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一種基于miRNA序列分析物種進化的方法與流程

文檔序號:11996536閱讀:838來源:國知局
本發(fā)明屬于分子標(biāo)記技術(shù)領(lǐng)域,更具體地說,涉及一種基于miRNA序列分析物種進化的方法。

背景技術(shù):
現(xiàn)有的物種進化分析方法多用保守基因的DNA序列和氨基酸序列,或是基因組全序列,它們的假設(shè)前提都是基因或基因組受到進化的壓力,用它們作為分子標(biāo)記構(gòu)建分子進化樹,從而確認(rèn)物種間的進化關(guān)系。申請人一直致力于確定物種進化地位的方法的研究,曾做過相關(guān)方面的專利申請,專利申請?zhí)枺?01410409580.X,申請日:2014年08月19日,專利名稱:一種太湖新銀魚物種分子鑒定的引物和方法,既是利用生物體的DNA序列構(gòu)建分子進化樹從而確定物種的進化地位。又如,專利申請?zhí)枺?01310701214.7,申請日:2013年12月18日,專利名稱:長爪沙鼠DNA序列;專利申請?zhí)枺?01310018341.7,申請日:2013年01月18日,專利名稱:茄屬物種鑒定基因、引物及檢測方法,過去以來,人們一直停留在DNA序列或是氨基酸序列層面上去研究生物物種間的進化關(guān)系。然而,隨著對RNA的深入研究發(fā)現(xiàn),RNA在生物進化過程中也扮演著重要的角色,特別是miRNA具有重要的基因表達的調(diào)節(jié)功能,miRNA全稱microRNA,是一段長度為20到25個核苷酸的小RNA分子,miRNA很可能在物種的進化過程中受到了選擇的壓力。經(jīng)檢索,《miRNA-9基因家族進化分析及其靶基因預(yù)測》(中國細胞生物學(xué)學(xué)報,2011,羅丹丹羅玉萍彭娟李思光)中對miRNA-9基因家族的進化歷史作了深層研究,該文獻查詢不同物種中廣泛存在的miRNA-9基因,通過序列比對并構(gòu)建miR-9基因家族系統(tǒng)進化樹對miRNA-9基因做進化分析,進一步分析其靶基因的生物學(xué)功能,從而預(yù)期獲得miRNA-9基因序列在生物體內(nèi)的角色及其可能的作用機制。《microRNA相關(guān)的生物信息學(xué)與進化分析》(復(fù)旦大學(xué)博士學(xué)位論文,生物信息學(xué)專業(yè),楊楨,指導(dǎo)教師:鐘揚教授,2011年4月10日),該論文中也是通過對miRNA基因家族的研究從而預(yù)期獲得miRNA基因在生物體的發(fā)育過程中所起到的作用。上述現(xiàn)有技術(shù)都是從miRNA基因家族進化歷史的層面入手研究,并沒有將miRNA基因的研究聚焦于-物種的進化分析,隨著人類基因組計劃完成和后基因組時代的到來,很多物種的必需基因及miRNA序列被獲得。事實上,必需基因與miRNA也存在著對應(yīng)關(guān)系不難看出,必需基因是生物進化過程中保留下的“生存關(guān)鍵基因”,而用于調(diào)節(jié)必需基因表達水平的miRNA序列自然在進化過程中扮演的角色不容忽視。因此,區(qū)別于傳統(tǒng)的DNA序列或是氨基酸序列,如果以RNA中的miRNA為分子標(biāo)記,對生物間的分子進化進行分析,該方法獲得的結(jié)果對現(xiàn)行的方法將會是一個很好的補充,甚至具有更好的性能。

技術(shù)實現(xiàn)要素:
1.發(fā)明要解決的技術(shù)問題為提供一種對現(xiàn)有生物物種間進化關(guān)系分析方法的補充,提出了本發(fā)明的一種基于miRNA序列分析物種進化的方法。本發(fā)明的提出除了對現(xiàn)有采用DNA序列或氨基酸序列構(gòu)建分子系統(tǒng)樹從而確定物種進化地位的方法的補充,還通過引入必需基因,解決了如何利用僅僅有20~25個bp的miRNA序列來分析生物間進化關(guān)系的問題。2.技術(shù)方案本發(fā)明的一種基于miRNA序列分析物種進化的方法,采用miRNA序列作為分子標(biāo)記進行物種進化分析。更進一步地,所述的miRNA序列為拼接的長miRNA序列。更進一步地,所述的長miRNA序列由至少6個miRNA成熟序列拼接而成。更進一步地,具體步驟如下:一、選擇人類的若干必需基因;二、找出步驟一人類必需基因?qū)?yīng)的miRNA,并獲得該miRNA對應(yīng)的miRNA成熟序列,通過序列比對找出待分析物種的相應(yīng)的miRNA成熟序列,每種待分析物種的miRNA成熟序列至少包括6條;三、按照一定的順序?qū)⒉襟E二中獲得的待分析物種的miRNA成熟序列拼接成為長miRNA序列,構(gòu)成新的分子標(biāo)記,一定的順序是指每種待分析物種的miRNA成熟序列拼接采用相同的順序;四、利用新的分子標(biāo)記序列和進化軟件,構(gòu)建物種分子進化樹。更進一步地,步驟四中所述的進化軟件為MEGA6.0軟件,采用其中的NJ法構(gòu)建分子進化樹。3.有益效果采用本發(fā)明提供的技術(shù)方案,與現(xiàn)有技術(shù)相比,具有如下顯著效果:(1)本發(fā)明的一種基于miRNA序列分析物種進化的方法,擺脫傳統(tǒng)的進化相關(guān)的標(biāo)記,沒有從基因的保守性角度研究進化,而是獨創(chuàng)性的從具有調(diào)節(jié)功能的miRNA序列做進化分析,miRNA序列分子標(biāo)記是對現(xiàn)有的DNA序列分子標(biāo)記的一個重要補充。(2)本發(fā)明的一種基于miRNA序列分析物種進化的方法,原有的進化分析方法只考慮保守基因,往往忽視調(diào)節(jié)基因的RNA和生物的必需基因在進化上的角色,考慮到生物生存所必需的基因,表明這些必需基因在進化上是重要的,必需基因?qū)?yīng)的miRNA在進化上具有重要的信息量,從miRNA序列做進化分析獲得的結(jié)果具有較高的可信度。(3)本發(fā)明的一種基于miRNA序列分析物種進化的方法,選用至少6條必需基因的所對應(yīng)的待分析物種的miRNA序列,拼接成為長miRNA序列作為分子標(biāo)記,因為miRNA一般長度在22bp左右,拼接后的總序列大于100bp,作為分子標(biāo)記進化分析具有較高的可靠性。當(dāng)然,如果選擇更多的miRNA序列,如20條序列,獲得結(jié)果可能具有更高的可信度。(4)本發(fā)明的一種基于miRNA序列分析物種進化的方法,采用待分析物種的miRNA序列相應(yīng)的成熟序列而非前體序列,用它拼接成長miRNA成熟序列做為分子標(biāo)記,具有以下優(yōu)勢:其一,miRNA在細胞內(nèi)真正發(fā)揮調(diào)控功能的是成熟序列而非前體序列,基于本發(fā)明的構(gòu)思,用它可讓結(jié)果更能真實反映序列在進化過程中發(fā)揮的“調(diào)節(jié)功能”;其二,因為需要多條miRNA序列的拼接,長度一致和保守性較高的成熟序列更利于拼接和拼接后的序列比對,而前體序列這些方面的序列特征可能會對進化分析產(chǎn)生干擾。附圖說明圖1為實施例1中的分子樹系統(tǒng)圖。具體實施方式必需基因?qū)τ谏飦碚f十分重要,大量的實驗證明必需基因的突變或是敲除往往導(dǎo)致整個生物體的死亡,因此,必需基因在生物的進化過程中實際上扮演著一個極其重要的角色。miRNA往往調(diào)節(jié)著一些靶基因的基因表達水平,與靶基因間存在一定的對應(yīng)關(guān)系。