本發(fā)明涉及通式(I)取代苯并吡唑二芳基脲類化合物作為用于炎癥性和腫瘤性藥物的用途。

背景技術(shù)：

絲裂素活化蛋白激酶(MAPKs)是細(xì)胞內(nèi)蛋白激酶的一種，屬于絲氨酸/蘇氨酸激酶系列，能夠作為細(xì)胞內(nèi)眾多活化反應(yīng)和功能反應(yīng)的調(diào)節(jié)介質(zhì)，參與基因表達(dá)、細(xì)胞增殖和死亡等眾多的功能性過(guò)程。p38 MAPK信號(hào)通路是MAPK家族的重要組成成員，它的活化是眾多前炎性因子和壓力因素作用的結(jié)果，不僅在眾多包括炎性細(xì)胞增殖分化和擴(kuò)增的細(xì)胞內(nèi)信號(hào)反饋過(guò)程中發(fā)揮著非常重要的作用，而且參與應(yīng)激反應(yīng)的過(guò)程。有許多相關(guān)的文獻(xiàn)描述了p38 MAPK相關(guān)的性質(zhì)和在疾病研究中的應(yīng)用以及前景。

p38 MAPK原先被認(rèn)為是通過(guò)細(xì)胞因子發(fā)揮抑制作用的抗炎藥物的結(jié)合蛋白(CSBP)，首先在1993年由Han等在實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)，1994年由Han等首先在小鼠肝臟細(xì)胞中克隆了p38 MAPK的基因，它是編碼由360個(gè)氨基酸組成的38KD的蛋白，在炎性細(xì)胞因子的生物合成過(guò)程中發(fā)揮重要的調(diào)節(jié)作用。

目前發(fā)現(xiàn)的p38 MAPK家族包含著四種類型：p38α，p38β，p38γand p38δ。不同p38 MAPK亞型在組織分布、上游激酶調(diào)節(jié)、下游作用底物以及對(duì)細(xì)胞外刺激的反應(yīng)都各有不同，不同亞型的p38 MAPK在結(jié)構(gòu)上也有著不同程度的相似性。p38α和p38β在各種體內(nèi)組織中都有著廣泛的表達(dá)，同時(shí)它們包含了74％相同的氨基酸序列，并且它們都是特異性表達(dá)的，p38γ與p38α有著64％ 的氨基酸同源性，p38γ則主要在骨骼肌中表達(dá)，而p38δ則在小腸、肺組織、腎上腺、前列腺等處比較常見。由于p38α和β在身體各部位的分布比較廣泛，因而針對(duì)p38 MAPK的抑制劑主要是針對(duì)p38α和β的抑制。許多證據(jù)表明p38 MAPK途徑在炎癥疾病和癌癥中表現(xiàn)出重要的作用。對(duì)p38 MAPK在這些相關(guān)疾病中的作用進(jìn)行了總結(jié)，同時(shí)也表明了p38 MAPK的抑制劑具有作為治療手段的潛在價(jià)值。

我們創(chuàng)造性發(fā)明了全新的取代苯并吡唑二芳基脲類化合物用作P38 MAPK抑制劑，通過(guò)高通量篩選評(píng)價(jià)了這類化合物在體外對(duì)P38 MAPK通路的抑制作用，發(fā)現(xiàn)幾乎所有實(shí)施例化合物細(xì)胞活性與P38α酶活性都優(yōu)于文獻(xiàn)公認(rèn)的P38抑制劑SB203580，其中化合物實(shí)施例3和文獻(xiàn)報(bào)道的陽(yáng)性對(duì)照藥SB203580比較，TNF-α抑制活性增強(qiáng)400倍，P38α酶抑制活性增強(qiáng)10倍。此外與陽(yáng)性對(duì)照藥BIRB-796比較，實(shí)施例2和實(shí)施例31對(duì)P38α酶選擇性明顯提高。

本發(fā)明報(bào)道的具有高活性的P38 MAPK小分子抑制劑，用以克服炎癥、炎癥相關(guān)疾病及腫瘤疾病的難題，特別是窒息性氣體或刺激性氣體造成的急性肺損傷疾病，為這類疾病的臨床治療提供新的醫(yī)學(xué)策略。

本發(fā)明目的在于提供一類新型的二芳基脲類化合物作為用于炎癥性和腫瘤性藥物的用途。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

1.本發(fā)明涉及通式(I)化合物或其異構(gòu)體的內(nèi)容

其中：

Ar₁為C₆-C₁₀芳香碳環(huán)，包括但不限于苯環(huán)、取代苯環(huán)、環(huán)辛四烯等；或C₃-C₁₀飽和不飽的非芳香雜環(huán)，包括但不限于環(huán)戊烷、環(huán)己烷、環(huán)戊烯、環(huán)己烯、環(huán)己二烯；C₅-C₁₀的芳香雜環(huán)，包括一到多個(gè)選自O(shè)，N，S的雜原子，包括但不限于咪唑、吡唑、呋喃、噻吩、噻唑、噁唑、吡嗪、嘧啶、吲哚、喹啉等；或者C₅-C₈的單雜環(huán)或者C₈-C₁₁的雙雜環(huán)，包括一到多個(gè)選自O(shè)，N，S的雜原子，包括但不限于四氫呋喃、四氫噻吩、哌啶等；其中Ar₁獨(dú)立并選擇性的被一到多個(gè)R¹所取代；

R¹獨(dú)立的為

(1)C₁-C₁₀飽和的直連或支鏈烷烴，所述的烷基可部分或全部被鹵素原子取代，并且可以選擇性的被1-3個(gè)苯基，萘環(huán)或以下雜原子取代：喹啉基，異喹啉基，嘧啶基，吡嗪基，哌嗪基，吡咯基，呋喃基，噻吩基，吡唑基，噻唑基，噁唑基，異噁唑基，異噻唑基；上述的苯基，萘環(huán)或者雜環(huán)可以選擇性的被0-5個(gè)下述基團(tuán)取代：鹵素，C₁-C₆的直連或支鏈烷基，C₂-C₆的直連或支鏈烯烴，C₁-C₆的直連或支鏈烷氧基，C₂-C₆的直連或支鏈烯氧基，鹵素，三氟甲基，三氟甲氧基，乙酰基，芳?；?，甲氧羰基，乙氧羰基，苯磺?；u基，氨基，單或雙C₁-C₄取代的磺酰胺基，氰基，硝基；

(2)C₃-C₁₀的環(huán)烷基和環(huán)烯基，所述基團(tuán)可部分或全部被鹵素取代，或選擇性的被1-3個(gè)C₁-C₆的直連或支鏈烷基或C₁-C₆烷氧基取代；上述的環(huán)烷基或者環(huán)烯基的1-3個(gè)亞甲基可以選擇性的被O，NH，S，SO，SO₂，羰基，羥甲基取代；上述的環(huán)烷基或者環(huán)烯基的0-5個(gè)以下基團(tuán)取代：鹵素，C₁-C₆的直連或支鏈烷基或C₁-C₆烷氧基；

(3)C₃-C₁₀不飽和的直連或支鏈烯基，所述的烷基可部分或全部被鹵素取代，并且選擇性的被1-3個(gè)C₁-C₆的直連或支鏈烷基，苯基，萘基或以下雜環(huán)取代：喹啉基，異喹啉基，嘧啶基，吡嗪基，哌嗪基，吡咯基，呋喃基，噻吩基，吡唑基，噻唑基，噁唑基，異噁唑基，異噻唑基；上述的苯基，萘環(huán)或者雜環(huán)可以選擇性的被0-5個(gè)下述基團(tuán)取代：鹵素，C₁-C₆的直連或支鏈烷基，C₂-C₆的直連或支鏈烯烴，C₁-C₆的直連或支鏈烷氧基，C₂-C₆的直連或支鏈烯氧基，鹵素，三氟甲基，三氟甲氧基，乙酰基，芳?；?，甲氧羰基，乙氧羰基，苯磺酰基，羥基，氨基，單或雙C₁-C₄取代的磺酰胺基，氰基，硝基；

(4)鹵素，硝基，羥基，氨基，羧基，氰基，三氟甲基，三氟甲氧基，以及各種單取代或是雙取代的氨基化合物；

R₁獨(dú)立的為C₁-C₁₀飽和的直連、支鏈以及環(huán)烷烴，鹵素取代；

R₂獨(dú)立的為C₁-C₁₀飽和的直連、支鏈以及環(huán)烷烴，所述的烷基可部分或全部被鹵素原子取代，苯環(huán)或取代苯環(huán)取代；

另一方面，本發(fā)明提供包含化合物通式(I)化合物藥物的藥用組合物，其含有至少一種通式(I)化合物或其可藥用鹽、溶劑化物，一級(jí)一種或多種藥用載體或賦形劑。

另一方面，本發(fā)明還涉及制備通式(I)化合物或者其藥用鹽或溶劑化物 的方法。

再一方面，本發(fā)明涉及通式(I)化合物用于治療或預(yù)防細(xì)胞因子(TNF-α，IL-1等)介導(dǎo)的疾病的藥用用途。

在又一方面，本發(fā)明提供通式(I)化合物用于治療或預(yù)防細(xì)胞因子(TNF-α，IL-1等)介導(dǎo)的疾病，危險(xiǎn)因子或病癥的方法，包括給予有此需要的對(duì)象治療或是預(yù)防有效量的本發(fā)明化合物。本發(fā)明中所述的細(xì)胞因子(TNF-α，IL-1等)介導(dǎo)的疾病，危險(xiǎn)因子或病癥包括下列疾?。侯愶L(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎，慢性肺阻塞，窒息性氣體或刺激性氣體造成的急性肺損傷，牛皮癬性關(guān)節(jié)炎，萊特爾氏綜合征，痛風(fēng)，骨關(guān)節(jié)炎，外傷性關(guān)節(jié)炎，急性滑膜炎，類風(fēng)濕性脊柱炎，痛風(fēng)性疾病和其他關(guān)節(jié)疾病，敗血癥，膿毒性休克，骨髓增生異常綜合征，中毒性休克，腦性瘧，腦膜炎，局部出血性中風(fēng)，骨質(zhì)疏松，充血性心力衰竭，冠狀動(dòng)脈旁路搭橋術(shù)，腎小球性腎炎，慢性腎衰竭，糖尿病，糖尿病性視網(wǎng)膜病，節(jié)段性回腸炎，潰瘍性結(jié)腸炎，肌肉退化，濕疹，接觸性皮炎，牛皮癬，結(jié)膜炎，癌癥的輔助治療等。

