本發(fā)明是有關(guān)于一種測量方法，且特別是有關(guān)于一種擴(kuò)增子長度的測量方法。

背景技術(shù)：

在分子生物學(xué)領(lǐng)域，需要對核酸標(biāo)靶(例如：DNA或RNA)進(jìn)行基因定序，將核酸標(biāo)靶以正確的堿基排列作串列表示，進(jìn)而通過傳遞遺傳信息的基因序列以研究具體樣品?；蚨ㄐ虻陌l(fā)展加速生物學(xué)與醫(yī)學(xué)的研究與發(fā)現(xiàn)，并且廣泛地應(yīng)用于生物診斷、生物科技、鑒定科學(xué)和生物系統(tǒng)學(xué)領(lǐng)域中。

近年來，已發(fā)展出次世代定序(Next Generation Sequencing，簡稱NGS)技術(shù)，此高效率定序技術(shù)可大幅降低定序所需的成本和時間。次世代定序檢測需先建立數(shù)據(jù)庫(library)，包括利用兩端已知序列的轉(zhuǎn)接子(adaptor)，接上核酸模板片段，此接合物即為次世代定序數(shù)據(jù)庫。在進(jìn)行次世代定序檢測之前，必須先確認(rèn)其數(shù)據(jù)庫品質(zhì)，若次世代定序數(shù)據(jù)庫含量過高，則群集密度(cluster density)過高，可能導(dǎo)致檢測實驗數(shù)據(jù)品質(zhì)不佳。反之，若次世代定序數(shù)據(jù)庫含量過低，則群集密度過低，可能導(dǎo)致低產(chǎn)率(yield)。另外，若次世代定序數(shù)據(jù)庫中的長度分布過廣，則可能導(dǎo)致讀取深度(read depth)過低。因此，在次世代定序技術(shù)的操作過程中，在上機(jī)步驟之前，須進(jìn)行品質(zhì)管控(quality control)以確認(rèn)次世代定序數(shù)據(jù)庫的長度及含量。

目前，大多通過qPCR(quantitative polymerase-chain-reaction，定量即時聚合酶鏈鎖反應(yīng)，亦稱Real-time PCR)技術(shù)確認(rèn)次世代定序數(shù)據(jù)庫的含量，并通過毛細(xì)管電泳法(capillary electrophoresis，簡稱CE)確認(rèn)次世代定序數(shù)據(jù)庫的長度。然而，qPCR技術(shù)需制作標(biāo)準(zhǔn)曲線，實驗程序上較為復(fù)雜，而毛細(xì)管電泳法則具有低敏感度與非特異性反應(yīng)等缺點。再者，須分別以兩種不同實驗確認(rèn)次世代定序數(shù)據(jù)庫的長度及含量，也導(dǎo)致實驗所需的成本和時間 增加。因此，開發(fā)一種能夠同時精確地分析次世代定序數(shù)據(jù)庫的長度及含量的測量方法，為本領(lǐng)域技術(shù)人員亟欲發(fā)展的目標(biāo)。

技術(shù)實現(xiàn)要素：

本發(fā)明提供一種擴(kuò)增子長度的測量方法，能夠同時精確地分析核酸樣品中擴(kuò)增子的長度及含量。更具體而言，以qPCR技術(shù)來檢測次世代定序數(shù)據(jù)庫的含量時，次世代定序數(shù)據(jù)庫放大后的核酸產(chǎn)物即為擴(kuò)增子，本發(fā)明是通過檢測擴(kuò)增子的長度及含量以進(jìn)一步計算次世代定序數(shù)據(jù)庫的長度及含量。

