本發(fā)明涉及農(nóng)業(yè)和生物
技術(shù)領(lǐng)域：
，尤其涉及一種創(chuàng)制光溫敏不育系的方法及其在植物育種中的應(yīng)用。
背景技術(shù)：
：在農(nóng)業(yè)生產(chǎn)中，由于傳統(tǒng)去雄手段耗時費力，雄性不育系在雜交制種，提高農(nóng)業(yè)產(chǎn)量中有巨大的優(yōu)勢。雄性不育往往被分為細(xì)胞質(zhì)雄性不育(CMS)以及細(xì)胞核雄性不育(GMS)。三系雜交體系的建立依賴于細(xì)胞質(zhì)雄性不育。然而，有幾個缺點阻礙了三系配套雜交在實踐中的廣泛應(yīng)用。首先，細(xì)胞質(zhì)雄性不育植株普遍存在著品質(zhì)較差的的問題；其次，三系雜交水稻的組合增產(chǎn)潛力越來越小。再次，由于野敗類型的雄性不育細(xì)胞質(zhì)單一，一旦胞質(zhì)不育喪失或某種毀滅性病蟲害發(fā)生，會造成巨大損失。隨著細(xì)胞核雄性不育中光溫敏條件性雄性不育的發(fā)現(xiàn)，兩系法雜交水稻應(yīng)運而生。相對于三系雜交法，光溫敏不育系兼有不育系和保持系兩種狀態(tài)。與三系法相比，兩系法具有不受恢保關(guān)系的限制，既核不育可以與大量常規(guī)品種雜交，配組自由，因而更容易獲得優(yōu)良性狀的雜交優(yōu)勢，從根本上解決三系中雄性不育細(xì)胞質(zhì)單一化的問題。近年來，兩系雜交水稻在中國農(nóng)業(yè)生產(chǎn)中的應(yīng)用越來越廣泛。早在1973年,石明松在中國湖北省從晚粳品種(Oryzasativassp.japonica)農(nóng)墾58中選育出光敏感不育系并提出了一系兩用的水稻雜種優(yōu)勢利用新途徑。隨后，以農(nóng)墾58S(NK58S)為父本，與秈稻雜交獲得的培矮64S(PA64S)也在兩系雜交中得到廣泛應(yīng)用。但培矮64S的育性對于溫度的變化更加敏感。在水稻中，光溫敏不育系受到單基因隱性位點控制。最近的研究表明，農(nóng)墾58S與培矮64S的不育性狀受到同一個遺傳位點的控制，而溫度和光照都會對該位點產(chǎn)生影響，這些發(fā)現(xiàn)使人們對光溫敏育性轉(zhuǎn)換的分子機制更加難以理解。目前為止，水稻中共有十三個光溫敏不育系被發(fā)現(xiàn)：pms1,pms2,pms3,rpms1,rpms2,tms1,tms2,tms3,tms4,tms5,tms6,rtms1以及Ms-h，分別定位在第7,3,12,8,9,8,7,6,2,2,5,10和9條染色體上。光溫敏不育在番茄，玉米以及小麥中也有報道。最近的研究發(fā)現(xiàn)，一個突變的小RNA(smallRNA),osa-smR5864m,導(dǎo)致pms2以及p/tms2-1(農(nóng)墾58S和培矮64S)突變體的不育表型。然而，光溫敏不育的分子機理仍然不清楚，使得人們?nèi)狈τ行У睦碚撝С趾图夹g(shù)手段來解決兩系育種中實際問題。鑒于擬南芥較小的基因組，快速的生長周期以及大量的突變體庫等無可比擬的優(yōu)勢，使其在植物生物學(xué)研究領(lǐng)域成為模式植物。此外，擬南芥能夠在嚴(yán)格控制溫度，光照等條件的狹小空間中進行培養(yǎng)。前人的研究發(fā)現(xiàn)了一些擬南芥條件不育突變體，如PEAMT基因突變體t365以及GA/IAA生物合成受阻的ms33突變體都表現(xiàn)為溫敏不育表型。然而，目前本領(lǐng)域中尚缺少調(diào)控方式簡便的植物不育系用于植物育種過程中，因此迫切需要調(diào)控方式簡單方便的植物不育系培育技術(shù)。技術(shù)實現(xiàn)要素：本發(fā)明的目的是提供一種培育植物光溫敏不育系的方法，包括降低花粉發(fā)育相關(guān)的?；o酶A連接酶表達或活性來創(chuàng)制光溫敏植物材料,從而解決目前核不育光溫敏遺傳位點少，制種純度不高的問題。在本發(fā)明的第一方面，提供了一種培育植物不育系的方法，包括步驟：降低所述植物植株中花粉發(fā)育相關(guān)的?；o酶A連接酶的表達或活性。在另一優(yōu)選例中，所述的酰基輔酶A連接酶參與所述植物的花粉發(fā)育過程的脂類代謝。在另一優(yōu)選例中，所述的?；o酶A連接酶將脂肪酸與輔酶A(CoA)形成硫酯鍵(acyl－CoA)。在另一優(yōu)選例中，所述的“降低”是指將所述植株中在花粉發(fā)育過程中?；o酶A連接酶的表達活性降低滿足以下條件：A1/A0的比值≤80％，較佳地≤60％，更佳地≤40％，最佳地為0-30％；其中，A1為所述植株中花粉發(fā)育相關(guān)的?；o酶A連接酶活性；A0為野生型同種類型植物植株中相同?；o酶A連接酶的酶活性。在另一優(yōu)選例中，所述酰基輔酶A連接酶為ACOS5或其同源蛋白。在另一優(yōu)選例中，所述ACOS5的野生型氨基酸序列選自下組：SEQIDNO.:1、SEQIDNO.:2、SEQIDNO.:3、SEQIDNO.:4、SEQIDNO.:5和SEQIDNO.:6。在另一優(yōu)選例中，所述酰基輔酶A連接酶是選自下組的細(xì)胞、組織或器官中特異性表達的：植物花序以及花藥中。在另一優(yōu)選例中，所述細(xì)胞或組織包括：絨氈層。在另一優(yōu)選例中，所述?；o酶A連接酶在花藥發(fā)育期特異性表達。在另一優(yōu)選例中，所述的花藥發(fā)育期包括前花藥形成階段(-3天～0天)、花藥形成階段、后花藥形成階段(花藥形成后1-5天)。在另一優(yōu)選例中，所述?；o酶A連接酶在花藥發(fā)育第6期特異表達。在另一優(yōu)選例中，所述?；o酶A連接酶在花粉減數(shù)分裂期達到表達最高峰。在另一優(yōu)選例中，所述降低植物植株中花粉發(fā)育相關(guān)的?；o酶A連接酶活性的方法包括：使酰基輔酶A連接酶編碼基因的表達水平下降、和/或使?；o酶A連接酶活性下降。在另一優(yōu)選例中，所述的下降指與野生型酰基輔酶A連接酶的表達水平E0相比，所述植株中花粉發(fā)育相關(guān)的酰基輔酶A連接酶的表達水平E1為野生型的0-80％，較佳地0-60％，更佳地0-40％；和/或與野生型的花粉發(fā)育相關(guān)的?；o酶A連接酶的酶活性A0相比，所述植株中花粉發(fā)育相關(guān)的?；o酶A連接酶的酶活性A1為野生型的0-80％，較佳地0-60％，更佳地0-40％。在另一優(yōu)選例中，所述的降低植株中?；o酶A連接酶活性通過選自下組的方式實現(xiàn)：基因突變、基因敲除、基因中斷、RNA干擾技術(shù)、或其組合。在另一優(yōu)選例中，所述?；o酶A連接酶編碼基因為ACOS5基因。在另一優(yōu)選例中，所述ACOS5基因能夠編碼SEQIDNO.:1、SEQIDNO.:2、SEQIDNO.:3、SEQIDNO.:4SEQIDNO.:5或SEQIDNO.:6所示氨基酸序列。在另一優(yōu)選例中，所述方法包括步驟：降低所述植株中ACOS5基因的表達水平、缺失ACOS5基因和/或致ACOS5基因突變來實現(xiàn)降低植株中?；o酶A連接酶的表達或活性。