那些調(diào)節(jié)必需基因的miRNA對物種的進化過程中起著重要的調(diào)節(jié)功能。本發(fā)明從人類的必需基因出發(fā),利用必需基因與miRNA間的關(guān)系,獲得進化程度最高生物的必需基因?qū)?yīng)的miRNA成熟序列,并按照一定的順序組裝起來,拼成一個長RNA序列,用這個序列做分子標(biāo)記,研究物種間的分子進化關(guān)系。具體步驟入如下:一、選擇人類的若干必需基因;二、找出步驟一人類必需基因?qū)?yīng)的miRNA,并獲得該miRNA對應(yīng)的miRNA成熟序列,通過序列比對找出待分析物種的相應(yīng)的miRNA成熟序列,每種待分析物種的miRNA成熟序列至少包括6條;三、按照一定的順序?qū)⒉襟E二中獲得的待分析物種的miRNA成熟序列拼接成長miRNA序列,構(gòu)成新的分子標(biāo)記;四、利用新的分子標(biāo)記序列和MEGA6.0軟件,采用其中的NJ法構(gòu)建分子進化樹。為進一步了解本發(fā)明的內(nèi)容,結(jié)合實施例對本發(fā)明作詳細描述。實施例1本實施例的一種基于miRNA序列分析物種進化的方法,隨機選擇人類6個必需基因,分別為APC、EIF2AK3、POLG、SOX9、WT1(來自于必需基因數(shù)據(jù)庫網(wǎng)站,http://tubic.tju.edu.cn/deg/)。找出這些必需基因?qū)?yīng)的miRNA,它們分別是miRNA-7、miRNA-9、miRNA-10a、miRNA-31、miRNA-34、miRNA-92(必需基因與miRNA的對應(yīng)關(guān)系來自于相應(yīng)數(shù)據(jù)網(wǎng)站,http://mirnamap.mbc.nctu.edu.tw/html/search.html),并根據(jù)miRBase的數(shù)據(jù)庫(www.mirbase.org/)獲得人類的這些miRNA的成熟序列。本實施例需要進行進化分析的研究對象有5個物種,分別為佛羅里達文昌魚,海七鰓鰻,小家鼠,黑猩猩,意蜂,通過Blast序列比對,找到這些物種6個miRNA的序列6條。拼接這些序列整理成為一條整體的序列(序列如下表1所示)。表1新形成的堿基序列分析系統(tǒng)發(fā)生:利用ClustalX2.0軟件對所有已經(jīng)搜索下載獲得物種的miRNA的成熟核酸序列進行多序列比對分析。然后利用MEGA6.0軟件中的NJ法,建立生物的分子系統(tǒng)樹。獲得進化樹的結(jié)果與解釋:利用MEGA6.0軟件運用NJ法構(gòu)建拼接而成的長miRNA成熟序列的進化樹,如圖1所示(Mmu:小家鼠,ptr:黑猩猩,ame意蜂,bfl:佛羅里達文昌魚,pma:海七鰓鰻),可以看出,小家鼠和黑猩猩在一個分支上,而小家鼠和黑猩猩都是哺乳綱動物;佛羅里達文昌魚和海七鰓鰻在進化樹看是相關(guān)聯(lián)的,而佛羅里達文昌魚屬于頭索綱文昌魚科,海七鰓鰻屬于圓口綱,它們都屬于脊椎動物與無脊椎動物間的過渡類型;易蜂在這里被定義為其外群,分子系統(tǒng)樹顯示的待分析物種間的進化關(guān)系與預(yù)測的一致。以上示意性的對本發(fā)明及其實施方式進行了描述,該描述沒有限制性,實施例中所示的也只是本發(fā)明的實施方式之一,實際的情況并不局限于此。所以,如果本領(lǐng)域的普通技術(shù)人員受其啟示,在不脫離本發(fā)明創(chuàng)造宗旨的情況下,不經(jīng)創(chuàng)造性的設(shè)計出與該技術(shù)方案相似的分析方法及實施例,均應(yīng)屬于本發(fā)明的保護范圍。
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