本發(fā)明提出一種擴(kuò)增子長度的測量方法，包括以下步驟。首先，將qPCR混合試劑(master mix)、前置引子(forward primer)、反置引子(reverse primer)、雜交探針(hybridization probe)、雙股DNA結(jié)合染料(double stranded DNAdye)及極端稀釋(3copies/μl至30copies/μl)的核酸樣品混合，以形成qPCR反應(yīng)混合液。接著，將此qPCR反應(yīng)混合液分配于測試載片的反應(yīng)孔中，每一反應(yīng)孔中至多可分配到一個以下的核酸樣品。之后，對qPCR反應(yīng)混合液進(jìn)行qPCR反應(yīng)，分別測得核酸樣品中的每一擴(kuò)增子的雜交探針及雙股DNA結(jié)合染料隨著反應(yīng)循環(huán)數(shù)變化的熒光強(qiáng)度。接著，進(jìn)行運算方法，以計算出每一擴(kuò)增子的長度。

在本發(fā)明的一實施例中，運算方法包括在每一擴(kuò)增子所測得的雜交探針的熒光強(qiáng)度中定出臨界值(threshold value)，并對應(yīng)得出當(dāng)雜交探針的熒光強(qiáng)度為臨界值時，每一擴(kuò)增子的臨界反應(yīng)循環(huán)數(shù)(threshold cycle)。之后，對應(yīng)得出在臨界反應(yīng)循環(huán)數(shù)時，每一擴(kuò)增子的雙股DNA結(jié)合染料的個別熒光強(qiáng)度。將個別熒光強(qiáng)度代入雙股DNA結(jié)合染料的熒光強(qiáng)度及擴(kuò)增子長度的線性回歸曲線，以計算出每一擴(kuò)增子的長度。

在本發(fā)明的一實施例中，運算方法包括針對每一擴(kuò)增子所測得的雙股DNA結(jié)合染料的熒光強(qiáng)度及雜交探針的熒光強(qiáng)度，分別換算成雙股DNA結(jié)合染料的正規(guī)化熒光強(qiáng)度及所雜交探針的正規(guī)化熒光強(qiáng)度。之后，將每一擴(kuò)增子的雙股DNA結(jié)合染料的正規(guī)化熒光強(qiáng)度及雜交探針的正規(guī)化熒光強(qiáng)度相除，以取得熒光強(qiáng)度比值。接著，將臨界反應(yīng)循環(huán)數(shù)時每一擴(kuò)增子的熒光強(qiáng)度比值代入熒光強(qiáng)度比值及擴(kuò)增子長度的線性回歸曲線，以計算出每一擴(kuò)增子的長度。

在本發(fā)明的一實施例中，雙股DNA結(jié)合染料的正規(guī)化熒光強(qiáng)度及雜交探針的正規(guī)化熒光強(qiáng)度的換算方法，包括將每一反應(yīng)循環(huán)時的雙股DNA結(jié)合染料的熒光強(qiáng)度除以反應(yīng)循環(huán)區(qū)間內(nèi)雙股DNA結(jié)合染料的平均熒光強(qiáng)度，以換算出雙股DNA結(jié)合染料的正規(guī)化熒光強(qiáng)度。將每一反應(yīng)循環(huán)時的雜交探針的熒光強(qiáng)度除以反應(yīng)循環(huán)區(qū)間內(nèi)雜交探針的平均熒光強(qiáng)度，以換算出雜交探針的正規(guī)化熒光強(qiáng)度。

在本發(fā)明的一實施例中，雙股DNA結(jié)合染料包括SYBR green染料、Evagreen染料、LC green染料或SYTO 9染料。

在本發(fā)明的一實施例中，臨界值為1.1至1.5。

在本發(fā)明的一實施例中，qPCR混合試劑包括反應(yīng)緩沖液、dNTP、MgCl₂及Taq聚合酶。

在本發(fā)明的一實施例中，雙股DNA結(jié)合染料在qPCR反應(yīng)混合液中的濃度為1uM至10uM。

在本發(fā)明的一實施例中，雜交探針在qPCR反應(yīng)混合液中的濃度為0.2uM至1uM。

在本發(fā)明的一實施例中，前置引子在qPCR反應(yīng)混合液中的濃度為0.03uM至0.5uM，所述反置引子在qPCR反應(yīng)混合液中的濃度為0.03uM至0.5uM。