在另一優(yōu)選例中，所述的植物包括農(nóng)作物、林業(yè)植物、花卉；優(yōu)選地包括禾本科，豆科以及十字花科植物，更優(yōu)選地包括水稻、玉米、高粱、小麥、大豆或擬南芥。在另一優(yōu)選例中，所述的植物選自：十字花科(Brassicaceae)植物、鼠耳芥屬(Arabidopsis)植物或擬南芥(A.thaliana)。本發(fā)明的第二方面，提供了一種花粉發(fā)育相關(guān)的酰基輔酶A連接酶或其編碼基因的用途，用于培育植物不育系、或用于制備培育植物不育系的試劑或試劑盒。在另一優(yōu)選例中，所述的編碼基因為ACOS5基因。在另一優(yōu)選例中，所述ACOS5基因能夠編碼SEQIDNO.:1、SEQIDNO.:2、SEQIDNO.:3、SEQIDNO.:4、SEQIDNO.:5或SEQIDNO.:6所示氨基酸序列。本發(fā)明的第三方面，提供了一種將植物從不育轉(zhuǎn)為可育的方法，包括步驟：降低花粉壁所需脂類的合成速度、和/或延緩花粉發(fā)育速度。在另一優(yōu)選例中，所述的植物是花粉發(fā)育相關(guān)的酰基輔酶A連接酶的表達或活性水平下降的植物。在另一優(yōu)選例中，所述植物為根據(jù)權(quán)利要求上述任一項所述的方法培育的植物不育系。在另一優(yōu)選例中，所述方法包括：延緩植株以及花粉的發(fā)育。在另一優(yōu)選例中，所述方法包括：降低植株代謝水平，從而降低花粉壁合成速度。在另一優(yōu)選例中，所述降低或延緩是通過以下方式實現(xiàn)：降低植株生長的環(huán)境溫度、減少植株的光照時間、或組合。在另一優(yōu)選例中，降低植株生長的環(huán)境溫度包括將環(huán)境溫度(平均溫度)控制在17-22℃，更優(yōu)選地為17-20℃，如17℃、18℃、19℃或20℃。在另一優(yōu)選例中，降低植株生長的環(huán)境溫度的時間包括花藥形成階段，花粉成熟階段以及開花授粉階段，或其前后2周。在另一優(yōu)選例中，在植株抽薹或抽穗時開始降低植株的生長溫度，低溫培育3-10天后，恢復(fù)正常溫度培育。本發(fā)明的第四方面，提供了一種植物育種方法，包括維持植株不育的步驟；將植株由不育轉(zhuǎn)為可育的步驟；和，維持植株可育并育種的步驟；在所述維持植株不育的步驟中，包括，對根據(jù)本發(fā)明第一方面的方法培育的植物不育系進行維持；在將植株由不育轉(zhuǎn)為可育的步驟中，包括，利用根據(jù)本發(fā)明第三方面的方法將植株由不育轉(zhuǎn)為可育。本發(fā)明的第五方面，提供了一種植物細(xì)胞，所述植物細(xì)胞發(fā)育成的植株中花粉發(fā)育相關(guān)的?；o酶A連接酶的表達或活性降低。在另一優(yōu)選例中，所述?；o酶A連接酶為ACOS5。本發(fā)明優(yōu)點為：(a)提供了一種通過降低植物中花粉發(fā)育相關(guān)的?；o酶A連接酶的表達或活性來創(chuàng)制植物不育系的方法。(b)提供了一種通過延緩花粉發(fā)育速度來使不育植株的性狀轉(zhuǎn)化為可育的方法。應(yīng)理解，在本發(fā)明范圍內(nèi)中，本發(fā)明的上述各技術(shù)特征和在下文(如實施例)中具體描述的各技術(shù)特征之間都可以互相組合，從而構(gòu)成新的或優(yōu)選的技術(shù)方案。限于篇幅，在此不再一一累述。附圖說明圖1為低溫能夠恢復(fù)雄性不育acos5突變體的育性的圖片；A野生型植株的正?？捎硇?。在正常條件下(24℃)，acos5-2，acos5-3突變體的短小果莢不含種子。低溫條件(17℃)下acos5-2,acos5-3突變體植株完全恢復(fù)育性。B.野生型和acos5突變體花藥的亞歷山大染色。野生型的花藥在(24℃)及(17℃)條件下皆充滿了紫色有活力的花粉。在acos5-2及acos5-3突變體中，(24℃)條件下，花藥中只有綠色的殘余物質(zhì)，表明花粉敗育。但在(18℃)條件下，突變體花粉恢復(fù)正常。圖2本發(fā)明ACOS5編碼一個?；o酶A連接酶的基因結(jié)構(gòu)圖；A.acos5突變體的圖位克隆精細(xì)定位區(qū)間。B.ACOS5基因結(jié)構(gòu)信息以及突變體的突變位點。圖3為本發(fā)明恢復(fù)突變體花粉發(fā)育階段的半薄切片分析圖；野生型,acos5(24℃)以及acos5(17℃)花藥的半薄切片。A-D,M-O為野生型藥室，E-H,P-R為在24℃條件下的acos5突變體藥室，I-L,S-U為在17℃條件下的acos5突變體藥室。在第6-7期花藥中，野生型和acos5(24℃或17℃)突變體花藥沒有可觀察到的區(qū)別。在第8期，野生型和acos5(24℃或17℃)突變體藥室中，小孢子成功的從四分體中釋放。在第9期，在acos5(24℃)中有些小孢子開始降解，然而在acos5(17℃)中的小孢子與野生型的一致。在第10期，大多數(shù)acos5(24℃)的小孢子空泡化并且降解。然而，acos5(17℃)中大部分恢復(fù)的小孢子較為正常。在第11期，acos5(24℃)的小孢子在藥室中完全降解，但在17℃條件下，除了個別敗育的小孢子，acos5藥室中存在大量正常的花粉粒。在第12期，acos5(17℃)中出現(xiàn)成熟花粉粒，但是在acos5(24℃)僅有降解的細(xì)胞殘余緊貼于藥室內(nèi)壁。Ep,表皮層；En,藥室內(nèi)壁；ML,中間層；Msp,小孢子；PG,花粉粒；T,絨氈層；Tds,四分體。Bar＝20um。圖4為本發(fā)明acos5突變體及恢復(fù)植株的花粉掃描電鏡分析圖；野生型和acos5(24℃或17℃)突變體花粉發(fā)育的掃描電鏡觀察。野生型的花藥中含有許多正常的花粉,外壁結(jié)構(gòu)正常。而acos5(24℃)突變體中則沒有花粉?；謴?fù)植株acos5(17℃)也有許多成熟花粉,但花粉外壁結(jié)構(gòu)仍有部分異常。圖5為本發(fā)明顯示野生型，突變體及恢復(fù)植株花粉發(fā)育的透射電鏡分析圖；野生型(A-C)和acos5(24℃)(D-F)以及acos5(17℃)(G-I)花粉發(fā)育的超顯微結(jié)構(gòu)。在第7期野生型和acos5(24℃或17℃)突變體的四分體發(fā)育正常,突變體中的初生外壁沉積與野生型一致。在第8期，野生型中釋放的小孢子形成外壁外層，而acos5(24℃)中小孢子則開始出現(xiàn)空泡化現(xiàn)象，在恢復(fù)植株acos5(17℃)中，能形成稍有缺陷的外壁外層。在第9期(即空泡期)，acos5(24℃)完全缺失花粉外壁結(jié)構(gòu)，小孢子破碎并伴隨細(xì)胞質(zhì)泄漏。相反，acos5(17℃)的小孢子則具有較完好的花粉外壁結(jié)構(gòu)，能夠正常發(fā)育。Ba,柱狀結(jié)構(gòu)；I,內(nèi)壁；Msp,小孢子；Ne,外壁內(nèi)層；PC,花粉包被；PG,花粉粒；RM,殘余；Tc,頂蓋結(jié)構(gòu)。Bars＝5um。圖6顯示原核表達的野生型ACOS5以及突變體mACOS5的重組蛋白；A.ACOS5及mACOS5在大腸桿菌誘導(dǎo)表達的電泳圖。