在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方式中，本發(fā)明提供了通式(I)化合物及其藥用鹽或溶劑化物，

其中：

Ar₁為苯環(huán)、取代苯環(huán)等；C₅-C₁₀的芳香雜環(huán)，包括一到多個(gè)選自O(shè)，N，S的雜原子，包括但不限于咪唑、吡唑、呋喃、噻吩、噻唑、噁唑、吡嗪、嘧啶、吲哚、喹啉等；包括芳基取代的芳香雜環(huán)，如苯基取代的吡唑、咪唑等；

R₁獨(dú)立的為H或鹵素原子；

R₂獨(dú)立的為C₁-C₁₀飽和的直連、支鏈以及環(huán)烷烴，所述的烷基可部分或全部被鹵素原子取代，苯環(huán)或取代苯環(huán)取代；

在本發(fā)明的一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方式中，本發(fā)明提供了通式(I)化合物及其藥用鹽或溶劑化物，

其中：

Ar₁為異丙基苯環(huán)，2-三氟甲基氯苯，3-叔丁基-1-對(duì)甲基苯基吡唑，3-叔丁基-1-對(duì)硝基苯基吡唑，3-叔丁基-1-對(duì)氟苯基吡唑，3-叔丁基-1-苯基吡唑取代；

R₁獨(dú)立的為H或F原子；

R₂獨(dú)立的為乙基，2-氯乙基，環(huán)戊基，環(huán)己基，環(huán)丙基，異丙基，對(duì)氯苯基，間甲基苯基取代；

本發(fā)明優(yōu)選的化合物包括：

5-{2-{{3-[3-(叔丁基)-1-對(duì)甲基苯基-1H-吡唑-5基]脲}甲基}苯氧基}-N-乙基-1H-吲唑-1-酰胺

5-{2-{{3-[3-(叔丁基)-1-對(duì)硝基苯基-1H-吡唑-5基]脲}甲基}苯氧基}-N-乙基-1H-吲唑-1-酰胺

5-{2-{{3-[3-(叔丁基)-1-對(duì)氟苯基-1H-吡唑-5基]脲}甲基}苯氧基}-N-乙基-1H-吲唑-1-酰胺

5-{2-{{3-[3-(叔丁基)-1-苯基-1H-吡唑-5基]脲}甲基}苯氧基}-N-乙基-1H-吲唑-1-酰胺

5-{2-{{3-[3-(叔丁基)-1-苯基-1H-吡唑-5基]脲}甲基}苯氧基}-N-(2-氯乙基)-1H-吲唑-1-酰胺

5-{2-{{3-[3-(叔丁基)-1-對(duì)氟苯基-1H-吡唑-5基]脲}甲基}苯氧基}-N-(2-氯乙基)-1H-吲唑-1-酰胺

5-{2-{{3-[3-(叔丁基)-1-對(duì)甲基苯基-1H-吡唑-5基]脲}甲基}苯氧基}-N-(2-氯乙基)-1H-吲唑-1-酰胺

5-{2-{{3-[3-(叔丁基)-1-對(duì)硝基苯基-1H-吡唑-5基]脲}甲基}苯氧基}-N-(2-氯乙基)-1H-吲唑-1-酰胺

5-{2-{{3-[3-(叔丁基)-1-對(duì)甲基苯基-1H-吡唑-5基]脲}甲基}苯氧基}-N-異丙基-1H-吲唑-1-酰胺

5-{2-{{3-[3-(叔丁基)-1-苯基-1H-吡唑-5基]脲}甲基}苯氧基}-N-異丙基-1H-吲唑-1-酰胺

5-{2-{{3-[3-(叔丁基)-1-對(duì)硝基苯基-1H-吡唑-5基]脲}甲基}苯氧基}-N-異丙基-1H-吲唑-1-酰胺

5-{2-{{3-[3-(叔丁基)-1-對(duì)硝基苯基-1H-吡唑-5基]脲}甲基}苯氧基}-N-叔丁基-1H-吲唑-1-酰胺

5-{2-{{3-[3-(叔丁基)-1-對(duì)甲基苯基-1H-吡唑-5基]脲}甲基}苯氧基}-N-叔丁基-1H-吲唑-1-酰胺

5-{2-{{3-[3-(叔丁基)-1-苯基-1H-吡唑-5基]脲}甲基}苯氧基}-N-叔丁基-1H-吲唑-1-酰胺

5-{2-{{3-[3-(叔丁基)-1-對(duì)氟苯基-1H-吡唑-5基]脲}甲基}苯氧基}-N-叔丁基-1H-吲唑-1-酰胺

5-{2-{{3-[3-(叔丁基)-1-對(duì)甲基苯基-1H-吡唑-5基]脲}甲基}苯氧基}-N-環(huán)己基-1H-吲唑-1-酰胺

5-{2-{{3-[3-(叔丁基)-1-對(duì)硝基苯基-1H-吡唑-5基]脲}甲基}苯氧基}-N-環(huán)己基-1H-吲唑-1-酰胺

5-{2-{{3-[3-(叔丁基)-1-苯基-1H-吡唑-5基]脲}甲基}苯氧基}-N-環(huán)己基-1H-吲唑-1-酰胺

5-{2-{{3-[3-(叔丁基)-1-苯基-1H-吡唑-5基]脲}甲基}苯氧基}-N-環(huán)戊基-1H-吲唑-1-酰胺

5-{2-{{3-[3-(叔丁基)-1-對(duì)硝基苯基-1H-吡唑-5基]脲}甲基}苯氧基}-N-環(huán)戊基-1H-吲唑-1-酰胺

5-{2-{{3-[3-(叔丁基)-1-對(duì)甲基苯基-1H-吡唑-5基]脲}甲基}苯氧基}-N-環(huán)戊基-1H-吲唑-1-酰胺

5-{2-{{3-[3-(叔丁基)-1-對(duì)甲基苯基-1H-吡唑-5基]脲}甲基}-4-氟苯氧基}-N-環(huán)戊基-1H-吲唑-1-酰胺

5-{2-{{3-[3-(叔丁基)-1-對(duì)硝基苯基-1H-吡唑-5基]脲}甲基}-4-氟苯氧基}-N-環(huán)戊基-1H-吲唑-1-酰胺

5-{2-{{3-[3-(叔丁基)-1-對(duì)硝基苯基-1H-吡唑-5基]脲}甲基}-4-氟苯氧基}-N-環(huán)己基-1H-吲唑-1-酰胺

5-{2-{{3-[3-(叔丁基)-1-對(duì)甲基苯基-1H-吡唑-5基]脲}甲基}-4-氟苯氧基}-N-環(huán)己基-1H-吲唑-1-酰胺

5-{2-{{3-[3-(叔丁基)-1-對(duì)甲基苯基-1H-吡唑-5基]脲}甲基}-4-氟苯氧基}-N-異丙基-1H-吲唑-1-酰胺

5-{2-{{3-[3-(叔丁基)-1-對(duì)硝基苯基-1H-吡唑-5基]脲}甲基}-4-氟苯氧基}-N-異丙基-1H-吲唑-1-酰胺

5-{2-{{3-[3-(叔丁基)-1-對(duì)硝基苯基-1H-吡唑-5基]脲}甲基}-4-氟苯氧基}-N-叔丁基-1H-吲唑-1-酰胺

5-{2-{{3-[3-(叔丁基)-1-對(duì)甲基苯基-1H-吡唑-5基]脲}甲基}-4-氟苯氧基}-N-叔丁基-1H-吲唑-1-酰胺

5-{2-{{3-[3-(叔丁基)-1-對(duì)硝基苯基-1H-吡唑-5基]脲}甲基}-4-氟苯氧基}-N-乙基-1H-吲唑-1-酰胺

5-{2-{{3-[3-(叔丁基)-1-對(duì)甲基苯基-1H-吡唑-5基]脲}甲基}-4-氟苯氧基}-N-乙基-1H-吲唑-1-酰胺

5-{2-{{3-[3-(叔丁基)-1-對(duì)甲基苯基-1H-吡唑-5基]脲}甲基}-4-氟苯氧基}-N-(2-氯乙基)-1H-吲唑-1-酰胺

5-{2-{{3-[3-(叔丁基)-1-對(duì)硝基苯基-1H-吡唑-5基]脲}甲基}-4-氟苯氧基}-N-(2-氯乙基)-1H-吲唑-1-酰胺

5-{4-氟-2-{[3-(3-異丙基)脲]甲基}苯氧基}-N-(2-氯乙基)-1H-吲唑-1-酰胺

5-{2-{[3-(3-異丙基)脲]甲基}苯氧基}-N-乙基-1H-吲唑-1-酰胺

5-{2-{{3-[4-氯-3-(三氯甲基)苯基]脲基}甲基}苯氧基}-N-乙基-1H-吲唑-1-酰胺

5-{2-{{3-[4-氯-3-(三氯甲基)苯基]脲基}甲基}苯氧基}-N-(2氯乙基)-1H-吲唑-1-酰胺

以及其可藥用鹽或溶劑化物。

本發(fā)明提供了通式(I)化合物及其藥用鹽的制備方法。

R₁＝CH₃，NO₂，F(xiàn)，H

R₂＝H，F(xiàn)