在本發(fā)明的一實施例中，核酸樣品與qPCR反應(yīng)混合液的體積比為1:60至1:10。

在本發(fā)明的一實施例中，雜交探針包括TaqMan探針、分子信號(Molecular Beacon)探針、雙雜交探針(Dual Hybridization Probes)或Eclipse探針。

在本發(fā)明的一實施例中，核酸樣品包括次世代定序數(shù)據(jù)庫。

基于上述，本發(fā)明所提出的擴(kuò)增子長度的測量方法，通過同時將雜交探針(與擴(kuò)增子的含量相關(guān))及雙股DNA結(jié)合染料(與擴(kuò)增子的長度相關(guān))加入qPCR反應(yīng)混合液進(jìn)行qPCR反應(yīng)，分別測得雜交探針及雙股DNA結(jié)合染料隨著反應(yīng)循環(huán)數(shù)變化的熒光強(qiáng)度，對應(yīng)得出擴(kuò)增子的臨界反應(yīng)循環(huán)數(shù)，進(jìn)而計算出擴(kuò)增子的長度。因此，本發(fā)明所提出的擴(kuò)增子長度的測量方法能夠同時精確地分析核酸樣品中擴(kuò)增子的長度及含量，并應(yīng)用于次世代定序技術(shù) 的品質(zhì)管控。

為讓本發(fā)明的上述特征和優(yōu)點能更明顯易懂，下文特舉實施例，并配合附圖作詳細(xì)說明如下。

附圖說明

圖1為本發(fā)明一實施例的擴(kuò)增子長度的測量方法的流程示意圖；

圖2為本發(fā)明一實施例的擴(kuò)增子長度的測量方法中，所測得的雜交探針及雙股DNA結(jié)合染料隨著反應(yīng)循環(huán)數(shù)變化的熒光強(qiáng)度曲線圖；

圖3為本發(fā)明另一實施例的擴(kuò)增子長度的測量方法的流程示意圖；

圖4為本發(fā)明另一實施例的擴(kuò)增子長度的測量方法中，所測得的正規(guī)化Eva Green熒光強(qiáng)度及正規(guī)化TaqMan熒光強(qiáng)度的熒光強(qiáng)度比值隨著反應(yīng)循環(huán)數(shù)變化的曲線圖；

圖5為本發(fā)明一實施例的擴(kuò)增子長度的測量方法所執(zhí)行的實驗例，所測得的TaqMan探針及Eva green染料隨著反應(yīng)循環(huán)數(shù)變化的熒光強(qiáng)度曲線圖；

圖6為本發(fā)明一實施例的擴(kuò)增子長度的測量方法所執(zhí)行的實驗例中，不同長度的擴(kuò)增子的正規(guī)化Eva green染料熒光強(qiáng)度的直方圖；

圖7為本發(fā)明一實施例的擴(kuò)增子長度的測量方法所執(zhí)行的實驗例中，正規(guī)化Eva green染料熒光強(qiáng)度與擴(kuò)增子長度的曲線圖。

具體實施方式

圖1為本發(fā)明一實施例的擴(kuò)增子長度的測量方法的流程示意圖。圖2為本發(fā)明一實施例的擴(kuò)增子長度的測量方法中，所測得的雜交探針及雙股DNA結(jié)合染料隨著反應(yīng)循環(huán)數(shù)變化的熒光強(qiáng)度曲線圖。以下，將以圖1及圖2詳細(xì)描述依照本發(fā)明一實施例的擴(kuò)增子長度的測量方法。

請參照圖1，先進(jìn)行步驟S110，在測試載片的反應(yīng)孔中加入qPCR混合試劑、前置引子、反置引子、雜交探針、雙股DNA結(jié)合染料及核酸樣品，以形成qPCR反應(yīng)混合液。測試載片可以是具有多個反應(yīng)孔的載片板，且可在每個反應(yīng)孔中進(jìn)行qPCR反應(yīng)。

更詳細(xì)而言，在所形成的qPCR反應(yīng)混合液中，前置引子的濃度例如是0.03uM至0.5uM，反置引子的濃度例如是0.03uM至0.5uM，雙股DNA結(jié) 合染料的濃度例如是1uM至10uM，雜交探針的濃度例如是0.2uM至1uM。