1-3泳道分別為野生型ACOS5的未加IPTG誘導(dǎo)，加入IPTG誘導(dǎo)以及純化后的重組蛋白；4-6泳道分別為突變體mACOS5的未加IPTG誘導(dǎo)，加入IPTG誘導(dǎo)以及純化后的重組蛋白；7號泳道為分子量標(biāo)記。B.利用載體His重組蛋白進行的westernblot檢測。圖7為ACOS5蛋白具有酰基輔酶A連接酶活性圖；利用Luciferase-BasedAssay方法來檢測?；o酶A連接酶，活性空白對照(BLANK)體系中，酶活反應(yīng)后體系中剩余的ATP的含量為100％，野生型蛋白ACOS5的ATP剩余量為60％，突變體蛋白mACOS5的ATP剩余量為90％，顯示其酶活性明顯降低。圖8為ACOS5的表達并不受到溫度的誘導(dǎo)對比圖.；A.野生型(24℃/17℃)和acos5-2及acos5-3突變體(24℃/17℃)花序RNA中ACOS5基因表達的半定量RT-PCR。B.野生型(24℃/17℃)和acos5-2及acos5-3突變體(24℃/17℃)花序RNAACOS5基因表達的定量RT-PCR。圖9為低溫延緩了花粉膨脹期的生長速度對比圖；A.花粉發(fā)育可分為四個時期(小孢子釋放期，單核細(xì)胞期，雙核細(xì)胞期和三核細(xì)胞期)。左圖展示了不同時期花苞的大小。在不同時期小孢子發(fā)育的大小則位于右圖上方。這些小孢子的DAPI染色揭示了它們的發(fā)育階段并在右圖下方加以展示。B.在不同發(fā)育時期野生型小孢子大小的統(tǒng)計分析,表明小孢子發(fā)育階段其表面積快速增長。C.在不同外界溫度下野生型小孢子的平均生長速率，表明在低溫條件能夠顯著減緩小孢子的發(fā)育進程。圖10為通過減緩花粉發(fā)育的時間能夠恢復(fù)acos5突變體的育性的對比圖；A.常溫下不同時間段的擬南芥野生型與chlm-4突變體的花粉直徑統(tǒng)計，表明其突變體花粉的發(fā)育比野生型緩慢。B.chlm-4與acos5的雙突變體在常溫下能夠部分恢復(fù)育性。圖11為不同物種中ACOS5基因的蛋白序列相似性以及進化分析圖，蛋白序列比對表明ACOS5直系同源基因的氨基酸序列非常保守，大多在60％以上，進化分析表明，不同物種中的直系同源蛋白在雙子葉植物和單子葉植物有清晰的分岔，有共同的起源。圖12為水稻中OsACOS5的突變導(dǎo)致了雄性不育的表型圖；A.水稻OsACOS5基因結(jié)構(gòu)信息以及突變體的突變位點。B.野生型穗狀花中有飽滿黃色的正?；ㄋ?。C.osacos5突變體的花藥呈白色瘦小。D.亞歷山大染色顯示野生型花藥中充滿花粉粒。E.亞歷山大染色顯示突變體花藥中不含花粉粒。具體實施方式本發(fā)明人經(jīng)過廣泛而深入的研究，首次意外地發(fā)現(xiàn)，對于某些特定的植物不育系，通過調(diào)控花粉發(fā)育相關(guān)的酰基輔酶A連接酶的表達或活性，可以調(diào)控所述植株的育性，實現(xiàn)不育性與育性之間進行可控的轉(zhuǎn)換。本發(fā)明人還開發(fā)了相應(yīng)的培育植物不育系等多種在農(nóng)業(yè)育種等方面有廣泛應(yīng)用價值的技術(shù)。在此基礎(chǔ)上完成了本發(fā)明。在實驗中，申請人發(fā)現(xiàn)擬南芥ACOS5基因(Acyl-CoASynthetase)編碼了一個?；o酶A連接酶并參與到花粉發(fā)育中的脂類代謝過程中，該基因的缺失使得突變體在正常生長條件下(24℃，16小時光照/8小時黑暗)顯示完全不育的表型。而低溫和短日照減緩了花粉的生長速度和脂類代謝過程，使突變體克服了該基因的缺失造成的脂類代謝缺陷，使花粉安全度過快速膨脹期。ACOS5基因編碼一個?；o酶A連接酶，這是一類在不同物種中都存在的保守蛋白，其主要功能為利用中長鏈的羥基化脂肪酸生成輔酶A的酯類(Kienowetal.,2008)。在擬南芥中，前期研究已經(jīng)發(fā)現(xiàn)該基因在絨氈層中特異表達，其功能缺失導(dǎo)致雄性完全不育表型(acos5-1)。細(xì)胞學(xué)分析發(fā)現(xiàn)該突變體花粉外壁形成異常，缺乏孢粉素覆蓋(deAzevedoSouzaetal.,2009)。但迄今為止，還沒有ACOS5與光溫敏不育相關(guān)的工作被報道。適用于本發(fā)明的花粉發(fā)育相關(guān)的?；o酶A連接酶沒有特別限制，可以是來自任何植物品種，代表性的植物包括，但并不限于：水稻(基因號：Os04g24530與擬南芥直系同源ACOS5蛋白同源性為64％)、大麥(基因號：MLOC_6813與擬南芥直系同源ACOS5蛋白同源性為66％)、苜蓿(基因號：MTR_3g460770與擬南芥直系同源ACOS5蛋白同源性為73％)、番茄(基因號：Solyc02g088710與擬南芥直系同源ACOS5蛋白同源性為72％)、葡萄(基因號：VIT_01s0010g03720與擬南芥直系同源ACOS5蛋白同源性為76％)、小麥(基因號：TRIUR3_19356與擬南芥直系同源ACOS5蛋白同源性為66％)。如圖11所示，不同物種中ACOS5基因的蛋白序列相似性以及進化分析中可以看出該基因在不同物種中的的保守性較強，擬南芥中該基因的突變會造成不育性狀，因此，對該基因進行分子遺傳操作將可以用于培育其它物種的不育系。擬南芥ACOS5蛋白序列如SEQIDNO.:1所示，編碼擬南芥ACOS5蛋白的核苷酸序列如SEQIDNO.:8所示。水稻ACOS5蛋白序列如SEQIDNO.:2所示，編碼水稻ACOS5蛋白的核苷酸序列如SEQIDNO.:9所示。大麥ACOS5蛋白序列SEQIDNO.:3所示，編碼大麥ACOS5蛋白的核苷酸序列如SEQIDNO.:10所示。小麥ACOS5蛋白序列如SEQIDNO.:4所示，編碼小麥ACOS5蛋白的核苷酸序列如SEQIDNO.:11所示。苜蓿ACOS5蛋白序列如SEQIDNO.:5所示，編碼苜蓿ACOS5蛋白的核苷酸序列如SEQIDNO.:12所示。番茄ACOS5蛋白序列如SEQIDNO.:6所示，編碼番茄ACOS5蛋白的核苷酸序列如SEQIDNO.:13所示。葡萄ACOS5蛋白序列如SEQIDNO.:7所示，編碼葡萄ACOS5蛋白的核苷酸序列如SEQIDNO.:14所示。在一方面，本發(fā)明提供一種培育植物不育系的方法，包括步驟：降低所述植物植株中花粉發(fā)育相關(guān)的?；o酶A連接酶的表達或活性。術(shù)語“酰基輔酶A連接酶”、“酰基輔酶A連接酶多肽”、“?；o酶A連接酶蛋白”等可互換使用，指具有酰基輔酶A連接酶蛋白氨基酸序列(如SEQIDNO:1-7)的蛋白或多肽。在未特別指出時，術(shù)語“?；o酶A連接酶蛋白”包括野生型和突變型酰基輔酶A連接酶蛋白。本發(fā)明的?；o酶A連接酶可包含SEQIDNO:1-7所示氨基酸的序列。然而，不限于此，因為根據(jù)植物種類或品種，該蛋白的氨基酸序列可能有所不同。換言之，其可以是突變型蛋白或人工變體，所述突變型蛋白或人工變體的氨基酸序列在SEQIDNO:1-7所示氨基酸序列的一個或多個位置包含一個或幾個氨基酸的取代、缺失、插入或添加，只要有助于通過弱化該蛋白的活性而培育植物不育系。本文的“幾個”可根據(jù)蛋白中氨基酸殘基的三維結(jié)構(gòu)的位置或類型而有所不同，但尤其表示2-20，特別是2-10，更特別是2-5。