本發(fā)明涉及抗體領(lǐng)域，更具體地，本發(fā)明公開了一種用于去除單克隆抗體中異構(gòu)體的復(fù)性液及復(fù)性方法。
背景技術(shù)：
：近年來制藥工業(yè)領(lǐng)域在以酶、抗體和細胞因子(例如促紅細胞生成素、干擾素、纖溶酶原激活物等)為基礎(chǔ)的產(chǎn)品方面取得巨大成功。全世界對蛋白質(zhì)治療藥物的需求逐年增加。治療性單克隆抗體(mAbs,monoclonalantibodies)在蛋白質(zhì)治療藥物中是重要一類。它們被稱為單克隆抗體，因為相對于多克隆抗體，它們是由衍生自單個抗體形成細胞的免疫細胞(細胞克隆)分泌的。單克隆抗體的特征在于它們每個僅直接對抗免疫原性物質(zhì)的一個表位，從而僅對抗一個抗原決定簇，并且因此在治療疾病中可以非常特異地應(yīng)用?？贵w在生產(chǎn)過程中由于受到復(fù)雜培養(yǎng)環(huán)境的影響，諸如酶解反應(yīng)或者自發(fā)性降解，都會造成抗體的異質(zhì)性，而這種異質(zhì)性必須通過質(zhì)量研究進行衡量，以保證產(chǎn)品的完整性和生產(chǎn)過程的一致性。異質(zhì)性具備聚體、降解、糖基化修飾、氧化、脫?；?、異構(gòu)體、二硫鍵錯配等多種形式。作為一個完整的抗體分子具有2條重鏈和2條輕鏈，但是在抗體的生產(chǎn)過程中，會出現(xiàn)一系列輕重鏈錯配的抗體異構(gòu)體，例如：2條重鏈和1條輕鏈(2H1L)異構(gòu)體、1條重鏈和1條輕鏈(1H1L)異構(gòu)體和2條重鏈(2H)異構(gòu)體。為了減少在單克隆抗體生產(chǎn)過程中產(chǎn)生的異構(gòu)體含量，一般可以利用不同結(jié)構(gòu)物質(zhì)的理化性質(zhì)差異通過層析方法分離異構(gòu)體，然而，這些異構(gòu)體特別是2H1L異構(gòu)體的各種理化性質(zhì)與完整的抗體很接近，難以通過層析方法去除。技術(shù)實現(xiàn)要素：本發(fā)明的目的在于克服現(xiàn)有技術(shù)局限，本申請的發(fā)明人在對單克隆抗體的長期研究中發(fā)現(xiàn)可以通過變復(fù)性的方法減少單克隆抗體生產(chǎn)過程中產(chǎn)生的異構(gòu)體 的含量。即在某個復(fù)性液環(huán)境中，2H1L、1H1L等異構(gòu)體的輕鏈和重鏈可以重新組合配對形成完整的抗體結(jié)構(gòu)。本發(fā)明提供了能夠顯著提高完整的抗體含量、減少異構(gòu)體含量、設(shè)備要求簡單、成本低、操作簡便的復(fù)性液配方和復(fù)性方案。具體地說，本發(fā)明通過改變復(fù)性液組成中的蛋白質(zhì)折疊添加劑的濃度、氧化還原劑比例、pH值等，并使用合適的復(fù)性方法進行單克隆抗體的復(fù)性，使單克隆抗體中2H1L含量降低39％以上；完整的抗體含量提高5％以上，而且復(fù)性溶液完全澄清，沒有沉淀，不需離心和透析即可以進行下一步的層析分離。因此，本發(fā)明的第一個目的在于提供一種用于去除單克隆抗體中異構(gòu)體的復(fù)性液。本發(fā)明的第二個目的在于提供一種用于去除單克隆抗體中異構(gòu)體的復(fù)性方法。