R₂＝H，F(xiàn) R₃＝乙基，2-氯乙基，異丙基，叔丁基，環(huán)戊基，環(huán)己基

取代的苯肼A與氰基頻那酮B于80℃乙醇回流8小時(shí)得到中間體C；中間體C，E，G通過(guò)與氯甲酸三氯乙酯在0℃四氫呋喃溶液中反應(yīng)12小時(shí)得到中間體D，F(xiàn)，H。

取代的鄰氰基氟苯I與3-甲基-4-氨基苯酚J在90℃DMSO溶液中反應(yīng)4小時(shí)得到中間體K；中間體K和亞硝酸異戊酯、乙酸酐在甲苯溶液中90℃回流反應(yīng)8小時(shí)得到中間體L；中間體L在65℃四氫呋喃溶液中通過(guò)氫化鋁鋰還原1小時(shí)得到中間體M。

中間體D，F(xiàn)，H與中間體M，S在100℃DMSO溶液中反應(yīng)1小時(shí)得到中間體N；最后中間體N與取代的異氰酸酯在二氯甲烷中室溫反應(yīng)4h得到通式(I)化合物O。

再一方面，本發(fā)明提供一種用于克服炎癥、炎癥相關(guān)疾病、腫瘤及窒息性氣體或刺激性氣體造成的急性肺損傷疾病藥物組合物，其包含上述式I的化合物，或它們的異構(gòu)體、藥學(xué)上可接受的鹽、溶劑化物或N-氧化物，以及至少一種藥學(xué)上可接受的載體。

再一方面，本發(fā)明提供一種藥物組合物，其包含上述式I的化合物，或它們的異構(gòu)體、藥學(xué)上可接受的鹽、溶劑化物或N-氧化物，另外包含一種或多種克服炎癥、炎癥相關(guān)疾病、腫瘤及窒息性氣體或刺激性氣體造成的急性肺損傷疾病藥物組合物，其包含上述式I的化合物，以及至少一種藥學(xué)上可接受的載體。

再一方面，本發(fā)明提供上述式I的化合物，或它們的異構(gòu)體、藥學(xué)上 可接受的鹽、溶劑化物或N-氧化物，它們用作克服炎癥、炎癥相關(guān)疾病、腫瘤及窒息性氣體或刺激性氣體造成的急性肺損傷疾病藥物。

再一方面，本發(fā)明提供一種克服炎癥、炎癥相關(guān)疾病、腫瘤及窒息性氣體或刺激性氣體造成的急性肺損傷疾病的方法，其包括向該受試者給予治療有效量的上述式I的化合物，或它們的異構(gòu)體、藥學(xué)上可接受的鹽、溶劑化物或N-氧化物，并且任選聯(lián)合給予一種或多種其它抗炎藥物。

再一方面，本發(fā)明提供上述式I的化合物或它們的異構(gòu)體、藥學(xué)上可接受的鹽、溶劑化物或N-氧化物在制備藥物中的用途，其中所述藥物用于克服炎癥、炎癥相關(guān)疾病、腫瘤及窒息性氣體或刺激性氣體造成的急性肺損傷疾病。

現(xiàn)將本申請(qǐng)說(shuō)明書和權(quán)利要求書中出現(xiàn)的用于描述本發(fā)明的術(shù)語(yǔ)定義如下。對(duì)于特定的術(shù)語(yǔ)，如果本申請(qǐng)中定義的含義與本領(lǐng)域技術(shù)人員通常理解的含義不一致，則以本申請(qǐng)中定義的含義為準(zhǔn)；如果在本申請(qǐng)中沒有定義，則其具有本領(lǐng)域技術(shù)人員通常理解的含義。

本發(fā)明中使用的術(shù)語(yǔ)“烷基”是指直鏈或支鏈一價(jià)飽和烴基?！癈₁-C₁₀烷基”是指具有1～10個(gè)碳原子的直鏈或支鏈烷基，例如甲基、乙基、丙基、異丙基、正丁基、仲丁基、叔丁基、戊基、2-戊基、異戊基、新戊基、己基、2-己基、3-己基、3-甲基戊基、庚基和辛基等。術(shù)語(yǔ)“C₁-C₆烷基”意指具有1～6，即1、2、3、4、5或6個(gè)碳原子的直鏈或支鏈烷基，典型地為甲基、乙基、正丙基、異丙基、正丁基、異丁基、叔丁基、戊基和己基等。相似地，術(shù)語(yǔ)“C₁-C₃烷基”意指具有1、2或3個(gè)碳原子的直鏈或支鏈烷基， 即甲基、乙基、正丙基和異丙基。本發(fā)明中的烷基優(yōu)選是C₁-C₆烷基，更優(yōu)選是C₁-C₃烷基。

本發(fā)明中使用的術(shù)語(yǔ)“鹵素”是指氟、氯、溴以及碘原子。

本發(fā)明中使用的術(shù)語(yǔ)“芳香基”是指包含至少一個(gè)不飽和芳環(huán)的任選被取代的單環(huán)或二環(huán)烴環(huán)系統(tǒng)，優(yōu)選具有6～10，即6、7、8、9或10個(gè)碳原子的芳基。本發(fā)明中的芳香基的實(shí)例包括苯基、萘基、1，2，3，4-四氫萘基、吲哚基和茚基等。本發(fā)明中的芳香基可以被以下基團(tuán)取代：C₁-C₆烷基、C₁-C₆烷氧基、腈基、鹵素、羥基、氨基、硝基、單(C₁-C₆)烷基氨基、二(C₁-C₆)烷基氨基、C₂-C₆烯基、C₂-C₆炔基、C₁-C₆鹵代烷基或C₁-C₆鹵代烷氧基。

本發(fā)明中使用的術(shù)語(yǔ)“芳香雜環(huán)基”是指包含至少一個(gè)獨(dú)立地選自N、O或S的雜原子的任選被取代的單環(huán)或雙環(huán)不飽和芳環(huán)系統(tǒng)，優(yōu)選具有5～10，即5、6、7、8、9或10個(gè)原子的芳香雜環(huán)基。“芳香雜環(huán)基”的實(shí)例包括但不限于噻吩基、吡啶基、噻唑基、異噻唑基、呋喃基、吡咯基、三唑基、咪唑基、三嗪基、噁二唑基、噁唑基、異噁唑基、吡唑基、咪唑酮基、噁唑、噻唑酮基、四唑基、噻二唑基、苯并咪唑基、苯并噁唑基、苯并噻唑基、四氫三唑并吡啶基、四氫三唑并嘧啶基、苯并呋喃基、苯并噻吩基、硫茚基、吲哚基、異吲哚基、吡啶酮基、噠嗪基、吡嗪基、嘧啶基、喹啉基、酞嗪基、喹喔啉基、喹唑啉基、咪唑并吡啶基、噁唑并吡啶基、噻唑并吡啶基、咪唑并噠嗪基、噁唑并噠嗪基、噻唑并噠嗪基、蝶啶基、呋咱基、苯并三唑基、吡唑并吡啶基和嘌呤基等。本發(fā)明中的雜芳基可以被以下基團(tuán)取代：C₁-C₆烷基、C₁-C₆烷氧基、腈基、鹵素、羥基、氨基、硝基、單(C₁-C₆)烷基氨基、二(C₁-C₆)烷基氨基、C₂-C₆烯基、C₂-C₆炔基、C₁-C₆鹵代烷基或C₁-C₆鹵代烷氧基。

本發(fā)明中使用的術(shù)語(yǔ)“環(huán)烷基”是指3、4、5、6、7、8、9或10個(gè)碳原子的飽和碳環(huán)基團(tuán)。該環(huán)烷基可以是單環(huán)或者多環(huán)稠合系統(tǒng)，而且可以稠合在芳環(huán)上。這些基團(tuán)的實(shí)例包括環(huán)丙基、環(huán)丁基、環(huán)戊基和環(huán)己基等。 本文的環(huán)烷基可以是未取代的，或者在一個(gè)或多個(gè)可取代的位置被合適的基團(tuán)取代。例如，本發(fā)明中的環(huán)烷基可任選被以下基團(tuán)取代：C₁-C₆烷基、C₁-C₆烷氧基、腈基、鹵素、羥基、氨基、硝基、單(C₁-C₆)烷基氨基、二(C₁-C₆)烷基氨基、C₂-C₆烯基、C₂-C₆炔基、C₁-C₆鹵代烷基或C₁-C₆鹵代烷氧基。

本發(fā)明中使用的術(shù)語(yǔ)“雜環(huán)基”是指包含至少一個(gè)和最多四個(gè)獨(dú)立地選自N、O或S的雜原子的任選被取代的單環(huán)和雙環(huán)飽和、部分飽和或不飽和的環(huán)狀系統(tǒng)，優(yōu)選具有4～10，即4、5、6、7、8、9或10個(gè)原子的5、6或7元雜環(huán)基，條件是該雜環(huán)基的環(huán)不含兩個(gè)相鄰的O或S原子。優(yōu)選的雜環(huán)基包括但不限于吡咯烷基、四氫呋喃基、二氫呋喃基、四氫噻吩基、哌啶基、嗎啉基或哌嗪基等。本發(fā)明中的雜環(huán)基可以被以下基團(tuán)取代：C₁-C₆烷基、C₁-C₆烷氧基、腈基、鹵素、羥基、氨基、硝基、單(C₁-C₆)烷基氨基、二(C₁-C₆)烷基氨基、C₂-C₆烯基、C₂-C₆炔基、C₁-C₆鹵代烷基或C₁-C₆鹵代烷氧基。

本發(fā)明中使用的術(shù)語(yǔ)“芳基烷基”是指被一個(gè)或多個(gè)如上定義的芳基取代的如上定義的烷基。優(yōu)選的芳基烷基是芳基-C₁-C₃烷基。本發(fā)明中的芳基烷基的實(shí)例包括芐基和苯基乙基等。

本發(fā)明中使用的術(shù)語(yǔ)“芳香雜環(huán)基烷基”是指被如上定義的芳香雜環(huán)基取代的如上定義的烷基。更優(yōu)選的芳香雜環(huán)基烷基是5-或6-元雜芳基-C₁-C₃-烷基。本發(fā)明中的雜芳基烷基的實(shí)例包括吡啶基乙基等。