此外，根據(jù)植物的個體或種類，氨基酸的取代、缺失、插入、添加或倒置包括人工變體或天然突變所致的那些?？赏ㄟ^以下方式降低(弱化)本發(fā)明酰基輔酶A連接酶的活性：1)編碼該蛋白的多核苷酸的部分或完全缺失，2)修飾表達調(diào)控序列以降低該多核苷酸的表達，3)修飾染色體上的序列或4)它們的組合。在上文中，可利用染色體基因插入的載體，通過將編碼內(nèi)源性靶蛋白的多核苷酸替換為標(biāo)記基因或部分核苷酸序列缺失的多核苷酸來實施編碼蛋白的多核苷酸的部分或完全缺失。“部分”缺失的長度可根據(jù)多核苷酸的種類而有所不同，但尤其是2bp-300bp，更特別是2bp-100bp，更特別是1bp-5bp。還可通過以下方式修飾表達調(diào)控序列來降低多核苷酸表達：通過核苷酸序列的缺失、插入、保守或非保守性取代或它們的組合在表達調(diào)控序列中誘導(dǎo)突變以進一步弱化表達調(diào)控序列的活性，或?qū)⒈磉_調(diào)控序列替換成活性更低的序列。表達調(diào)控序列包括編碼啟動子的序列、操縱子序列、核糖體結(jié)合位點和控制轉(zhuǎn)錄和翻譯終止的序列。此外，可通過以下方式修飾染色體上的多核苷酸序列以弱化蛋白的活性：通過核苷酸序列的缺失、插入、保守或非保守性取代或它們的組合在序列中誘導(dǎo)突變以進一步弱化該序列的活性，或?qū)⒍嗪塑账嵝蛄刑鎿Q成經(jīng)修飾的序列以便獲得更弱的蛋白活性。如本文所用，“分離的”是指物質(zhì)從其原始環(huán)境中分離出來(如果是天然的物質(zhì)，原始環(huán)境即是天然環(huán)境)。如活體細(xì)胞內(nèi)的天然狀態(tài)下的多聚核苷酸和多肽是沒有分離純化的，但同樣的多聚核苷酸或多肽如從天然狀態(tài)中同存在的其他物質(zhì)中分開，則為分離純化的。如本文所用，“分離的?；o酶A連接酶蛋白或多肽”是指酰基輔酶A連接酶蛋白基本上不含天然與其相關(guān)的其它蛋白、脂類、糖類或其它物質(zhì)。本領(lǐng)域的技術(shù)人員能用標(biāo)準(zhǔn)的蛋白質(zhì)純化技術(shù)純化擬南芥水稻等植物中酰基輔酶A連接酶蛋白。基本上純的多肽在非還原聚丙烯酰胺凝膠上能產(chǎn)生單一的主帶。本發(fā)明的多肽可以是重組多肽、天然多肽、合成多肽，優(yōu)選重組多肽。本發(fā)明的多肽可以是天然純化的產(chǎn)物，或是化學(xué)合成的產(chǎn)物，或使用重組技術(shù)從原核或真核宿主(例如，細(xì)菌、酵母、高等植物、昆蟲和哺乳動物細(xì)胞)中產(chǎn)生。根據(jù)重組生產(chǎn)方案所用的宿主，本發(fā)明的多肽可以是糖基化的，或可以是非糖基化的。本發(fā)明的多肽還可包括或不包括起始的甲硫氨酸殘基。本發(fā)明還包括?；o酶A連接酶蛋白的片段、衍生物和類似物。如本文所用，術(shù)語“片段”、“衍生物”和“類似物”是指基本上保持本發(fā)明的天然?；o酶A連接酶蛋白相同的生物學(xué)功能或活性的多肽。本發(fā)明的多肽片段、衍生物或類似物可以是：(i)有一個或多個保守或非保守性氨基酸殘基(優(yōu)選保守性氨基酸殘基)被取代的多肽，而這樣的取代的氨基酸殘基可以是也可以不是由遺傳密碼編碼的；(ii)在一個或多個氨基酸殘基中具有取代基團的多肽；(iii)成熟多肽與另一個化合物(比如延長多肽半衰期的化合物，例如聚乙二醇)融合所形成的多肽；(iv)附加的氨基酸序列融合到此多肽序列而形成的多肽(如前導(dǎo)序列或分泌序列或用來純化此多肽的序列或蛋白原序列，或融合蛋白)。根據(jù)本文的教導(dǎo)，這些片段、衍生物和類似物屬于本領(lǐng)域熟練技術(shù)人員公知的范圍。在本發(fā)明的優(yōu)選地實施方式中，“?；o酶A連接酶蛋白”或“酰基輔酶A連接酶多肽”序列如SEQIDNO:1-7所示。該術(shù)語還包括具有與?；o酶A連接酶蛋白相同功能的、SEQIDNO:1-7序列的變異形式。這些變異形式包括(但并不限于)：一個或多個(通常為1-50個，較佳地1-30個，更佳地1-20個，最佳地1-10個)氨基酸的缺失、插入和/或取代，以及在C末端和/或N末端添加一個或數(shù)個(通常為20個以內(nèi)，較佳地為10個以內(nèi)，更佳地為5個以內(nèi))氨基酸。例如，在本領(lǐng)域中，用性能相近或相似的氨基酸進行取代時，通常不會改變蛋白質(zhì)的功能。又比如，在C末端和/或N末端添加一個或數(shù)個氨基酸通常也不會改變蛋白質(zhì)的功能。該術(shù)語還包括?；o酶A連接酶蛋白或多肽的活性片段和活性衍生物。該多肽的變異形式包括：同源序列、保守性變異體、等位變異體、天然突變體、誘導(dǎo)突變體、在高或低的嚴(yán)謹(jǐn)度的條件下能與酰基輔酶A連接酶蛋白DNA雜交的DNA所編碼的蛋白。本發(fā)明還提供了其他多肽，如包含酰基輔酶A連接酶蛋白或其片段的融合蛋白。除了幾乎全長的多肽外，本發(fā)明還包括了?；o酶A連接酶蛋白的可溶性片段。通常，該片段具有?；o酶A連接酶蛋白序列的至少約10個連續(xù)氨基酸，通常至少約30個連續(xù)氨基酸，較佳地至少約50個連續(xù)氨基酸，更佳地至少約80個連續(xù)氨基酸，最佳地至少約100個連續(xù)氨基酸。修飾(通常不改變一級結(jié)構(gòu))形式包括：體內(nèi)或體外的多肽的化學(xué)衍生形式如乙?；螋然?。修飾還包括糖基化。修飾形式還包括具有磷酸化氨基酸殘基(如磷酸酪氨酸，磷酸絲氨酸，磷酸蘇氨酸)的序列。還包括被修飾從而提高了其抗蛋白水解性能或優(yōu)化了溶解性能的多肽。在本發(fā)明中，“酰基輔酶A連接酶保守性變異多肽”指與SEQIDNO:1-7所示的氨基酸序列相比，有至多10個，較佳地至多8個，更佳地至多5個，最佳地至多3個氨基酸被性質(zhì)相似或相近的氨基酸所替換而形成多肽。這些保守性變異多肽最好根據(jù)表1進行氨基酸替換而產(chǎn)生。表1最初的殘基代表性的取代優(yōu)選的取代Ala(A)Val；Leu；IleValArg(R)Lys；Gln；AsnLysAsn(N)Gln；His；Lys；ArgGlnAsp(D)GluGluCys(C)SerSerGln(Q)AsnAsnGlu(E)AspAspGly(G)Pro；AlaAlaHis(H)Asn；Gln；Lys；ArgArgIle(I)Leu；Val；Met；Ala；PheLeuLeu(L)Ile；Val；Met；Ala；PheIleLys(K)Arg；Gln；AsnArgMet(M)Leu；Phe；IleLeuPhe(F)Leu；Val；Ile；Ala；TyrLeuPro(P)AlaAlaSer(S)ThrThrThr(T)SerSerTrp(W)Tyr；PheTyrTyr(Y)Trp；Phe；Thr；SerPheVal(V)Ile；Leu；Met；Phe；AlaLeu本發(fā)明的多核苷酸可以是DNA形式或RNA形式。DNA形式包括cDNA、基因組DNA或人工合成的DNA。DNA可以是單鏈的或是雙鏈的。DNA可以是編碼鏈或非編碼鏈。編碼成熟多肽的編碼區(qū)序列可以與SEQIDNO:8-14所示的編碼區(qū)序列相同或者是簡并的變異體。