為了實現(xiàn)上述目的，本發(fā)明采用了如下技術(shù)方案：本發(fā)明的第一個方面提供了一種用于去除單克隆抗體中異構(gòu)體的復(fù)性液，包括以下組分：磷酸鹽緩沖液、檸檬酸鹽緩沖液或三羥甲基氨基甲烷鹽酸鹽緩沖液中的一種或兩種10-150mmol/L精氨酸或氯化鈉10-500mmol/L氧化性谷胱甘肽0.5-6mmol/L還原性谷胱甘肽0.5-6mmol/LpH5.0-9.0，其中，所述還原性谷胱甘肽：所述氧化性谷胱甘肽的比例為4：1-1：2。進一步的，所述用于去除單克隆抗體中異構(gòu)體的復(fù)性液，包括以下組分：磷酸鹽緩沖液、檸檬酸鹽緩沖液或三羥甲基氨基甲烷鹽酸鹽緩沖液中的一種或兩種20-120mmol/L精氨酸或氯化鈉50-250mmol/L氧化性谷胱甘肽0.5-4mmol/L還原性谷胱甘肽0.5-4mmol/LpH5.0-9.0，其中，所述還原性谷胱甘肽：所述氧化性谷胱甘肽的比例為4：1-1：2。進一步的，所述還原性谷胱甘肽：所述氧化性谷胱甘肽的比例為3：1。優(yōu)選的，所述用于去除單克隆抗體中異構(gòu)體的復(fù)性液包括以下組分：磷酸鹽緩沖液20mmol/L檸檬酸鹽緩沖液20mmol/L精氨酸210-220mmol/L氧化性谷胱甘肽1mM還原性谷胱甘肽3mMpH7.3-7.6。進一步的，所述磷酸鹽為磷酸氫二鈉-磷酸二氫鈉，所述檸檬酸鹽為檸檬酸鈉。本發(fā)明的第二個方面提供了一種用于去除單克隆抗體中異構(gòu)體的復(fù)性方法，包括以下步驟：將單克隆抗體與如上所述的復(fù)性液按照體積比為1：1混和，控制反應(yīng)體系的溫度為2℃-6℃，反應(yīng)8-16hr，獲得單克隆抗體復(fù)性產(chǎn)物。進一步的，所述單克隆抗體為抗VEGF單克隆抗體。進一步的，所述異構(gòu)體為2H1L異構(gòu)體。進一步的，所述單克隆抗體復(fù)性前的濃度為1.0-2.0g/L。本發(fā)明的有益效果：本發(fā)明提供了一種用于去除單克隆抗體中異構(gòu)體的復(fù)性液和復(fù)性方法，利用本發(fā)明的復(fù)性液對單克隆抗體溶液進行處理，可以有效降低單克隆抗體中的異構(gòu)體特別是2H1L異構(gòu)體的含量，并顯著提高完整的單體含量，保證產(chǎn)品的質(zhì)量穩(wěn)定，并且不需要特別的設(shè)備，成本低，工藝簡單，本發(fā)明的方法能夠方便地應(yīng)用于單克隆抗體多步純化的步驟之間進行，例如可以在親和層析之后進行，或者在陽離子層析之后進行，復(fù)性產(chǎn)物能夠直接用于后續(xù)的純化操作，具有廣泛的工業(yè)應(yīng)用前景。附圖說明圖1為擬合出的2H1L含量圖。圖2為擬合出的單體含量圖。圖3為預(yù)測準確性的概率圖。具體實施方式本發(fā)明提供了一種用于去除單克隆抗體中異構(gòu)體的復(fù)性液，包括稀釋緩沖液、蛋白質(zhì)折疊添加劑、氧化劑和還原劑。其中，所述的稀釋緩沖液為三羥甲基氨基甲烷鹽酸鹽(Tris-HCl)、檸檬酸鹽和磷酸鹽中的一種或兩種制備得到的緩沖液；所述的蛋白質(zhì)折疊添加劑為精氨酸或氯化鈉，所述的氧化劑為氧化性谷胱甘肽(GSSG)；所述的還原劑為還原性谷胱甘肽(GSH)。進一步的，所述的稀釋緩沖液為10-150mmol/L、pH5.0-9.0的Tris-鹽酸鹽緩沖液或10-150mmol/L、pH5.0-9.0的檸檬酸鹽-磷酸鹽緩沖液；所述的蛋白質(zhì)折疊添加劑為10-500mmol/L的氯化鈉或10-500mmol/L的精氨酸；所述的氧化劑為0.5-6mmol/L的氧化性谷胱甘肽；所述的還原劑為0.5-6mmol/L的還原性谷胱甘肽。