本發(fā)明中使用的術(shù)語(yǔ)“雜環(huán)基烷基”是指被如上定義的雜環(huán)基取代的如上定義的烷基。更優(yōu)選的雜環(huán)基烷基是5或6元雜環(huán)基-C₁-C₃-烷基。本發(fā)明中的雜環(huán)基烷基的實(shí)例包括四氫吡喃基甲基。

本發(fā)明中使用的術(shù)語(yǔ)“藥學(xué)上可接受的鹽”意指在制藥上可接受的并且具有母體化合物的所需藥理學(xué)活性的本發(fā)明化合物的鹽。這類鹽包括：與 無(wú)機(jī)酸或與有機(jī)酸形成的酸加成的鹽，所述的無(wú)機(jī)酸諸如鹽酸，氫溴酸，硫酸，硝酸，磷酸等；所述的有機(jī)酸諸如乙酸，丙酸，己酸，環(huán)戊丙酸，乙醇酸，丙酮酸，乳酸，丙二酸，琥珀酸，蘋果酸，馬來(lái)酸，富馬酸，酒石酸，檸檬酸，苯甲酸，肉桂酸，扁桃酸，甲磺酸，乙磺酸，苯磺酸，萘磺酸，樟腦磺酸，葡庚糖酸，葡糖酸，谷氨酸，羥基萘甲酸，水楊酸，硬脂酸，粘康酸等；或在母體化合物上存在的酸性質(zhì)子被金屬離子，例如堿金屬離子或堿土金屬離子取代時(shí)形成的鹽；或與有機(jī)堿形成的配位化合物，所述的有機(jī)堿諸如乙醇胺，二乙醇胺，三乙醇胺，N-甲基葡糖胺等。

本發(fā)明中使用的術(shù)語(yǔ)“溶劑化物”意指本發(fā)明化合物與制藥上可接受的溶劑結(jié)合形成的物質(zhì)。制藥上可接受的溶劑包括水，乙醇，乙酸等。溶劑化物包括化學(xué)計(jì)算量的溶劑合物和非化學(xué)計(jì)算量的溶劑合物，優(yōu)選為水合物。本發(fā)明的化合物可以用水或各種有機(jī)溶劑結(jié)晶或重結(jié)晶，在這種情況下，可能形成各種溶劑化物。

本發(fā)明的藥物組合物包括有效劑量的本發(fā)明式式I化合物或其異構(gòu)體、藥學(xué)上可接受的鹽或水合物和一種或多種適宜的藥學(xué)上可接受的載體。這里的藥用載體包括但不限于：離子交換劑，氧化鋁，硬脂酸鋁，卵磷脂，血清蛋白如人血白蛋白，緩沖物質(zhì)如磷酸鹽，甘油，山梨酸，山梨酸鉀，飽和植物脂肪酸的部分甘油酯混合物，水，鹽或電解質(zhì)，如硫酸魚精蛋白，磷酸氫二鈉，磷酸氫鉀，氯化鈉，鋅鹽，膠態(tài)氧化硅，三硅酸鎂，聚乙烯吡咯烷酮，纖維素物質(zhì)，聚乙二醇，羧甲基纖維素鈉，聚丙烯酸酯，蜂蠟，羊毛脂。

本發(fā)明化合物的藥物組合物可以以下面的任意方式施用：口服，噴霧吸入，直腸用藥，鼻腔用藥，頰部用藥，局部用藥，非腸道用藥，如皮下，靜脈，肌內(nèi)，腹膜內(nèi)，鞘內(nèi)，心室內(nèi)，胸骨內(nèi)和顱內(nèi)注射或輸入，或借助一種外植儲(chǔ)器用藥。其中優(yōu)選口服、腹膜內(nèi)或靜脈內(nèi)給藥方式。

當(dāng)口服用藥時(shí)，本發(fā)明化合物可制成任意口服可接受的制劑形式，包括但不限于片劑、膠囊、水溶液或水懸浮液。其中，片劑使用的載體一般包括乳糖和玉米淀粉，另外也可加入潤(rùn)滑劑如硬脂酸鎂。膠囊制劑使用的稀釋劑一般包括乳糖和干燥玉米淀粉。水懸浮液制劑則通常是將活性成分與適宜的乳化劑和懸浮劑混合使用。如果需要，以上口服制劑形式中還可加入一些甜味劑、芳香劑或著色劑。

當(dāng)局部用藥時(shí)，特別是治療局部外敷容易達(dá)到的患面或器官，如眼睛、皮膚或下腸道神經(jīng)性疾病時(shí)，可根據(jù)不同的患面或器官將本發(fā)明化合物制成不同的局部用藥制劑形式，具體說(shuō)明如下：

當(dāng)眼部局部施用時(shí)，本發(fā)明化合物可配制成一種微粉化懸浮液或溶液的制劑形式，所使用載體為等滲的一定pH的無(wú)菌鹽水，其中可加入也可不加防腐劑如氯化芐基烷醇鹽。對(duì)于眼用，也可將化合物制成膏劑形式如凡士林膏。

當(dāng)皮膚局部施用時(shí)，本發(fā)明化合物可制成適當(dāng)?shù)能浉唷⑾磩┗蛩獎(jiǎng)┲苿┬问?，其中將活性成分懸浮或溶解于一種或多種載體中。軟膏制劑可使用的載體包括但不限于：礦物油，液體凡士林，白凡士林，丙二醇，聚氧化乙烯，聚氧化丙烯，乳化蠟和水；洗劑或霜?jiǎng)┛墒褂玫妮d體包括但不限于：礦物油，脫水山梨糖醇單硬脂酸酯，吐溫60，十六烷酯蠟，十六碳烯芳醇，2-辛基十二烷醇，芐醇和水。

本發(fā)明化合物還可以無(wú)菌注射制劑形式用藥，包括無(wú)菌注射水或油懸浮液或無(wú)菌注射溶液。其中，可使用的載體和溶劑包括水、林格氏溶液和等滲氯化鈉溶液。另外，滅菌的非揮發(fā)油也可用作溶劑或懸浮介質(zhì)，如單甘油酯或二甘油酯。

具體實(shí)施方式

下面的具體實(shí)施例是本發(fā)明的優(yōu)選實(shí)施方案，其不應(yīng)理解為對(duì)本發(fā)明構(gòu)成任何限制。

化合物的熔點(diǎn)由RY-1熔點(diǎn)儀測(cè)定，溫度計(jì)未較正。質(zhì)譜由Micromass ZabSpec高分辨率質(zhì)譜儀(分辨率1000)測(cè)定。¹H NMR由JNM-ECA-400超導(dǎo)NMR儀測(cè)定，工作頻率¹H NMR 400MHz，¹³C NMR 100MHz。

實(shí)施例

實(shí)施例1 5-【2-((3-(3-(叔丁基)-1-對(duì)甲基苯基-1H-吡唑-5基)脲)甲基)苯氧基】-N-乙基-1H-吲唑-1-酰胺

在250mL茄型瓶中加入100mL乙醇，(30mmol)特戊酰基乙腈，(33.63mmol)4-甲基苯肼，攪拌下滴加3.6mL濃鹽酸，加熱回流8小時(shí)，冷卻，濃縮，殘余物用稀氫氧化鈉調(diào)pH10-11，用乙酸乙酯提取三次，無(wú)水硫酸鈉干燥，濃縮，得到的固體用乙酸乙酯/石油醚重結(jié)晶得到白色晶體C，收率80.3％。5-叔丁基-2-對(duì)甲基苯基-3-氨基吡唑(3.5mmolC)置于100ml三頸瓶中，以30ml四氫呋喃溶解，將三頸瓶置于低溫槽降溫至-20℃，攪拌下分批加入2.9g碳酸氫鈉，15min后，逐滴滴加氯甲酸三氯乙酯(3.5mmol)，控制溶液溫度不超過(guò)0℃，滴加完畢后，繼續(xù)攪拌30min，然后升溫至0℃反應(yīng)12h.反應(yīng)完畢，混 合物過(guò)濾，濾渣用乙酸乙酯沖洗，濾液濃縮，收率85％。

7.9g 2-氟-苯睛I溶于50ml DMSO中，分批加入27g碳酸鉀?；旌弦菏覝?cái)嚢?0min。稱取4.78 g3-甲基-4-氨基苯酚J加入反應(yīng)液，將混合液加熱至90℃，反應(yīng)12h。反應(yīng)畢。反應(yīng)液倒入200ml冰水，置于冰箱中，3h后，取出，有黃色固體K析出，過(guò)濾，干燥。收率93％。0.8g 2-(4-胺-3-甲基苯氧基)苯腈K溶于30ml無(wú)水甲苯，依次加入1.14g醋酸酐和0.3g乙酸鈉。混合液置于油浴中，加熱至80℃，逐滴加入0.6g亞硝酸異戊酯，反應(yīng)8h，反應(yīng)完畢，反應(yīng)液過(guò)濾，濃縮，以柱層析分離產(chǎn)物L(fēng)，收率80％。稱取0.35g四氫鋰鋁加入15ml無(wú)水四氫呋喃中，反應(yīng)瓶置于冰浴中，稱取0.8g 2-((1-乙酰基-1H-吲唑-5-基)氧基)苯腈L溶10ml無(wú)水四氫呋喃，溶液逐滴滴入四氫鋰鋁的混懸液，滴加完畢后，65℃回流攪拌1h。反應(yīng)畢，混合液中加入乙醇至無(wú)氣泡產(chǎn)生，過(guò)濾，濃縮，以柱層析分離產(chǎn)物M，產(chǎn)率73％。

在50mL三口瓶中加入20mL二甲亞砜，加入化合物0.5mmol2，2，2-三氯乙基-(3-叔丁基-1-(4-甲基-苯基)-1H-吡唑-5-基)酰胺D，再加入化合物2-((1H-吲唑-5-基)氧基)苯甲胺M 0.5mmol，滴加0.5ml三乙胺入反應(yīng)，加熱80℃反應(yīng)1小時(shí)。冷卻，倒入150ml水中，用乙酸乙酯提取3次，有機(jī)層用飽和氯化鈉洗滌3次，無(wú)水硫酸鈉干燥過(guò)夜，濃縮，柱層析分離產(chǎn)物N，產(chǎn)率58％。取中間體N 0.5mmol加入50ml單口瓶中，用20ml DCM和1ml DMSO混合溶劑溶解，向反應(yīng)液中加入2.5mmol的乙基異氰酸酯，室溫反應(yīng)4h，反應(yīng)液倒入50ml水中，二氯甲烷提取3次，無(wú)水硫酸鈉干燥過(guò)夜，濃縮，柱層析分離得終產(chǎn)物0，產(chǎn)率81％。

¹H-NMR(400MHz，DMSO-d₆)

δ：9.05(t，1H)，8.77(s，1H)，8.57(s，1H)，8.30(d，2H)，7.81(d，2H)，7.71(d，1H)，7.30(m，2H)，7.22(m，1H)，7.15(m，1H)，6.99(m，2H)，6.93(d，1H)，6.29(s，1H)，4.26(d，2H)，3.31(m，2H)，2.39(s，3H)，1.27(s，9H)，1.16(t，3H).(M+H)+：566.Mp：171-173℃.