如本文所用，“簡并的變異體”在本發(fā)明中是指編碼具有SEQIDNO:1-7的蛋白質(zhì)，但與SEQIDNO:8-14所示的編碼區(qū)序列有差別的核酸序列。編碼SEQIDNO:1-7的成熟多肽的多核苷酸包括：只編碼成熟多肽的編碼序列；成熟多肽的編碼序列和各種附加編碼序列；成熟多肽的編碼序列(和任選的附加編碼序列)以及非編碼序列。在一個優(yōu)選地實施方式中，所述的?；o酶A連接酶多肽的編碼序列選自下組：(1)編碼如SEQIDNO:1-7所述多肽的多核苷酸序列；(2)如SEQIDNO:8-14所示的多核苷酸序列；(3)與(1)或(2)所述的多核苷酸序列互補的多核苷酸。術(shù)語“編碼多肽的多核苷酸”可以是包括編碼該多肽的多核苷酸，也可以是還包括附加編碼和/或非編碼序列的多核苷酸。本發(fā)明還涉及上述多核苷酸的變異體，其編碼與本發(fā)明有相同的氨基酸序列的多肽或多肽的片段、類似物和衍生物。此多核苷酸的變異體可以是天然發(fā)生的等位變異體或非天然發(fā)生的變異體。這些核苷酸變異體包括取代變異體、缺失變異體和插入變異體。如本領(lǐng)域所知的，等位變異體是一個多核苷酸的替換形式，它可能是一個或多個核苷酸的取代、缺失或插入，但不會從實質(zhì)上改變其編碼的多肽的功能。本發(fā)明還涉及與上述的序列雜交且兩個序列之間具有至少50％，較佳地至少70％，更佳地至少80％相同性的多核苷酸。本發(fā)明特別涉及在嚴(yán)格條件下與本發(fā)明所述多核苷酸可雜交的多核苷酸。在本發(fā)明中，“嚴(yán)格條件”是指:(1)在較低離子強度和較高溫度下的雜交和洗脫，如0.2×SSC,0.1％SDS,60℃；或(2)雜交時加有變性劑,如50％(v/v)甲酰胺，0.1％小牛血清/0.1％Ficoll，42℃等；或(3)僅在兩條序列之間的相同性至少在90％以上,更好是95％以上時才發(fā)生雜交。并且,可雜交的多核苷酸編碼的多肽與SEQIDNO:1-7所示的成熟多肽有相同的生物學(xué)功能和活性。本發(fā)明還涉及與上述的序列雜交的核酸片段。如本文所用，“核酸片段”的長度至少含15個核苷酸，較好是至少30個核苷酸，更好是至少50個核苷酸，最好是至少100個核苷酸以上。核酸片段可用于核酸的擴增技術(shù)(如PCR)以確定和/或分離編碼酰基輔酶A連接酶蛋白的多聚核苷酸。本發(fā)明的酰基輔酶A連接酶蛋白核苷酸全長序列或其片段通?？梢杂肞CR擴增法、重組法或人工合成的方法獲得。對于PCR擴增法，可根據(jù)本發(fā)明所公開的有關(guān)核苷酸序列，尤其是開放閱讀框序列來設(shè)計引物，并用市售的cDNA庫或按本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的常規(guī)方法所制備的cDNA庫作為模板，擴增而得有關(guān)序列。當(dāng)序列較長時，常常需要進行兩次或多次PCR擴增，然后再將各次擴增出的片段按正確次序拼接在一起。一旦獲得了有關(guān)的序列，就可以用重組法來大批量地獲得有關(guān)序列。這通常是將其克隆入載體，再轉(zhuǎn)入細(xì)胞，然后通過常規(guī)方法從增殖后的宿主細(xì)胞中分離得到有關(guān)序列。此外，還可用人工合成的方法來合成有關(guān)序列，尤其是片段長度較短時。通常，通過先合成多個小片段，然后再進行連接可獲得序列很長的片段。目前，已經(jīng)可以完全通過化學(xué)合成來得到編碼本發(fā)明蛋白(或其片段，或其衍生物)的DNA序列。然后可將該DNA序列引入本領(lǐng)域中已知的各種現(xiàn)有的DNA分子(或如載體)和細(xì)胞中。此外，還可通過化學(xué)合成將突變引入本發(fā)明蛋白序列中。本發(fā)明也涉及包含本發(fā)明的多核苷酸的載體，以及用本發(fā)明的載體或GDSL蛋白編碼序列經(jīng)基因工程產(chǎn)生的宿主細(xì)胞，以及經(jīng)重組技術(shù)產(chǎn)生本發(fā)明所述多肽的方法。通過常規(guī)的重組DNA技術(shù)(Science，1984；224：1431)，可利用本發(fā)明的多聚核苷酸序列可用來表達或生產(chǎn)重組的水稻酰基輔酶A連接酶蛋白。一般來說有以下步驟：(1).用本發(fā)明的編碼?；o酶A連接酶蛋白的多核苷酸(或變異體)，或用含有該多核苷酸的重組表達載體轉(zhuǎn)化或轉(zhuǎn)導(dǎo)合適的宿主細(xì)胞；(2).在合適的培養(yǎng)基中培養(yǎng)的宿主細(xì)胞；(3).從培養(yǎng)基或細(xì)胞中分離、純化蛋白質(zhì)。本發(fā)明中，?；o酶A連接酶蛋白多核苷酸序列可插入到重組表達載體中。術(shù)語“重組表達載體”指本領(lǐng)域熟知的細(xì)菌質(zhì)粒、噬菌體、酵母質(zhì)粒、植物細(xì)胞病毒、哺乳動物細(xì)胞病毒或其他載體?？傊灰茉谒拗黧w內(nèi)復(fù)制和穩(wěn)定，任何質(zhì)粒和載體都可以用。表達載體的一個重要特征是通常含有復(fù)制起點、啟動子、標(biāo)記基因和翻譯控制元件。本領(lǐng)域的技術(shù)人員熟知的方法能用于構(gòu)建含酰基輔酶A連接酶蛋白編碼DNA序列和合適的轉(zhuǎn)錄/翻譯控制信號的表達載體。這些方法包括體外重組DNA技術(shù)、DNA合成技術(shù)、體內(nèi)重組技術(shù)等。所述的DNA序列可有效連接到表達載體中的適當(dāng)啟動子上，以指導(dǎo)mRNA合成。表達載體還包括翻譯起始用的核糖體結(jié)合位點和轉(zhuǎn)錄終止子。此外，表達載體優(yōu)選地包含一個或多個選擇性標(biāo)記基因，以提供用于選擇轉(zhuǎn)化的宿主細(xì)胞的表型性狀，如真核細(xì)胞培養(yǎng)用的二氫葉酸還原酶、新霉素抗性以及綠色熒光蛋白(GFP)，或用于大腸桿菌的四環(huán)素或氨芐青霉素抗性。包含上述的適當(dāng)DNA序列以及適當(dāng)啟動子或者控制序列的載體，可以用于轉(zhuǎn)化適當(dāng)?shù)乃拗骷?xì)胞，以使其能夠表達蛋白質(zhì)。宿主細(xì)胞可以是原核細(xì)胞，如細(xì)菌細(xì)胞；或是低等真核細(xì)胞，如酵母細(xì)胞；或是高等真核細(xì)胞，如植物細(xì)胞。代表性例子有：大腸桿菌，鏈霉菌屬、農(nóng)桿菌；真菌細(xì)胞如酵母；植物細(xì)胞等。本發(fā)明的多核苷酸在高等真核細(xì)胞中表達時，如果在載體中插入增強子序列時將會使轉(zhuǎn)錄得到增強。增強子是DNA的順式作用因子，通常大約有10到300個堿基對，作用于啟動子以增強基因的轉(zhuǎn)錄。本領(lǐng)域一般技術(shù)人員都清楚如何選擇適當(dāng)?shù)妮d體、啟動子、增強子和宿主細(xì)胞。用重組DNA轉(zhuǎn)化宿主細(xì)胞可用本領(lǐng)域技術(shù)人員熟知的常規(guī)技術(shù)進行。當(dāng)宿主為原核生物如大腸桿菌時，能吸收DNA的感受態(tài)細(xì)胞可在指數(shù)生長期后收獲，用CaCl2法處理，所用的步驟在本領(lǐng)域眾所周知。另一種方法是使用MgCl2。如果需要，轉(zhuǎn)化也可用電穿孔的方法進行。