更進一步的，所述的稀釋緩沖液為20-120mmol/L、pH5.0-9.0的Tris-鹽酸鹽緩沖液或20-120mmol/L、pH5.0-9.0的檸檬酸鹽-磷酸鹽緩沖液；所述的蛋白質(zhì)折疊添加劑為50-250mmol/L的氯化鈉或50-250mmol/L的精氨酸；所述的氧化劑為0.5-4mmol/L的氧化性谷胱甘肽；所述的還原劑為0.5-4mmol/L的還原性谷胱甘肽；所述還原性谷胱甘肽：所述氧化性谷胱甘肽的比例為4:1到1:2。優(yōu)選的，所述的稀釋緩沖液為20mmol/L的磷酸鹽緩沖液和20mmol/L的檸檬酸鹽緩沖液，pH7.3-7.6；所述的蛋白質(zhì)折疊劑為210-220mmol/L的精氨酸；所述的氧化劑為1mmol/L的氧化性谷胱甘肽；所述的還原劑為3mmol/L的還原性谷胱甘肽。本發(fā)明還提供了一種用于去除單克隆抗體中異構(gòu)體的復(fù)性方法，包括以下步驟：將單克隆抗體與所述的復(fù)性液按照體積比為1：1混和，控制反應(yīng)體系的溫度為2℃-6℃，反應(yīng)8-16hr，獲得單克隆抗體復(fù)性產(chǎn)物。其中，所述單克隆抗體復(fù)性前的濃度為1.0-2.0g/L。其中，所述單克隆抗體為抗VEGF單克隆抗體。其中，所述異構(gòu)體為2H1L異構(gòu)體。以下實施例、實驗例是對本發(fā)明進行進一步的說明，不應(yīng)理解為對本發(fā)明的限制。以下實施例中pH值的測定在常溫(16℃-25℃)下進行。以下實施例中測CE-SDS(毛細管電泳)非還原采用毛細管電泳儀(來源自BeckmanPA800plus型號)進行，操作方法按儀器說明書進行。除特別注明外，以下實施例中涉及的％均為CE-SDS還原中測定的峰面積的百分比。實施例1-4確定復(fù)性液中pH值的范圍實施例1-4的復(fù)性液配方如表1所示。表1、實施例1-4的復(fù)性液的具體配制方法為按照上表配方先加入精氨酸，然后加入不同比例的磷酸二氫鈉和磷酸氫二鈉，最后加入還原性谷胱甘肽和氧化性谷胱甘肽溶解完畢，用氫氧化鈉和鹽酸調(diào)節(jié)pH到相應(yīng)的pH值。純化后的抗VEGF單克隆抗體蛋白溶液(pH：7.15，濃度：1.31mg/mL，來源自上?？贵w藥物國家工程研究中心有限公司)和實施例1-4中的復(fù)性液各取20ml，將抗VEGF單克隆抗體蛋白溶液和復(fù)性液分別混合后加入50ml離心管，在4℃靜置過夜。同時以不添加復(fù)性液的抗VEGF單克隆抗體蛋白溶液在4℃靜置過夜作為對照樣品。第二天將所有樣品測CE-SDS非還原，結(jié)果如表2所示。表2、樣品編號2H1L含量單體含量對照8.82％85.38％實施例15.20％90.87％實施例25.03％91.03％實施例35.13％91.12％實施例46.13％88.19％由表2的結(jié)果可知，當復(fù)性液的pH值在5.0到9.0的范圍內(nèi)時，2H1L異構(gòu)體的含量從8.82％降低到5.20％以下，減少了41％以上的2H1L異構(gòu)體，完整的單體含量從85.38％顯著提高到90.87％以上，增加了6.4％以上的完整的單體。實施例5-11確定復(fù)性液中氧化還原劑比例的范圍實施例5-11的復(fù)性液配方如表3所示。表3、實施例5-11的復(fù)性液的配制方法為按照上表配方先加入精氨酸，然后加入不同比例的磷酸二氫鈉和磷酸氫二鈉，最后加入還原性谷胱甘肽和氧化性谷胱甘肽溶解完畢，，用氫氧化鈉和鹽酸調(diào)節(jié)pH到8.0。抗VEGF單克隆抗體蛋白溶液(pH：7.15，濃度：1.31mg/mL，來源自上?？