實(shí)施例2 5-【2-((3-(3-(叔丁基)-1-對(duì)硝基苯基-1H-吡唑-5基)脲)甲基)苯氧基】-N-乙基-1H-吲唑-1-酰胺

采用實(shí)施例1的方法，將其中的對(duì)甲基苯肼改為對(duì)硝基苯肼，得白色固體。

¹H-NMR(400MHz，DMSO-d₆)

δ：9.05(t，1H)，8.77(s，1H)，8.57(s，1H)，8.30(d，2H)，7.81(d，2H)，7.71(d，1H)，7.30(m，2H)，7.22(m，1H)，7.15(m，1H)，6.99(m，2H)，6.93(d，1H)，6.29(s，1H)，4.26(d，2H)，3.31(m，2H)，1.27(s，9H)，1.16(t，3H).(M+H)+：597.Mp：156-158℃。

實(shí)施例3 5-【2-((3-(3-(叔丁基)-1-對(duì)氟苯基-1H-吡唑-5基)脲)甲基)苯氧基】-N-乙基-1H-吲唑-1-酰胺

采用實(shí)施例1的方法，將其中的對(duì)甲基苯肼改為對(duì)氟苯肼，得白色固體。

¹H-NMR(400MHz，DMSO-d₆)

δ：9.06(t，1H)，8.77(s，1H)，8.28(s，1H)，7.71(d，2H)，7.49(d，2H)，7.29(m，4H)，7.23(m，1H)，7.20(m，1H)，6.90(m，3H)，4.25(d，2H)，3.30(m，2H)，1.23(s，9H)，1.14(t，3H).(M+H)+：570.Mp：166-168℃。

實(shí)施例4 5-【2-((3-(3-(叔丁基)-1-苯基-1H-吡唑-5基)脲)甲基)苯氧基】-N-乙基-1H-吲唑-1-酰胺

采用實(shí)施例1的方法，將其中的對(duì)甲基苯肼改為苯肼，得白色固體。

¹H-NMR(400MHz，DMSO-d₆)

δ：9.04(t，1H)，8.74(s，1H)，8.34(s，1H)，7.61(d，2H)，7.49(d，2H)，7.45(m，1H)7.26(m，4H)，7.19(m，1H)，7.10(m，1H)，6.92(m，3H)，4.20(d，2H)，3.30(m，2H)，1.24(s，9H)，1.13(t，3H).(M+H)+：552.Mp：171-173℃。

實(shí)施例5 5-【2-((3-(3-(叔丁基)-1-苯基-1H-吡唑-5基)脲)甲基)苯氧基】-N-(2-氯乙基)-1H-吲唑-1-酰胺

采用實(shí)施例1的方法，將其中的對(duì)甲基苯肼改為苯肼，乙基異氰酸酯改為2-氯乙基異氰酸酯，得白色固體。

¹H-NMR(400MHz，DMSO-d₆)

δ：9.01(t，1H)，8.71(s，1H)，8.24(s，1H)，7.60(d，2H)，7.41(d，2H)，7.40(m，1H)7.23(m，4H)，7.14(m，1H)，7.10(m，1H)，6.92(m，3H)，4.20(d，2H)，3.53(m，2H)，3.30(m，2H)，1.24(s，9H).(M+H)+：586.Mp：182-184℃。

實(shí)施例6 5-【2-((3-(3-(叔丁基)-1-對(duì)氟苯基-1H-吡唑-5基)脲)甲基)苯氧基】-N-(2-氯乙基)-1H-吲唑-1-酰胺

采用實(shí)施例1的方法，將其中的對(duì)甲基苯肼改為對(duì)氟苯肼，乙基異氰酸酯改為2-氯乙基異氰酸酯，得白色固體。

¹H-NMR(400MHz，DMSO-d₆)

δ：9.13(t，1H)，8.75(s，1H)，8.22(s，1H)，7.71(d，1H)，7.45(m，2H)，7.27(m，4H)，7.25(m，1H)，7.20(m，1H)，6.97(m，3H)，6.13(s.1H)，4.21(d，2H)，3.70(m，2H)，3.53(m，2H)，1.20(s，9H).(M+H)+：604.Mp：199-201℃。

實(shí)施例7 5-【2-((3-(3-(叔丁基)-1-對(duì)甲基苯基-1H-吡唑-5基)脲)甲基)苯氧基】-N-(2-氯乙基)-1H-吲唑-1-酰胺

采用實(shí)施例1的方法，乙基異氰酸酯改為2-氯乙基異氰酸酯，得白色固體。

¹H-NMR(400MHz，DMSO-d₆)

δ：8.95(m，2H)，8.21(s，1H)，7.31(m，7H)，7.22(m，2H)，6.91(m，3H)，6.20(s，1H)，4.25(d，2H)，3.72(d，2H)，2.39(s，3H)，1.14(s，9H).(M+H)+：600.Mp：166-169℃。

實(shí)施例8 5-【2-((3-(3-(叔丁基)-1-對(duì)甲基苯基-1H-吡唑-5基)脲)甲基)苯氧基】-N-異丙基-1H-吲唑-1-酰胺

采用實(shí)施例1的方法，乙基異氰酸酯改為異丙基異氰酸酯，得白色固體。

¹H-NMR(400MHz，DMSO-d₆)

δ：8.75(m，2H)，8.20(s，1H)，7.32(m，7H)，7.21(m，2H)，6.95(m，3H)，6.21(s，1H)，4.27(d，2H)，4.00(m，1H)，2.39(s，3H)，1.25(d，6H)，1.19(s，9H).(M+H)+：580.Mp：183-185℃。

實(shí)施例9 5-【2-((3-(3-(叔丁基)-1-苯基-1H-吡唑-5基)脲)甲基)苯氧基】-N-異丙基-1H-吲唑-1-酰胺

采用實(shí)施例1的方法，將其中的對(duì)甲基苯肼改為苯肼，乙基異氰酸酯改為異丙基異氰酸酯，得白色固體。

¹H-NMR(400MHz，DMSO-d₆)

δ：8.79(m，2H)，8.29(s，1H)，7.72(d，1H)，7.45(m，4H)，7.25(m，5H)，6.91(m，3H)，6.27(s，1H)，4.31(d，2H)，4.02(m，1H)，1.24(d，6H)，1.19(s，9H).(M+H)+：56 6.Mp：172-175℃。

實(shí)施例10 5-【2-((3-(3-(叔丁基)-1-對(duì)硝基苯基-1H-吡唑-5基)脲)甲基)苯氧基】-N-異丙基-1H-吲唑-1-酰胺

采用實(shí)施例1的方法，將其中的對(duì)甲基苯肼改為對(duì)硝基苯肼，乙基異氰酸酯改為異丙基異氰酸酯，得白色固體。

¹H-NMR(400MHz，DMSO-d₆)

δ：8.73(m，2H)，8.60(s，1H)，8.29(m，3H)，7.81(m，2H)，7.70(d，1H)，7.27(m，4H)，7.25(m，1H)，7.20(m，1H)，6.33(s.1H)，4.25(d，2H)，4.02(m，1H)，1.24(d，6H)，1.18(s，9H).(M+H)+：611.Mp：177-180℃。

實(shí)施例11 5-【2-((3-(3-(叔丁基)-1-對(duì)硝基苯基-1H-吡唑-5基)脲)甲基)苯氧基】-N-叔丁基-1H-吲唑-1-酰胺

采用實(shí)施例1的方法，將其中的對(duì)甲基苯肼改為對(duì)硝基苯肼，乙基異氰酸酯改為叔丁基異氰酸酯，得白色固體。

¹H-NMR(400MHz，DMSO-d₆)

δ：8.73(m，2H)，8.60(s，1H)，8.29(m，3H)，7.81(m，2H)，7.70(d，1H)，7.27(m，4H)，7.25(m，1H)，7.20(m，1H)，6.33(s.1H)，4.25(d，2H)，1.24(s，9H)，1.18(s，9H).(M+H)+：625.Mp：166-168℃。

實(shí)施例12 5-【2-((3-(3-(叔丁基)-1-對(duì)甲基苯基-1H-吡唑-5基)脲)甲基)苯氧基】-N-叔丁基-1H-吲唑-1-酰胺

采用實(shí)施例1的方法，將其中乙基異氰酸酯改為叔丁基異氰酸酯，得白色固體。

¹H-NMR(400MHz，DMSO-d₆)

δ：8.75(m，2H)，8.20(s，1H)，7.32(m，7H)，7.21(m，2H)，6.95(m，3H)，6.21(s，1H)，4.27(d，2H)，4.00(m，1H)，2.39(s，3H)，1.25(d，6H)，1.23(s，9H)，1.19(s，9H).(M+H)+：594.Mp：181-183℃。