當(dāng)宿主是真核生物，可選用如下的DNA轉(zhuǎn)染方法：磷酸鈣共沉淀法，常規(guī)機械方法如顯微注射、電穿孔、脂質(zhì)體包裝等。轉(zhuǎn)化植物也可使用農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化或基因槍轉(zhuǎn)化等方法，例如葉盤法。對于轉(zhuǎn)化的植物細(xì)胞、組織或器官可以用常規(guī)方法再生成植株，從而獲得耐受性改變的植物。獲得的轉(zhuǎn)化子可以用常規(guī)方法培養(yǎng)，表達本發(fā)明的基因所編碼的多肽。根據(jù)所用的宿主細(xì)胞，培養(yǎng)中所用的培養(yǎng)基可選自各種常規(guī)培養(yǎng)基。在適于宿主細(xì)胞生長的條件下進行培養(yǎng)。當(dāng)宿主細(xì)胞生長到適當(dāng)?shù)募?xì)胞密度后，用合適的方法(如溫度轉(zhuǎn)換或化學(xué)誘導(dǎo))誘導(dǎo)選擇的啟動子，將細(xì)胞再培養(yǎng)一段時間。本發(fā)明的多核苷酸的一部分或全部可作為探針固定在微陣列(microarray)或DNA芯片(又稱為“基因芯片”)上，用于分析組織中基因的差異表達分析。用酰基輔酶A連接酶蛋白特異的引物進行RNA-聚合酶鏈反應(yīng)(RT-PCR)體外擴增也可檢測?；o酶A連接酶蛋白的轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物。本發(fā)明的主要優(yōu)點包括：(a)提供了一種通過降低植物中花粉發(fā)育相關(guān)的?；o酶A連接酶的表達或活性來創(chuàng)制植物不育系的方法。(b)提供了一種通過延緩花粉發(fā)育速度來使不育植株的性狀轉(zhuǎn)化為可育的方法。下面結(jié)合具體實施例，進一步闡述本發(fā)明。應(yīng)理解，這些實施例僅用于說明本發(fā)明而不用于限制本發(fā)明的范圍。下列實施例中未注明具體條件的實驗方法，通常按照常規(guī)條件，例如Sambrook等人，分子克?。簩嶒炇沂謨?NewYork:ColdSpringHarborLaboratoryPress,1989)或植物分子生物學(xué)-實驗手冊(PlantMolecularBiology-ALaboratoryMannual,MelodyS.Clark編,Springer-verlagBerlinHeidelberg,1997)中所述的條件，或按照制造廠商所建議的條件。除非另外說明，否則百分比和份數(shù)是重量百分比和重量份數(shù)。材料與方法植物材料與種植本發(fā)明中擬南芥材料為Lersbergerecta背景。EMS突變株的誘變和篩選參照Zhangetal.2007。4℃條件下，種子預(yù)萌發(fā)于0.1％瓊脂糖培養(yǎng)基上72小時。植物材料培養(yǎng)于蛭石中，培養(yǎng)條件則為：室溫24℃，光培養(yǎng)16小時/暗培養(yǎng)8小時(正常條件),直至抽苔。之后，抽苔株轉(zhuǎn)移至光照培養(yǎng)箱中低溫培養(yǎng)(17℃-22℃)。對于不同光周期，抽苔株在室溫24℃下，分別于光培養(yǎng)12小時/暗培養(yǎng)12小時；光培養(yǎng)10小時/暗培養(yǎng)14小時或者是光培養(yǎng)8小時/暗培養(yǎng)16小時進行處理。細(xì)胞學(xué)分析用尼康數(shù)碼相機(D-7000)拍攝植物材料。亞歷山大染色與DAPI染色可參考Alex和er,1969；Rossetal.,1996。對于半薄切片，選取花苞不同發(fā)育階段進行固定并包埋于Spurr環(huán)氧樹脂中(具體方法可參考Zhangetal.,2007)。使用PowertomeXL(RMCProducts,Tucson,Arizona,USA)切片機進行每1μm切片并用甲苯胺藍進行染色。使用OlympusDX51數(shù)碼相機(Olympus,Japan)進行花藥切片的拍攝。將8nm金顆粒包裹新鮮雄蕊和花粉粒材料進行掃描電鏡實驗，并利用JSM-840顯微鏡(JEOL,Japan)觀察。對于透射電鏡實驗，將擬南芥花絮冰上固定于固定液中(配方是：含有2.5％戊二醛的0.1M磷酸緩沖液，pH7.2)?；ò牧蟿t進一步依次包埋至樹脂(‘HardPlus’EmbeddingResin,UniteKingdom)中(具體方法可參考Zhangetal.,2007)。超薄切片(50-70nm)則利用JEM-1230透射電子顯微鏡(JEOL,Japan)進行觀察。RNA抽提和定量RT-PCR總RNA可利用Trizol試劑(Invitrogen,USA)由成熟土培擬南芥植物花組織進行提取。利用poly-dT(12–18)引物；MMLV反轉(zhuǎn)錄酶和相應(yīng)試劑將5μg的RNA反轉(zhuǎn)第一條cDNA鏈(60分鐘，42℃)。合成好的cDNA鏈作為PCR的模板。定量RT-PCR則是利用SYBRGreenImastermix(Toyobo,Japan)通過ABIPRISM7300系統(tǒng)(AppliedBiosystems,USA)進行檢測。定量RT-PCR的程序參數(shù)是：95℃5分鐘，94℃10秒變性40個循環(huán),60℃退貨延伸1分鐘。定量RT-PCR中所使用的引物列表于電子版的附件中。β-Tubulin則作為對照。WesternBlotting雜交將蛋白樣品進行10％SDS-PAGE電泳，110V恒壓電泳90min。電泳結(jié)束后用半干法電轉(zhuǎn)膜，將電泳好的PAGE膠從電泳板上切下來，小心的轉(zhuǎn)移到轉(zhuǎn)膜板上的硝酸纖維素膜上。膜需要先用甲醇浸透。轉(zhuǎn)膜板里從下至上依次按濾紙、膜、凝膠、濾紙的順序放好，除去去除氣泡。15mA恒流轉(zhuǎn)膜過夜。將膜轉(zhuǎn)移到裝有含有5％的脫脂奶粉的TBST中封閉1h。加入一抗(按比例用TBST稀釋)，4℃雜交1h。用TBST洗膜，15min每次，洗4次。加入二抗(按比例用TBST稀釋)，室溫雜交1h。TBST洗膜，15min/次，洗4次。加入顯色液，用顯影儀拍攝照片保存。蛋白表達與純化取-70度保存的菌種2μl，接種到5ml相應(yīng)抗性LB培養(yǎng)基中37度過夜培養(yǎng)。取100μl過夜培養(yǎng)復(fù)蘇的菌種，接種到100ml相應(yīng)抗性LB培養(yǎng)基中37度震蕩培養(yǎng)4-5h，直至OD600＝0.4-0.5。加入100ul1M的IPTG，18度過夜誘導(dǎo)。4度12000g2min離心收集細(xì)菌。反復(fù)凍融(-70度凍，37度融)5-6次，破裂細(xì)菌，4度12000g20min，收集上清液，用0.45μm的濾膜過濾，-20度保存待用。準(zhǔn)備純化柱子，用3-5個柱床體積的ddH2O清洗柱子中的乙醇。平衡柱子，至少用5個柱床體積的BindingBuffer平衡柱子，流速為1ml/min樣品過柱，將待純化蛋白樣品緩慢過柱，速度不宜過快，保持一滴一滴流過柱子。清洗，用10-15個柱床體積的WashBuffer清洗柱子，流速為1ml/min。