué)反應(yīng)相同。不同的是這里用中間體125-1取代了實施例122中的中間體122-2。

化合物125的數(shù)據(jù)：

LRMS(母分子)C₂₉H₃₂F₃N₇O₂:(ES,m/z):568.3[M+H]⁺。

¹H-NMR(甲磺酸鹽):(300MHz,DMSO-D₆,ppm):δ9.55(s,2H),9.26(br s,1H),8.72(s,1H),8.32-8.30(m,3H),7.64(d,J＝9.9Hz,1H),7.42(d,J＝6.3Hz,1H),7.08(s,1H),7.05-6.99(m,1H),6.73-6.26(m,3H),5.82-5.78(m,1H),4.89-4.78(m,2H),3.87(s,3H),3.34(m,4H),2.84(d,J＝4.8Hz,6H),2.68(s,3H),2.34(s,7H).

實驗實施例

細(xì)胞生長抑制實驗：

用測定細(xì)胞的生長的方法來鑒定優(yōu)先靶向針對某些變異形態(tài)的EGFR，而對野生型EGFR的活性相對較弱的化合物。NCI-H1975細(xì)胞株是含有T790M和L858R EGFR突變的人類非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞，該細(xì)胞生長在含10％胎牛血清(FBS)的RPMI-1640培養(yǎng)基(GIBCO)中。LoVo細(xì)胞株是一個野生型EGFR的人結(jié)腸腺癌細(xì)胞，該細(xì)胞生長在含有10％FBS的F-12K培養(yǎng)基(GIBCO)中。NCI-H1975和LoVo細(xì)胞的生長快慢由Cell Titer-Glo發(fā)光活力測定法(Promega公司#G7572)來檢測。

簡要地說，用胰蛋白酶來消化在對數(shù)生長期的細(xì)胞，并以每孔5000個Lovo或3000個NCI-H1975細(xì)胞接種到96孔板中，并孵育在37℃，有5％CO₂的濕潤的培養(yǎng)箱內(nèi)，同時設(shè)不接種細(xì)胞僅加入營養(yǎng)液的空白對照孔。24小時后，將不同化合物的DMSO溶液用細(xì)胞培養(yǎng)基液體從高到低稀釋到不同濃度，每次用3.16倍稀釋，共有8個不同濃度。NCI-H1975細(xì)胞中測試藥物的濃度從0.03nM-100nM,LoVo細(xì)胞中測試藥物的濃度從3nM-10μM。然后將不同化合物的細(xì)胞培養(yǎng)基液體加入到有細(xì)胞的96孔細(xì)胞板中，同時設(shè)一個僅含有DMSO的細(xì)胞培養(yǎng)基液體的細(xì)胞對照孔。在藥物處理72小時后，將細(xì)胞板從培養(yǎng)箱中取出并放置在室溫下30分鐘。然后加Cell Titer-Glo試劑到孔中，并將96孔細(xì)胞板在室溫下?lián)u晃10分鐘，以誘導(dǎo)細(xì)胞裂解。再將96孔細(xì)胞板放在實驗臺上2分鐘，讓發(fā)光信號穩(wěn)定。最后將96孔細(xì)胞板放入EnVision多標(biāo)記微孔板檢測儀(PerkinElmer)中，用0.5秒的積分時間來讀取信號。

計算公式為：

細(xì)胞生長抑制百分比％＝(最大信號–化合物信號)/(最大信號-最小信號)*100％

最大信號由沒有化合物的DMSO對照處理的細(xì)胞對照孔中獲得；

化合物信號由加入化合物的藥物處理的細(xì)胞孔中獲得

最小信號由沒有細(xì)胞的，只有營養(yǎng)液的空白對照孔中獲得。

通過GraphPad Prism V5.0軟件計算出細(xì)胞生長抑制曲線，并基于此數(shù)據(jù)計算出獲得50％抑制效果所需的化合物濃度，即化合物IC₅₀。

所得結(jié)果列在下表1中。

表1：化合物活性實驗結(jié)果