實(shí)施例13 5-【2-((3-(3-(叔丁基)-1-苯基-1H-吡唑-5基)脲)甲基)苯氧基】-N-叔丁基-1H-吲唑-1-酰胺

采用實(shí)施例1的方法，將其中對(duì)甲基苯肼改為苯肼，乙基異氰酸酯改為叔丁基異氰酸酯，得白色固體。

¹H-NMR(400MHz，DMSO-d₆)

δ：8.79(m，2H)，8.29(s，1H)，7.72(d，1H)，7.45(m，4H)，7.25(m，5H)，6.91(m，3H)，6.27(s，1H)，4.30(d，2H)，1.24(d，9H)，1.19(s，9H).(M+H)+：580.Mp：190-192℃。

實(shí)施例14 5-【2-((3-(3-(叔丁基)-1-對(duì)氟苯基-1H-吡唑-5基)脲)甲基)苯氧基】-N-叔丁基-1H-吲唑-1-酰胺

采用實(shí)施例1的方法，將其中對(duì)甲基苯肼改為對(duì)氟苯肼，乙基異氰酸酯改為叔丁基異氰酸酯，得白色固體。

¹H-NMR(400MHz，DMSO-d₆)

δ：9.13(t，1H)，8.75(s，1H)，8.22(s，1H)，7.71(d，1H)，7.45(m，2H)，7.27(m，4H)，7.25(m，1H)，7.20(m，1H)，6.97(m，3H)，6.13(s.1H)，4.21(d，2H)，1.24(s，9H)，1.18(s，9H).(M+H)+：598.Mp：188-190℃。

實(shí)施例15 5-【2-((3-(3-(叔丁基)-1-對(duì)氟苯基-1H-吡唑-5基)脲)甲基)苯氧基】-N-環(huán)己基-1H-吲唑-1-酰胺

采用實(shí)施例1的方法，將其中對(duì)甲基苯肼改為對(duì)氟苯肼，乙基異氰酸酯改為環(huán)己基異氰酸酯，得白色固體。

¹H-NMR(400MHz，DMSO-d₆)

δ：8.75(m，2H)，8.20(s，1H)，7.32(m，7H)，7.21(m，2H)，6.95(m，3H)，6.21(s，1H)，4.27(d，2H)，3.68(m，1H)，1.25(d，6H)，1.59(m，10H)1.19(s，9H).(M+H)+：624.Mp：172-174℃。

實(shí)施例16 5-【2-((3-(3-(叔丁基)-1-對(duì)甲基苯基-1H-吡唑-5基)脲)甲基)苯氧基】-N-環(huán)己基-1H-吲唑-1-酰胺

采用實(shí)施例1的方法，將其中乙基異氰酸酯改為環(huán)己基異氰酸酯，得白色固體。

¹H-NMR(400MHz，DMSO-d₆)

δ：8.75(m，2H)，8.20(s，1H)，7.32(m，7H)，7.21(m，2H)，6.95(m，3H)，6.21(s，1H)，4.27(d，2H)，3.68(m，1H)，2.39(s，3H)，1.25(d，6H)，1.59(m，6H)，1.19(s，9H)，0.85(m，4H).(M+H)+：620.Mp：134-136℃。

實(shí)施例17 5-【2-((3-(3-(叔丁基)-1-對(duì)硝基苯基-1H-吡唑-5基)脲)甲基)苯氧基】-N-環(huán)己基-1H-吲唑-1-酰胺

采用實(shí)施例1的方法，將其中對(duì)甲基苯肼改為對(duì)硝基苯肼，乙基異氰酸酯改為環(huán)己基異氰酸酯，得白色固體。

¹H-NMR(400MHz，DMSO-d₆)

δ：8.72(m，2H)，8.21(s，1H)，7.29(m，7H)，7.21(m，2H)，6.95(m，3H)，6.21(s，1H)，4.27(d，2H)，3.68(m，1H)，1.59(m，6H)，1.19(s，9H)，0.85(m，4H).(M+H)+：651.Mp：172-174℃。

實(shí)施例18 5-【2-((3-(3-(叔丁基)-1-苯基-1H-吡唑-5基)脲)甲基)苯氧基】-N-環(huán)己基-1H-吲唑-1-酰胺

采用實(shí)施例1的方法，將其中對(duì)甲基苯肼改為苯肼，乙基異氰酸酯改為環(huán)己基異氰酸酯，得白色固體。

¹H-NMR(400MHz，DMSO-d₆)

δ：8.79(m，2H)，8.29(s，1H)，7.72(d，1H)，7.45(m，4H)，7.25(m，5H)，6.91(m，3H)，6.27(s，1H)，4.31(d，2H)，4.02(m，1H)，1.24(m，6H)，1.19(s，9H)，0.84(m，4H).(M+H)+：606.Mp：167-169℃。

實(shí)施例19 5-【2-((3-(3-(叔丁基)-1-苯基-1H-吡唑-5基)脲)甲基)苯氧基】-N-環(huán)戊基-1H-吲唑-1-酰胺

采用實(shí)施例1的方法，將其中對(duì)甲基苯肼改為苯肼，乙基異氰酸酯改為環(huán)戊基異氰酸酯，得白色固體。

¹H-NMR(400MHz，DMSO-d₆)

δ：8.78(m，2H)，8.23(s，1H)，7.73(d，1H)，7.40(m，4H)，7.25(m，5H)，6.91(m，3H)，6.27(s，1H)，4.31(d，2H)，4.08(m，1H)，1.24(m，8H)，1.19(s，9H).(M+H)+：592.Mp：158-160℃。

實(shí)施例20 5-【2-((3-(3-(叔丁基)-1-對(duì)硝基苯基-1H-吡唑-5基)脲)甲基)苯氧基】-N-環(huán)戊基-1H-吲唑-1-酰胺

采用實(shí)施例1的方法，將其中對(duì)甲基苯肼改為對(duì)硝基苯肼，乙基異氰酸酯改為環(huán)戊基異氰酸酯，得白色固體。

¹H-NMR(400MHz，DMSO-d₆)

δ：8.72(m，2H)，8.21(s，1H)，7.29(m，7H)，7.21(m，2H)，6.95(m，3H)，6.21(s，1H)，4.27(d，2H)，3.68(m，1H)，1.90(m，2H)，1.69(m，4H)，1.53(m，2H)，1.25(s，9H).(M+H)+：637.Mp：173-175℃。

實(shí)施例21 5-【2-((3-(3-(叔丁基)-1-對(duì)甲基苯基-1H-吡唑-5基)脲)甲基)苯氧基】-N-環(huán)戊基-1H-吲唑-1-酰胺

采用實(shí)施例1的方法，將其中乙基異氰酸酯改為環(huán)戊基異氰酸酯，得白色固體。

¹H-NMR(400MHz，DMSO-d₆)

δ：8.81(m，2H)，8.27(s，1H)，7.29(m，7H)，7.21(m，2H)，6.95(m，3H)，6.21(s，1H)，4.27(d，2H)，3.68(m，1H)，2.34(s，3H)1.90(m，2H)，1.69(m，4H)，1.53(m，2H)，1.25(s，9H).(M+H)+：606.Mp：166-168℃。

實(shí)施例22 5-【2-((3-(3-(叔丁基)-1-對(duì)甲基苯基-1H-吡唑-5基)脲)甲基)-4-氟苯氧基】-N-環(huán)戊基-1H-吲唑-1-酰胺

采用實(shí)施例1的方法，將其中2-氰基氟苯改為4-氟-2-氰基氟苯，乙基異氰酸酯改為環(huán)戊基異氰酸酯，得白色固體。

¹H-NMR(400MHz，DMSO-d₆)

δ：8.86(d，1H)，8.76(s，1H)，8.28(s，1H)，7.74(d，1H)，7.33(m，2H)，7.22(m，3H)，7.03(m，5H)，6.21(s，1H)，4.25(d，2H)，4.18(m，1H)，2.34(s，3H)，1.90(m，2H)，1.69(m，4H)，1.53(m，2H)，1.25(s，9H).(M+H)+：624.Mp：171-173℃。

實(shí)施例23 5-【2-((3-(3-(叔丁基)-1-對(duì)硝基苯基-1H-吡唑-5基)脲)甲基)-4-氟苯氧基】-N-環(huán)戊基-1H-吲唑-1-酰胺

采用實(shí)施例1的方法，將其中2-氰基氟苯改為4-氟-2-氰基氟苯，對(duì)甲基苯肼改為對(duì)硝基苯肼，乙基異氰酸酯改為環(huán)戊基異氰酸酯，得白色固體。

¹H-NMR(400MHz，DMSO-d₆)

δ：8.79(d，1H)，8.76(s，1H)，8.28(s，1H)，7.74(d，1H)，7.33(m，2H)，7.22(m，3H)，7.03(m，5H)，6.21(s，1H)，4.25(d，2H)，4.18(m，1H)，1.90(m，2H)，1.69(m，4H)，1.53(m，2H)，1.25(s，9H).(M+H)+：655.Mp：172-174℃。

實(shí)施例24 5-【2-((3-(3-(叔丁基)-1-對(duì)硝基苯基-1H-吡唑-5基)脲)甲基)-4-氟苯氧基】-N-環(huán)己基-1H-吲唑-1-酰胺

采用實(shí)施例1的方法，將其中2-氰基氟苯改為4-氟-2-氰基氟苯，對(duì)甲基苯肼改為對(duì)硝基苯肼，乙基異氰酸酯改為環(huán)己基異氰酸酯，得白色固體。

¹H-NMR(400MHz，DMSO-d₆)

δ：8.78(d，1H)，8.74(s，1H)，8.28(s，1H)，7.74(d，1H)，7.33(m，2H)，7.22(m，3H)，7.03(m，5H)，6.21(s，1H)，4.25(d，2H)，4.18(m，1H)，1.53(m，6H)，1.25(s，9H)，0.85(m，4H).(M+H)+：669.Mp：163-165℃。