洗脫，用5個柱床體積的ElutionBuffer洗脫蛋白，可以減少洗脫體積來濃縮蛋白，但不宜小于一個柱床體積，收集洗脫下來的蛋白，-20℃保存?zhèn)溆?。酶活性測定利用Luciferase-BasedAssay方法來檢測野生型ACOS55及mACOS5蛋白活性。酶催化的反應(yīng)包括兩步：Acid+ATP-----acyl-AMP+PPi；Acyl-AMP+CoA-----acyl-CoA+AMP；整個反應(yīng)會消耗一個分子的ATP。Luciferase與Luciferin反應(yīng)會發(fā)出熒光，并且由ATP來提供反應(yīng)所需能量，Luciferase的熒光反應(yīng)發(fā)出熒光的強弱與反應(yīng)體系中ATP的量成正比。通過該熒光反應(yīng)來檢測4-CL酶活反應(yīng)后體系中剩余的ATP的含量，從而來反應(yīng)待測4-CL蛋白的酶活性。操作步驟：1、將待測蛋白在冰上融化后，取適量蛋白，加入Mix1中，混勻，室溫靜置30min。2、在不同的時間點，迅速取2μl步驟1中反應(yīng)好的溶液加入已經(jīng)配置好的Mix2中，混勻。3、用LumatLB9501luminometer測定反應(yīng)好的Mix2的熒光強度，并記錄測定結(jié)果。4、根據(jù)熒光強度，制作不同樣本的Luciferase活性圖表，4-CL活性與其成反比。反應(yīng)體系如下：4-CL催化反應(yīng)體系(200μl)(Mix1)：熒光素酶檢測反應(yīng)體系(200μl)(Mix2)：實施例1擬南芥acos5-2及acos5-3突變體的不育表型在低溫條件下得以恢復(fù)發(fā)明人利用EMS化學(xué)誘變的方式從擬南芥Ler生態(tài)型中分離到了acos5-2突變體。同時，在擬南芥Col生態(tài)型的T-DNA插入突變體庫中篩選到一個外顯子插入的突變體acos5-3。在正常的環(huán)境溫度下(24℃)，純合的acos5-2突變體的營養(yǎng)生長正常，但育性喪失，只有短小無種子的果莢，如圖1A所示。遺傳分析表明acos5-2突變體屬于孢子體雄性不育，受到單基因隱性位點控制。申請人將acos5-2突變體在24℃培養(yǎng)至抽薹，將其移入18℃連續(xù)培養(yǎng)，其后續(xù)的果莢皆恢復(fù)育性，如圖1A所示，而acos5-3突變體在低溫下的育性恢復(fù)相比點突變acos5-2較為困難。在同樣低溫條件下，野生型植株的并沒有受到影響(結(jié)果未顯示)。亞歷山大染色顯示低溫條件下acos5-2及acos5-3突變體的花粉被染成紫紅色，與野生型相同，如圖1B所示，而正常條件下的acos5-2及acos5-3突變體花藥內(nèi)并無可育花粉，如圖1B所示。這個結(jié)果說明低溫能夠彌補acos5-2及acos5-3突變體中的雄配子體發(fā)育缺陷。實施例2acos5-2的基因定位以及ACOS5基因結(jié)構(gòu)利用本實驗室的擬南芥In/Del分子標(biāo)記，通過對acos5-2突變體F2代中不育表型植株的初步定位，將ACOS5基因位于擬南芥第一條染色體上，與分子標(biāo)記F7A10緊密連鎖。此后又設(shè)計了六對精細(xì)定位引物：F24O1，F(xiàn)23N19，F(xiàn)16P17(8)，F(xiàn)16P17(Snp-1)，F(xiàn)16M19，F(xiàn)13O11，進一步把ACOS5基因的定位區(qū)間縮小在F16P17(23283)和F16P17(23327)兩個分子標(biāo)記間的44KB范圍之內(nèi)，該區(qū)間包含了6個候選基因，如圖2中A所示。其中At1g62940基因編碼一個酰基輔酶A連接酶蛋白。在acos5-2突變體中，在該基因的第三個外顯子檢測到一個CCA到CTA突變(脯氨酸突變?yōu)榱涟彼?的單核苷酸突變，如圖2中B所示。對于T-DNA插入突變體acos5-3，申請人使用了TAIL-PCR的方法,對擴增出的邊界序列進行了測序，發(fā)現(xiàn)acos5-3突變體的第二個外顯子存在T-DNA插入，如圖2中B所示。申請人利用了遺傳互補實驗進一步進行驗證。克隆了At1g62940基因組片段，包括上游啟動子區(qū)和下游區(qū)域，利用農(nóng)桿菌介導(dǎo)轉(zhuǎn)化入acos5-2/+雜合的植株。鑒定顯示5個轉(zhuǎn)基因株系中的2株為acos5-2/acos5-2背景，這些植株在正常溫度(24℃)下恢復(fù)了育性形成了正常的果莢(結(jié)果未顯示)。實施例3低溫能夠彌補acos5突變體中小孢子發(fā)育缺陷為了確定acos5突變體在花粉發(fā)育中的缺陷，申請人進行了花藥半薄切片。在野生型中，在第6和7期，小孢子母細(xì)胞經(jīng)歷減數(shù)分裂形成四分體(Sandersetal.,1999)，如圖3中A-B所示。隨后，小孢子從四分體釋放，并逐漸形成了有正常花粉壁的三核花粉粒(圖3C-D,M-O)。在常溫條件下(24℃)的acos5突變體中，直到花藥發(fā)育第7期突變體和野生型沒有觀察到可見差異，這表明突變體雄配子體減數(shù)分裂不受影響(圖3F)。至花藥發(fā)育第8期，acos5小孢子從四分體釋放，一些小孢子開始出現(xiàn)空泡化現(xiàn)象(圖3G)。第10期，大部分acos5小孢子開始降解，如圖3中P所示，隨后，小孢子的細(xì)胞質(zhì)收縮和瓦解。最終，藥室內(nèi)沒有正常的花粉形成，如圖3中R所示。另一方面，在低溫狀態(tài)下(17℃)，acos5小孢子在第8期從四分體中釋放后，與野生型相比趨于正常，最后除去一小部分的敗育花粉外，低溫下的藥室中產(chǎn)生了正常的成熟花粉粒，如圖3中T-U所示。掃描電鏡顯示，acos5-2突變體在常溫條件下(24℃)的藥室中沒有花粉粒，但其在低溫(17℃)條件下的花粉粒數(shù)量與野生型基本一致,其花粉外壁結(jié)構(gòu)稍有異常(圖4)。透射電鏡觀察表明在acos5-2小孢子的花粉外壁的結(jié)構(gòu)在低溫條件下得以恢復(fù)。在四分體時期，在不同條件下，acos5-2小孢子質(zhì)膜波浪型起伏與野生型相比都較為正常，如圖5中A,D,G所示。在小孢子釋放時期，野生型形成了較為正常的柱狀和頂蓋結(jié)構(gòu)構(gòu)成花粉外壁(圖5B),而在正常溫度(24℃)下acos5-2的小孢子缺乏正常個的花粉外壁結(jié)構(gòu)，這導(dǎo)致了小孢子后期的破裂降解(圖5E-F)。在低溫條件(17℃)下，acos5-2小孢子的花粉外壁能夠逐漸形成比較正常的棒狀和頂蓋結(jié)構(gòu)(圖5中H-I所示，表明低溫能夠克服acos5-2突變所帶來的外壁合成缺陷。實施例4突變蛋白mACOS5的?；o酶A連接酶活性降低，其表達不受到溫度誘導(dǎo)為了檢測ACOS5蛋白的酶活，申請人利用原核表達系統(tǒng)對其進行表達純化。由于acos5-2突變體為點突變，申請人同時克隆了野生型ACOS5和突變體的mACOS5基因進行原核表達(圖6中A所示,并用His抗體進行了Westernblotting雜交鑒定(圖6B)。酰基輔酶A連接酶催化的反應(yīng)需要偶聯(lián)ATP水解提供能量，因此我可以通過檢測反應(yīng)體系中剩余ATP的量來指示酶活性。