在本實施例中，雙股DNA結(jié)合染料可包括SYBR green染料、Eva green染料、LC green染料或SYTO 9染料，較佳為Eva green染料，但本發(fā)明不以此為限，也可使用其他能夠與雙股DNA結(jié)合的熒光染料。更詳細(xì)而言，雙股DNA結(jié)合染料的添加量比現(xiàn)有qPCR反應(yīng)的添加量多出例如一倍濃度(1×)至五倍濃度(5×)的量。雜交探針可包括TaqMan探針、分子信號探針、雙雜交探針或Eclipse探針，但本發(fā)明不以此為限，也可使用其他能夠在每一次DNA復(fù)制循環(huán)(replication cycle)即發(fā)出一次熒光信號的熒光染料。

在本實施例中，核酸樣品與qPCR反應(yīng)混合液的體積比例如是1:60至1:10。核酸樣品可包括次世代定序數(shù)據(jù)庫，亦即，本發(fā)明所提出的擴(kuò)增子長度的測量方法可應(yīng)用于次世代定序技術(shù)的品質(zhì)管控，但并不以此為限，本發(fā)明所提出的測量方法也可應(yīng)用于其他任何需要精確地分析擴(kuò)增子的長度及含量的技術(shù)。

在本實施例中，qPCR混合試劑可使用市售品，其中可包括反應(yīng)緩沖液、dNTP、MgCl₂及Taq聚合酶。qPCR混合試劑的市售品例如是凱杰(Qiagen)公司的QuantiTect探針PCR試驗組(Probe PCR Kit)、美商應(yīng)用生命系統(tǒng)(ABI)公司的TaqMan基因表現(xiàn)混合溶劑(Gene Expression Master Mix)、伯瑞(Bio-Rad)公司的iTaq Supermix with ROX以及英杰(Invitrogen)公司的Express qPCR SuperMix，但本發(fā)明不以此為限。更詳細(xì)而言，當(dāng)形成qPCR反應(yīng)混合液時，qPCR混合試劑的濃度例如是一倍濃度(1×)。

接著，請繼續(xù)參照圖1，進(jìn)行步驟S120，對步驟S110在測試載片的反應(yīng)孔中所形成的qPCR反應(yīng)混合液進(jìn)行qPCR反應(yīng)。qPCR反應(yīng)的操作條件設(shè)定可比照現(xiàn)有qPCR反應(yīng)的操作設(shè)定，例如先在50℃反應(yīng)2分鐘之后，在95℃反應(yīng)3分鐘進(jìn)行Taq聚合酶熱啟動步驟，接著進(jìn)行40個如下所述的循環(huán)：在95℃反應(yīng)36秒、在60℃反應(yīng)72秒，但本發(fā)明不以此為限，也可依據(jù)實際需求調(diào)整qPCR反應(yīng)的操作設(shè)定。

之后，請同時參照圖1與圖2，如圖1所示，進(jìn)行步驟S130，分別測得核酸樣品中的每一擴(kuò)增子的雜交探針及雙股DNA結(jié)合染料隨著反應(yīng)循環(huán)數(shù)變化的熒光強(qiáng)度。在本實施例中，示出如圖2所示的曲線圖。在圖2中，上方的曲線圖呈現(xiàn)雜交探針隨著反應(yīng)循環(huán)數(shù)變化的熒光強(qiáng)度，而下方的曲線圖 呈現(xiàn)雙股DNA結(jié)合染料隨著反應(yīng)循環(huán)數(shù)變化的熒光強(qiáng)度，將兩者對齊并列呈現(xiàn)，以便于后續(xù)流程說明。必須說明的是，雖然圖2中僅示出三組擴(kuò)增子的曲線圖形，但圖2所示的曲線圖僅用于例示說明本實施例，本發(fā)明并不以此為限，擴(kuò)增子的實驗組數(shù)及所示出的曲線數(shù)目可依實際實驗情形而加以調(diào)整。