實(shí)施例25 5-【2-((3-(3-(叔丁基)-1-對(duì)甲基苯基-1H-吡唑-5基)脲)甲基)-4-氟苯氧基】-N-環(huán)己基-1H-吲唑-1-酰胺

采用實(shí)施例1的方法，將其中2-氰基氟苯改為4-氟-2-氰基氟苯，乙基異氰酸酯改為環(huán)己基異氰酸酯，得白色固體。

¹H-NMR(400MHz，DMSO-d₆)

δ：8.77(d，1H)，8.74(s，1H)，8.28(s，1H)，7.74(d，1H)，7.33(m，2H)，7.22(m，3H)，7.03(m，5H)，6.21(s，1H)，4.25(d，2H)，4.18(m，1H)，2.45(s，3H)，1.53(m，6H)，1.25(s，9H)，0.95(m，4H).(M+H)+：638.Mp：171-173℃。

實(shí)施例26 5-【2-((3-(3-(叔丁基)-1-對(duì)甲基苯基-1H-吡唑-5基)脲)甲基)-4-氟苯氧基】-N-異丙基-1H-吲唑-1-酰胺

采用實(shí)施例1的方法，將其中2-氰基氟苯改為4-氟-2-氰基氟苯，乙基異氰酸酯改為異丙基異氰酸酯，得白色固體。

¹H-NMR(400MHz，DMSO-d₆)

δ：8.77(d，1H)，8.74(s，1H)，8.26(s，1H)，7.74(d，1H)，7.33(m，2H)，7.22(m，3H)，7.03(m，5H)，6.21(s，1H)，4.25(d，2H)，4.18(m，1H)，3.69(s，1H)，2.45(s，3H)，1.27(m，6H)，1.25(s，9H).(M+H)+：598.Mp：163-165℃。

實(shí)施例27 5-【2-((3-(3-(叔丁基)-1-對(duì)硝基苯基-1H-吡唑-5基)脲)甲基)-4-氟苯氧基】-N-異丙基-1H-吲唑-1-酰胺

采用實(shí)施例1的方法，將其中2-氰基氟苯改為4-氟-2-氰基氟苯，對(duì)甲基苯肼改為對(duì)硝基苯肼，乙基異氰酸酯改為環(huán)己基異氰酸酯，得白色固體。

¹H-NMR(400MHz，DMSO-d₆)

δ：8.77(d，1H)，8.74(s，1H)，8.28(s，1H)，7.74(d，1H)，7.33(m，2H)，7.22(m，3H)，7.03(m，5H)，6.21(s，1H)，4.25(d，2H)，4.16(m，1H)，1.26(m，6H)，1.25(s，9H).(M+H)+：629.Mp：153-155℃。

實(shí)施例28 5-【2-((3-(3-(叔丁基)-1-對(duì)硝基苯基-1H-吡唑-5基)脲)甲基)-4-氟苯氧基】-N-叔丁基-1H-吲唑-1-酰胺

采用實(shí)施例1的方法，將其中2-氰基氟苯改為4-氟-2-氰基氟苯，對(duì)甲基苯肼改為對(duì)硝基苯肼，乙基異氰酸酯改為叔丁基異氰酸酯，得白色固體。

¹H-NMR(400MHz，DMSO-d₆)

δ：8.77(d，1H)，8.74(s，1H)，8.28(s，1H)，7.74(d，1H)，7.33(m，2H)，7.22(m，3H)，7.03(m，5H)，6.21(s，1H)，4.25(d，2H)，1.41(s，9H)，1.25(s，9H).(M+H)+：643.Mp：179-181℃。

實(shí)施例29 5-【2-((3-(3-(叔丁基)-1-對(duì)甲基苯基-1H-吡唑-5基)脲)甲基)-4-氟苯氧基】-N-叔丁基-1H-吲唑-1-酰胺

采用實(shí)施例1的方法，將其中2-氰基氟苯改為4-氟-2-氰基氟苯，乙基異氰酸酯改為叔丁基異氰酸酯，得白色固體。

¹H-NMR(400MHz，DMSO-d₆)

δ：8.76(d，1H)，8.74(s，1H)，8.28(s，1H)，7.74(d，1H)，7.33(m，2H)，7.22(m，3H)，7.03(m，5H)，6.21(s，1H)，4.25(d，2H)，2.45(s，3H)，1.41(s，9H)，1.25(s，9H).(M+H)+：612.Mp：151-153℃。

實(shí)施例30 5-【2-((3-(3-(叔丁基)-1-對(duì)硝基苯基-1H-吡唑-5基)脲)甲基)-4-氟苯氧基】-N-乙基-1H-吲唑-1-酰胺

采用實(shí)施例1的方法，將其中2-氰基氟苯改為4-氟-2-氰基氟苯，對(duì)甲基苯肼改為對(duì)硝基苯肼，得白色固體。

¹H-NMR(400MHz，DMSO-d₆)

δ：9.02(d，1H)，8.74(s，1H)，8.28(s，1H)，7.74(d，1H)，7.33(m，2H)，7.22(m，3H)，7.03(m，5H)，6.21(s，1H)，4.25(d，2H)，3.30(m，2H)，1.25(s，9H)，1.13(t，3H).(M+H)+：615.Mp：148-151℃。

實(shí)施例31 5-【2-((3-(3-(叔丁基)-1-對(duì)甲基苯基-1H-吡唑-5基)脲)甲基)-4-氟苯氧基】-N-乙基-1H-吲唑-1-酰胺

采用實(shí)施例1的方法，將其中2-氰基氟苯改為4-氟-2-氰基氟苯，得白色固體。

¹H-NMR(400MHz，DMSO-d₆)

δ：8.77(d，1H)，8.74(s，1H)，8.28(s，1H)，7.74(d，1H)，7.33(m，2H)，7.22(m，3H)，7.03(m，5H)，6.21(s，1H)，4.25(d，2H)，3.30(m，2H)，2.45(s，3H)，1.25(s，9H)，1.15(t，3H).(M+H)+：584.Mp：166-169℃。

實(shí)施例32 5-【2-((3-(3-(叔丁基)-1-對(duì)甲基苯基-1H-吡唑-5基)脲)甲基)-4-氟苯氧基】-N-(2-氯乙基)-1H-吲唑-1-酰胺

采用實(shí)施例1的方法，將其中2-氰基氟苯改為4-氟-2-氰基氟苯，對(duì)甲基苯肼改為對(duì)氟苯肼，乙基異氰酸酯改為2-氯乙基異氰酸酯，得白色固體。

¹H-NMR(400MHz，DMSO-d₆)

δ：9.12(d，1H)，8.84(s，1H)，8.28(s，1H)，7.74(d，1H)，7.33(m，2H)，7.22(m，3H)，7.03(m，5H)，6.21(s，1H)，4.25(d，2H)，3.81(t，2H)，3.60(m，2H)，3.30(m，2H)，1.25(s，9H)，1.13(t，3H).(M+H)+：618.Mp：184-186℃。

實(shí)施例33 5-【2-((3-(3-(叔丁基)-1-對(duì)硝基苯基-1H-吡唑-5基)脲)甲基)-4-氟苯氧基】-N-(2-氯乙基)-1H-吲唑-1-酰胺

采用實(shí)施例1的方法，將其中2-氰基氟苯改為4-氟-2-氰基氟苯，對(duì)甲基苯肼改為對(duì)硝基苯肼，乙基異氰酸酯改為2-氯乙基異氰酸酯，得白色固體。

¹H-NMR(400MHz，DMSO-d₆)

δ：9.18(d，1H)，8.78(s，1H)，8.28(s，1H)，7.74(d，1H)，7.33(m，2H)，7.22(m，3H)，7.03(m，5H)，6.21(s，1H)，4.25(d，2H)，3.81(t，2H)，3.60(m，2H)，3.30(m，2H)，1.25(s，9H).(M+H)+：649.Mp：164-166℃。

實(shí)施例34 5-【4-氟-2-((3-(3-異丙基)脲)甲基)苯氧基】-N-(2-氯乙基)-1H-吲唑-1-酰胺

采用實(shí)施例1的方法，將其中2-氰基氟苯改為4-氟-2-氰基氟苯，以3-異丙基苯胺為原料，乙基異氰酸酯改為2-氯乙基異氰酸酯，得白色固體。

¹H-NMR(400MHz，DMSO-d₆)

δ：8.58(m，2H)，8.18(s，1H)，8.03(s，1H)，7.84(s，1H)，7.53(m，1H)，7.42(m，2H)，7.03(m，5H)，6.21(s，1H)，4.25(d，2H)，3.81(t，2H)，3.60(m，2H)，2.97(m，1H)，1.25(d，6H).(M+H)+：524.Mp：192-194℃。

實(shí)施例35 5-【2-((3-(3-異丙基)脲)甲基)苯氧基】-N-乙基-1H-吲唑-1-酰胺

采用實(shí)施例1的方法，將其中2-氰基氟苯改為4-氟-2-氰基氟苯，以3-異丙基苯胺為原料，得白色固體。

¹H-NMR(400MHz，DMSO-d₆)

δ：8.58(m，2H)，8.18(s，1H)，8.03(s，1H)，7.84(s，1H)，7.53(m，1H)，7.42(m，2H)，7.03(m，5H)，6.21(s，1H)，4.25(d，2H)，3.04(m，2H)，2.97(m，1H)，1.20(d，6H) ，1.05(t，3H).(M+H)+：490.Mp：182-184℃。

實(shí)施例36 5-【2-((3-(4-氯-3-(三氯甲基)苯基)脲基)甲基)苯氧基】-N-乙基-1H-吲唑-1-酰胺

采用實(shí)施例1的方法，將其中2-氰基氟苯改為4-氟-2-氰基氟苯，以3-三氟甲基-4-氯苯胺為原料，得白色固體。

¹H-NMR(400MHz，DMSO-d₆)