因此Luciferase活性和?；o酶A連接酶活性成反比。對ACOS5和mACOS5的酶活性檢測發(fā)現(xiàn)，acos5-2中突變后的mACOS5蛋白的確還保留有部分酶活性(圖7所示。為了闡明acos5突變體溫敏的機制，申請人對不同溫度條件下的野生型和突變體花苞中ACOS5的轉(zhuǎn)錄水平進行了檢測。RT-PCR檢測表明，常溫(24℃)與低溫(17℃)條件下野生型和acos5-2突變體的ACOS5在轉(zhuǎn)錄水平上沒有顯著差異，而在T-DNA插入突變體acos5-3中沒有表達，如圖8中A所示。進一步的定量PCR顯示，在野生型和acos5-2突變體中，ACOS5基因在低溫(17℃)條件下的表達略高于常溫(24℃)條件，但在acos5-3中沒有表達，如圖8中B所示。鑒于acos5-3的育性相比acos5-2較難恢復(fù)，這些結(jié)果表明ACOS5的表達和酶活對于花粉壁的形成和花粉的正常發(fā)育至關(guān)重要。實施例5較低的環(huán)境溫度會導(dǎo)致擬南芥的花粉發(fā)育速度減緩上述的細(xì)胞學(xué)觀察表明在常溫(24℃)下大多數(shù)acos5突變體小孢子在環(huán)形空泡期降解。早期的文獻表明擬南芥花粉在成熟過程中體積不斷增大。申請人推測在acos5突變體中，小孢子由于不能渡過快速膨脹過程而導(dǎo)致花粉破裂和敗育。因此，申請人測定了野生型的小孢子在雄配子體發(fā)生過程中的表面積，根據(jù)花苞的大小初步將花粉發(fā)育過程分為4個時期：小孢子釋放期(releasedstage)，單核花粉期(uninucleatestage)，雙核花粉期(bicellularstage)以及三核花粉期(tricellularstage)(圖9中A所示。數(shù)據(jù)統(tǒng)計結(jié)果表明小孢子從四分體釋放后的表面積大約為500um2。而經(jīng)過第一次有絲分裂后，雙核期的小孢子表面積大約擴大了2倍。當(dāng)形成三核花粉后，花粉表面積增大到了2300um2，如圖9中B所示。同時，申請人統(tǒng)計了不同溫度下各個時期的生長速度，結(jié)果顯示在常溫條件(24℃)下從小孢子釋放期到單核花粉期的小孢子生長速度約為8.6um2/hr；從單核花粉期到雙核花粉期的小孢子生長速度約為38.9um2/hr，細(xì)胞學(xué)分析顯示，大多數(shù)acos5小孢子的破裂存在于這個階段；而雙核花粉期到三核花粉期的速度為33.7um2/hr。然而，在低溫條件(17℃)下，第二階段的生長速度下降了大約3倍，如圖9中C所示。經(jīng)測定生長速度在野生型和acos5突變體中是相近的。實施例6花粉發(fā)育速度減緩能夠部分恢復(fù)acos5突變體的不育表型擬南芥鎂原卟啉Ⅸ甲基轉(zhuǎn)移酶基因chlm-4的點突變體表現(xiàn)出植株黃化的表型，但該突變體的育性正常(Cao等，2010).在常溫(24℃)條件下，chlm-4突變體的小孢子發(fā)育進程明顯慢于野生型，如圖10中A所示。以野生型與突變體剛剛釋放小孢子為0小時，數(shù)據(jù)顯示48小時之后，野生型小孢子直徑從平均12.89μm發(fā)育至19.44μm，而chlm-4突變體小孢子從平均12.73μm發(fā)育至18.06μm。96小時之后，野生型小孢子直徑增加至25.03μm，而chlm-4突變體小孢子僅增至22.35μm，如圖10A所示。申請人構(gòu)建的chlm-4acos5-2雙突變體在常溫下進顯示出了部分育性恢復(fù)的表型，如圖10B所示。因此，這個結(jié)果暗示低溫所延緩的生長發(fā)育時間是彌補acos5小孢子缺陷的重要原因。實施例7水稻中OsACOS5蛋白的突變也會造成雄性不育的表型根據(jù)GenBank數(shù)據(jù)庫的序列比對信息，ACOS5幾乎在有花植物中皆有直系同源蛋白。申請人選取了擬南芥，水稻，大麥，小麥，番茄，葡萄和苜蓿的蛋白序列進行了同源性比對，結(jié)果顯示AMP結(jié)構(gòu)域在有花植物中高度保守?；趎eighbor-joining方法分析得出的無根進化樹顯示，不同物種中的直系同源基因在雙子葉植物和單子葉植物有清晰的分岔，如圖11所示。由于不同植物中ACOS5蛋白的同源性都比較高，申請人獲得了水稻OsACOS5(LOC_Os04g24530)的T-DNA插入突變體osacos5，其在第一個外顯子上有一個AAG到TAG的提前終止突變，如圖12中A所示。該突變體顯示出完全不育的表型，其花藥相比野生型，顯示干癟和較白的狀態(tài)，如圖12中B所示，亞歷山大染色顯示與野生型的紫色飽滿的花粉粒相比，osacos5突變體的花藥中沒有任何可見的花粉粒，如圖12中C所示。根據(jù)上述的實驗結(jié)果可以確定，水稻的OsACOS5蛋白與擬南芥ACOS5具有同樣的生物學(xué)功能，降低水稻中OsACOS5蛋白的表達或活性可以培育水稻不育系。在本發(fā)明提及的所有文獻都在本申請中引用作為參考，就如同每一篇文獻被單獨引用作為參考那樣。此外應(yīng)理解，在閱讀了本發(fā)明的上述講授內(nèi)容之后，本領(lǐng)域技術(shù)人員可以對本發(fā)明作各種改動或修改，這些等價形式同樣落于本申請所附權(quán)利要求書所限定的范圍。參考文獻：AliJ,SiddiqEA,ZamanFU,AbrahamMJ,AhmedIlyas.Identificationandcharacterizationoftemperaturesensitivegenicmalesterilitysourcesinrice(OryzasativaL.).IndJofGenet55:243-259(1995).AlonsoJ.M.,Stepanova,A.N.,Leisse,T.J.,Kim,C.J.,Chen,H.,Shinn,P.,Stevenson,D.K.,Zimmerman,J.,Barajas,P.&Cheuk,R.Genome-wideinsertionalmutagenesisofArabidopsisthaliana.Science301:653–657(2003).deAzevedoSouzaC,KimSS,KochS,KienowL,SchneiderK,McKimSM,HaughnGW,KombrinkE,DouglasCJ.AnovelfattyAcyl-CoAsynthetaseisrequiredforpollendevelopmentandsporopolleninbiosynthesisinArabidopsis.PlantCell21:507-525(2009).Ding,J.,Lu,Q.,Ouyang,Y.,Mao,H.,Zhang,P.,Yao,J.,Xu,C.,LiX.,Xiao,J.,&Zhang,Q.AlongnoncodingRNAregulatesphotoperiod-sensitivemalesterility,anessentialcomponentofhybridrice.ProcNatlAcadSciUSA.109:2654-2659(2012).Ebling,F.J.Photo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