接下來，請同時參照圖1與圖2，進(jìn)行步驟S140，在所測得的雜交探針的熒光強(qiáng)度中定出臨界值T。如圖2所示，臨界值T為隨著反應(yīng)循環(huán)數(shù)增加時，雜交探針的熒光強(qiáng)度逐漸上升區(qū)段中的一雜交探針熒光強(qiáng)度數(shù)值。在本實施例中，臨界值T例如是1.1至1.5，但本發(fā)明不以此為限，也可依實際實驗情形，在雜交探針的熒光強(qiáng)度逐漸上升區(qū)段(即，線性區(qū)段(linear phase))中定出適當(dāng)數(shù)值作為臨界值T。

請同時參照圖1與圖2，進(jìn)行步驟S150，對應(yīng)得出當(dāng)雜交探針的熒光強(qiáng)度為臨界值T時，核酸樣品中每一擴(kuò)增子的臨界反應(yīng)循環(huán)數(shù)C1、C2及C3。由于雜交探針的反應(yīng)原理是當(dāng)擴(kuò)增子每復(fù)制一次，就發(fā)出一次熒光信號，亦即，雜交探針的熒光強(qiáng)度是與擴(kuò)增子的含量正相關(guān)。然而，核酸樣品中每一擴(kuò)增子的qPCR反應(yīng)擴(kuò)增效率可能不同(基于GC堿基含量不同)，故即使在相同的反應(yīng)循環(huán)數(shù)時，每一擴(kuò)增子的含量也可能不同。因此，在雜交探針的熒光強(qiáng)度中定出臨界值T，即可正規(guī)化每一擴(kuò)增子的含量使其彼此相同。亦即，每一擴(kuò)增子在臨界反應(yīng)循環(huán)數(shù)C1、C2及C3時，含量彼此相同。

請同時參照圖1與圖2，進(jìn)行步驟S160，對應(yīng)得出在臨界反應(yīng)循環(huán)數(shù)C1、C2及C3時，每一擴(kuò)增子的雙股DNA結(jié)合染料的個別熒光強(qiáng)度F1、F2及F3。由于雙股DNA結(jié)合染料的作用機(jī)制是與擴(kuò)增子結(jié)合并嵌入雙股核酸中，當(dāng)擴(kuò)增子的長度越長，能結(jié)合嵌入的雙股DNA結(jié)合染料越多，熒光強(qiáng)度則越強(qiáng)，亦即，雙股DNA結(jié)合染料的熒光強(qiáng)度是與擴(kuò)增子的長度正相關(guān)。如上所述，每一擴(kuò)增子在臨界反應(yīng)循環(huán)數(shù)C1、C2及C3時含量彼此相同，因此，步驟S160能夠在每一擴(kuò)增子含量彼此相同時，得出每一擴(kuò)增子的雙股DNA結(jié)合染料的個別熒光強(qiáng)度F1、F2及F3。

最后，請參照圖1及圖2，進(jìn)行步驟S170，將個別熒光強(qiáng)度F1、F2及F3代入雙股DNA結(jié)合染料的熒光強(qiáng)度及擴(kuò)增子長度的線性回歸曲線，以計算出每一擴(kuò)增子的長度。關(guān)于雙股DNA結(jié)合染料的熒光強(qiáng)度及擴(kuò)增子長度的線性回歸曲線以及詳細(xì)計算步驟，可利用本領(lǐng)域中的現(xiàn)有技術(shù)進(jìn)行，故在此 不予贅述。如上所述，步驟S160能夠在每一擴(kuò)增子含量彼此相同時，得出每一擴(kuò)增子的雙股DNA結(jié)合染料的個別熒光強(qiáng)度F1、F2及F3，因此，步驟S170可準(zhǔn)確地測量在每一擴(kuò)增子含量彼此相同時，每一擴(kuò)增子的長度。