δ：9.12(m，2H)，9.03(s，1H)，8.03(s，1H)，7.74(s，1H)，7.53(m，1H)，7.42(m，2H)，7.03(m，4H)，6.21(s，1H)，4.25(d，2H)，3.81(t，2H)，3.03(m，3H)，1.19(t，2H).(M+H)+：550.Mp：177-180℃。

實(shí)施例37 5-【2-((3-(4-氯-3-(三氯甲基)苯基)脲基)甲基)苯氧基】-N-(2氯乙基)-1H-吲唑-1-酰胺

采用實(shí)施例1的方法，將其中2-氰基氟苯改為4-氟-2-氰基氟苯，以3-三氟甲基-4-氯苯胺為原料，乙基異氰酸酯改為2-氯乙基異氰酸酯，得白色固體。

¹H-NMR(400MHz，DMSO-d₆)

δ：9.15(m，2H)，9.06(s，1H)，8.06(s，1H)，7.74(s，1H)，7.53(m，1H)，7.42(m，2H)，7.03(m，4H)，6.21(s，1H)，4.25(d，2H)，3.81(t，2H)，3.23(m，2H).(M+H)+：584.Mp：156-158℃。

實(shí)施例38采用GFP-MAPKAPk2_BHK細(xì)胞模型篩選p38-MAPK抑制劑

實(shí)驗(yàn)材料與方法

儀器：IN Cell Analyzer 1000活細(xì)胞成像系統(tǒng)(美國(guó)GE公司)

細(xì)胞株：表達(dá)GFP-MAPKAPk2融合蛋白的BHK細(xì)胞株(美國(guó)GE公司)

細(xì)胞培養(yǎng)液：含1mg/ml G418和10％FBS的F12培養(yǎng)液

分析培養(yǎng)液：含10mM HEPES、0.2％BSA的F12培養(yǎng)液

固定液：12％甲醛溶液(PBS配，3×)

染色液：含1μM Hoechst 33342(美國(guó)Invitrogen公司)的PBS

化合物的配制：

激動(dòng)劑Anisomycin用DMSO配成10mM母液，用分析培養(yǎng)液配成300nM工作液。

化合物用DMSO配成30mM母液，用激動(dòng)劑即300nM Anisomycin配成1×工作液，初篩選用0.3μM、3μM和10μM三個(gè)終濃度，復(fù)篩根據(jù)化合物活性按梯度分別選用終濃度0.1nM、0.3nM、1nM、3nM、10nM、30nM、0.1μM、0.3μM、1μM、3μM、10μM中的連續(xù)七個(gè)濃度做量效關(guān)系。陽(yáng)性化合物MOL-p38-001選用終濃度0.3μM和3μM作為對(duì)照，在復(fù)篩時(shí)同時(shí)做量效關(guān)系。

以含終濃度0.3‰DMSO的分析培養(yǎng)液作為Control對(duì)照，以含終濃度0.3‰DMSO的300nM Anisomycin作為激動(dòng)劑對(duì)照。

實(shí)驗(yàn)步驟：

將穩(wěn)定表達(dá)GFP-MAPKAPk2融合蛋白的BHK細(xì)胞，37℃ 5％ CO2培養(yǎng)于含 1mg/ml G418和10％FBS的F12培養(yǎng)液中。按照細(xì)胞2.0×104個(gè)/100μl/孔種于96孔黑色底透細(xì)胞培養(yǎng)板中，37℃ 5％ CO2培養(yǎng)18-24h。配制激動(dòng)劑和化合物工作液。細(xì)胞用100μl/孔分析培養(yǎng)液洗一次，加入100μl/孔化合物工作液，實(shí)驗(yàn)設(shè)Control對(duì)照和激動(dòng)劑對(duì)照，化合物每個(gè)濃度平行重復(fù)3孔。細(xì)胞37℃ 5％ CO2孵育90min，加入室溫預(yù)暖的3×固定液50μl/孔混勻，室溫孵育20min。細(xì)胞用染色液200μl/孔洗三次，并留在200μl/孔染色液中室溫染色1hr。細(xì)胞在IN Cell Analyzer 1000活細(xì)胞成像系統(tǒng)上進(jìn)行測(cè)定。測(cè)定條件為：20倍物鏡，激發(fā)波長(zhǎng)Ex＝460nm，發(fā)射波長(zhǎng)Em＝535nm，曝光300ms檢測(cè)細(xì)胞核通道藍(lán)色熒光；激發(fā)波長(zhǎng)Ex＝475nm，發(fā)射波長(zhǎng)Em＝535nm，曝光1000ms檢測(cè)細(xì)胞質(zhì)通道綠色熒光GFP，每孔5個(gè)視野連續(xù)拍照。使用GE公司IN Cell Analyzer 1000 Nuclear Trafficking Analysis Module軟件分析細(xì)胞核轉(zhuǎn)位，計(jì)算化合物抑制核轉(zhuǎn)位的活性。

化合物抑制率(％)＝(化合物處理細(xì)胞核轉(zhuǎn)位-激動(dòng)劑處理細(xì)胞核轉(zhuǎn)位)/(Control對(duì)照處理細(xì)胞核轉(zhuǎn)位-激動(dòng)劑處理細(xì)胞核轉(zhuǎn)位)×100％

實(shí)施例39在脂多糖誘導(dǎo)的外周血單核細(xì)胞TNF-α檢測(cè)實(shí)驗(yàn)中進(jìn)行藥物篩選

新鮮血液收集和PBMC分離

1.采血員聯(lián)系志愿者，采集足夠新鮮血液儲(chǔ)存于肝素鈉采血管中。

2.轉(zhuǎn)移DPBS對(duì)比稀釋的血液至加有15ml Lymphoprep分離液的SepMate分離管中，

3.常溫1200g離心30分鐘，無(wú)剎車停止離心。

4.吸出白膜層(包含PBMC)，DPBS洗兩次。

5.用含10％小牛血清的1640培養(yǎng)基重懸PBMC，細(xì)胞計(jì)數(shù)。

LPS誘導(dǎo)的TNF-α釋放實(shí)驗(yàn)

1.PBMC鋪板每孔8萬(wàn)個(gè)細(xì)胞，按計(jì)劃加稀釋過(guò)的化合物，37度細(xì)胞培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)一小時(shí)。

2.加LPS刺激細(xì)胞。終濃度為10ng/ml。37度細(xì)胞培養(yǎng)箱孵育過(guò)夜。

3.離心取上清，按照TNF-αELISA試劑盒步驟檢測(cè)細(xì)胞上清中的TNF-α含量。

4.FlexStation3讀取吸光度，導(dǎo)出數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)計(jì)算IC50。

實(shí)施例40藥物對(duì)p38α酶的抑制實(shí)驗(yàn)篩選化合物

1.準(zhǔn)備濃度為500ng/ml的p38α緩沖液。

2.利用濃度為500ng/ml激酶緩沖溶液連續(xù)2倍稀釋，稀釋16個(gè)點(diǎn)。

3.取5uL稀釋過(guò)的p38α緩沖溶液加入384孔板中。

4.準(zhǔn)備0.8uM GFP-ATF2和180uM ATP混合溶液1ml。

5.在每個(gè)空中加入5uL的GFP-ATF2和ATP混合溶液，出發(fā)反應(yīng)。

6.密封室溫培養(yǎng)1小時(shí)。

7.準(zhǔn)備ATF-2抗體1ml。

8.向每個(gè)孔中加入10ul的抗體，混合均勻。

9.密封，室溫培養(yǎng)30分鐘。

10.在儀器上讀取TR-FRET信號(hào)。

11.加入2ul化合物0.5％DMSO溶液，每個(gè)孔3倍稀釋，11個(gè)濃度，2次重復(fù)(3333，1111，370，123，41，13.7，4.57，1.52，0.51，0.17，0.056)。

12.加入4uL p38α到每個(gè)孔中。

13.室溫培養(yǎng)15分鐘。

14.加入4uL GFP-ATF2和ATP混合溶液，激發(fā)反應(yīng)。

15.室溫培養(yǎng)1小時(shí)。

16.每個(gè)孔加入10uL抗體。

17.室溫培養(yǎng)30分鐘。

18.儀器上讀取TR-FRET信號(hào)，計(jì)算IC₅₀值。

實(shí)施例41化合物對(duì)p38α/β/γ/δ酶的選擇性抑制實(shí)驗(yàn)

1.準(zhǔn)備濃度為500ng/ml的p38α/β/γ/δ緩沖液。

2.利用濃度為500ng/ml激酶緩沖溶液連續(xù)2倍稀釋，稀釋16個(gè)點(diǎn)。

3.取5uL稀釋過(guò)的p38α緩沖溶液加入384孔板中。

4.準(zhǔn)備0.8uM GFP-ATF2和180uM ATP混合溶液1ml。

5.在每個(gè)空中加入5uL的GFP-ATF2和ATP混合溶液，出發(fā)反應(yīng)。

6.密封室溫培養(yǎng)1小時(shí)。

7.準(zhǔn)備ATF-2抗體1ml。

8.向每個(gè)孔中加入10ul的抗體，混合均勻。

9.密封，室溫培養(yǎng)30分鐘。

10.在儀器上讀取TR-FRET信號(hào)。

11.加入2ul化合物0.5％DMSO溶液，每個(gè)孔3倍稀釋，11個(gè)濃度，2次重復(fù)(3333，1111，370，123，41，13.7，4.57，1.52，0.51，0.17，0.056)。

12.加入4uL p38α到每個(gè)孔中。

13.室溫培養(yǎng)15分鐘。

14.加入4uL GFP-ATF2和ATP混合溶液，激發(fā)反應(yīng)。

15.室溫培養(yǎng)1小時(shí)。

16.每個(gè)孔加入10uL抗體。

17.室溫培養(yǎng)30分鐘。

18.儀器上讀取TR-FRET信號(hào)，計(jì)算IC₅₀值。