贵w藥物國家工程研究中心有限公司)和實施例5-11中的復(fù)性液各取20ml，將 抗VEGF單克隆抗體蛋白溶液和復(fù)性液分別混合后加入50ml離心管，在4℃靜置過夜。同時以不添加復(fù)性液的抗VEGF單克隆抗體蛋白溶液在4℃靜置過夜作為對照樣品。第二天將所有樣品測CE-SDS非還原，結(jié)果如表4所示。表4、樣品編號2H1L含量單體含量對照7.83％82.3％實施例54.61％90.08％實施例64.01％91.35％實施例73.05％92.89％實施例84.08％91.61％實施例94.44％91.15％實施例105.15％90.07％實施例115.03％90.55％由表4的結(jié)果可知，當復(fù)性液中還原性谷胱甘肽：氧化性谷胱甘肽的比例為4：1到1：2之間時，2H1L的含量從7.83％降低到4.44％以下，減少了43％以上的2H1L異構(gòu)體，完整的單體含量從82.3％顯著提高到91.15％以上，增加了10％以上的完整的單體含量。實施例12-28采用DoE(實驗設(shè)計)中的CCD方法優(yōu)選蛋白折疊添加劑的濃度、氧化還原劑比例和pH值的范圍基于實施例1-4和5-11的結(jié)果，采用DOE進一步優(yōu)化精氨酸的濃度范圍、氧化還原劑比例的范圍以及pH值的范圍，實施例12-28的復(fù)性液配方如表5所示，其中，實施例26-28為平行樣品，用于檢驗系統(tǒng)誤差。表5、實施例12-28的復(fù)性液包括緩沖液的具體配制方法為按照上表配方先加入精氨酸，然后加入不同比例的磷酸二氫鈉、磷酸氫二鈉、檸檬酸、檸檬酸三鈉，最后加入還原性谷胱甘肽、氧化性谷胱甘肽溶解完畢，用氫氧化鈉和鹽酸調(diào)節(jié)pH到相應(yīng)的pH?？筕EGF單克隆抗體蛋白溶液(pH：7.20，濃度：1.60mg/mL，來源自上?？贵w藥物國家工程研究中心有限公司)和實施例12-28中的復(fù)性液各取20ml，將抗VEGF單克隆抗體蛋白溶液和復(fù)性液分別混合后加入50ml離心管，在4℃ 靜置過夜。同時以不添加復(fù)性液的抗VEGF單克隆抗體蛋白溶液在4℃靜置過夜作為對照樣品。第二天將所有樣品測CE-SDS非還原，結(jié)果如表6所示。表6、樣品編號2H1L含量單體含量對照6.7688.77實施例124.1193.54實施例134.193.23實施例142.9295.15實施例152.8395.35實施例163.1594.97實施例172.8394.34實施例182.8494.34實施例192.8194.39實施例202.6895.53實施例212.6795.57實施例223.4994.54實施例232.6395.02實施例242.7695.62實施例252.7995.26實施例262.9395.55實施例272.9795.36實施例282.8795.56將表5和表6所示的數(shù)據(jù)輸入MODDLE軟件(10.1版本)，采用表5的數(shù)據(jù)中的精氨酸濃度、還原性谷胱甘肽濃度、pH值為變量，表6的數(shù)據(jù)中的2H1L含量和單體含量為相應(yīng)因子進行擬合，圖1為擬合出的2H1L含量圖，圖2為擬合出的單體含量圖，圖3為預(yù)測準確性的概率圖，最終得出復(fù)性液最佳比例為20mM磷酸氫二鈉-磷酸二氫鈉緩沖液+20mM檸檬酸鈉緩沖液+210-220mM精 氨酸+3mM還原性谷胱甘肽+1mM氧化性谷胱甘肽pH7.3-7.6。當前第1頁1 2 3