圖3為本發(fā)明另一實施例的擴(kuò)增子長度的測量方法的流程示意圖。圖4為本發(fā)明另一實施例的擴(kuò)增子長度的測量方法中，所測得的正規(guī)化Eva Green熒光強(qiáng)度及正規(guī)化TaqMan熒光強(qiáng)度的熒光強(qiáng)度比值隨著反應(yīng)循環(huán)數(shù)變化的曲線圖。

必須說明的是，圖3及圖4所示的實施例相似于圖1及圖2所示的實施例。相似之處在于，在圖3及圖4所示的實施例中，也進(jìn)行如圖1中所示的步驟S110、步驟S120及步驟S130。本實施例與上述實施例不同之處在于，當(dāng)進(jìn)行步驟S130之后，本實施例不進(jìn)行上述實施例中的步驟S140、步驟S150、步驟S160及步驟S170，而是進(jìn)行步驟S340、步驟S350及步驟S360。由于步驟S110、步驟S120及步驟S130的細(xì)節(jié)已于上文中進(jìn)行詳盡地說明，故在此不再贅述。因此，在下文中僅直接針對步驟S340、步驟S350及步驟S360加以敘述。

請先參照圖3，進(jìn)行步驟S340，針對每一擴(kuò)增子所測得的雙股DNA結(jié)合染料的熒光強(qiáng)度及雜交探針的熒光強(qiáng)度，分別換算成雙股DNA結(jié)合染料的正規(guī)化熒光強(qiáng)度及所雜交探針的正規(guī)化熒光強(qiáng)度。

更詳細(xì)而言，雙股DNA結(jié)合染料的正規(guī)化熒光強(qiáng)度的換算方法可包括將每一反應(yīng)循環(huán)時的雙股DNA結(jié)合染料的熒光強(qiáng)度除以反應(yīng)循環(huán)區(qū)間內(nèi)雙股DNA結(jié)合染料的平均熒光強(qiáng)度，以換算出雙股DNA結(jié)合染料的正規(guī)化熒光強(qiáng)度。另一方面，雜交探針的正規(guī)化熒光強(qiáng)度的換算方法包括將每一反應(yīng)循環(huán)時的雜交探針的熒光強(qiáng)度除以反應(yīng)循環(huán)區(qū)間內(nèi)雜交探針的平均熒光強(qiáng)度，以換算出雜交探針的正規(guī)化熒光強(qiáng)度。在本實施例中，反應(yīng)循環(huán)區(qū)間例如是熒光強(qiáng)度尚未上升的基準(zhǔn)線區(qū)域(baseline region)中第三個反應(yīng)循環(huán)至第八個反應(yīng)循環(huán)，但本發(fā)明不以此為限，也可依據(jù)實際實驗情形，在基準(zhǔn)線區(qū)域中定出適當(dāng)反應(yīng)循環(huán)區(qū)間。

之后，請同時參照圖3及圖4，如圖3所示，進(jìn)行步驟S350，將每一擴(kuò)增子的雙股DNA結(jié)合染料的正規(guī)化熒光強(qiáng)度及雜交探針的正規(guī)化熒光強(qiáng)度相除，以取得熒光強(qiáng)度比值。在本實施例中，可示出如圖4所示的曲線圖， 其中呈現(xiàn)熒光強(qiáng)度比值隨著反應(yīng)循環(huán)數(shù)的變化。必須說明的是，雖然圖4中僅示出三組擴(kuò)增子的曲線圖形，但圖4所示的曲線圖僅用于例示說明本實施例，本發(fā)明并不以此為限，擴(kuò)增子的實驗組數(shù)及所示出出的曲線數(shù)目可依實際實驗情形而加以調(diào)整，擴(kuò)增子的長度以及所使用的雙股DNA結(jié)合染料及雜交探針的種類也不以此為限。

接著，請同時參照圖3及圖4，如圖3所示，進(jìn)行步驟S360，將臨界反應(yīng)循環(huán)數(shù)時每一擴(kuò)增子的熒光強(qiáng)度比值代入熒光強(qiáng)度比值及擴(kuò)增子長度的線性回歸曲線，以計算出每一擴(kuò)增子的長度。

在本實施例中，臨界反應(yīng)循環(huán)數(shù)可包括25至35。在圖4中，臨界反應(yīng)循環(huán)數(shù)例如是30，但本發(fā)明不以此為限，也可依據(jù)實際實驗情形，在熒光強(qiáng)度比值逐漸上升區(qū)段(即，線性區(qū)段(linear phase))中定出所對應(yīng)的適當(dāng)反應(yīng)循環(huán)數(shù)作為臨界反應(yīng)循環(huán)數(shù)。如圖4所示，當(dāng)臨界反應(yīng)循環(huán)數(shù)為30時，100bp擴(kuò)增子的熒光強(qiáng)度比值為1.4，200bp擴(kuò)增子的熒光強(qiáng)度比值為2.1，400bp擴(kuò)增子的熒光強(qiáng)度比值為3.1。之后，將上述熒光強(qiáng)度比值代入熒光強(qiáng)度比值及擴(kuò)增子長度的線性回歸曲線，即可計算出每一擴(kuò)增子的長度。

以下，通過實驗例來詳細(xì)說明上述實施例擴(kuò)增子長度的測量方法。然而，下述實驗例并非用以限制本發(fā)明。

實驗例

為了證明本發(fā)明所提出的擴(kuò)增子長度的測量方法能夠同時精確地分析核酸樣品中擴(kuò)增子的長度及含量，以下特別作此實驗例。

在測試載片的反應(yīng)孔中加入qPCR反應(yīng)混合液，qPCR反應(yīng)混合液的組成含量如以下表1所示。核酸樣品為擴(kuò)增子長度已知的標(biāo)準(zhǔn)品，其中含有長度分別為100bp(base pair)、200bp、400bp及800bp的擴(kuò)增子。接著，對反應(yīng)孔中的qPCR反應(yīng)混合液進(jìn)行qPCR反應(yīng)。

表1

圖5為本發(fā)明一實施例的擴(kuò)增子長度的測量方法所執(zhí)行的實驗例，測得的TaqMan探針及Eva green染料隨著反應(yīng)循環(huán)數(shù)變化的熒光強(qiáng)度曲線圖。在圖5中，上方的曲線圖呈現(xiàn)TaqMan探針隨著反應(yīng)循環(huán)數(shù)變化的熒光強(qiáng)度，而下方的曲線圖呈現(xiàn)Eva green染料隨著反應(yīng)循環(huán)數(shù)變化的熒光強(qiáng)度，其中每一點代表一次反應(yīng)循環(huán)。

請參照圖5，在所測得的TaqMan探針的熒光強(qiáng)度中定出臨界值1.3，臨界值1.3為隨著反應(yīng)循環(huán)數(shù)增加時，熒光強(qiáng)度逐漸上升區(qū)段中的一熒光數(shù)值。接著，對應(yīng)得出當(dāng)TaqMan探針的熒光強(qiáng)度為臨界值1.3時，每一擴(kuò)增子的臨界反應(yīng)循環(huán)數(shù)。之后，對應(yīng)得出在臨界反應(yīng)循環(huán)數(shù)時，每一擴(kuò)增子的Eva green染料的個別熒光強(qiáng)度。如圖5所示，100bp擴(kuò)增子的Eva green染料熒光強(qiáng)度為3，200bp擴(kuò)增子的Eva green染料熒光強(qiáng)度為4，400bp擴(kuò)增子的Eva green染料熒光強(qiáng)度為6。之后，將Eva green染料的個別熒光強(qiáng)度代入Eva green染料熒光強(qiáng)度及擴(kuò)增子長度的線性回歸曲線，以計算出每一擴(kuò)增子的長度。

圖6為本發(fā)明一實施例的擴(kuò)增子長度的測量方法所執(zhí)行的實驗例中，不同長度的擴(kuò)增子的正規(guī)化Eva green染料熒光強(qiáng)度的直方圖。請參照圖6，100bp擴(kuò)增子、200bp擴(kuò)增子、400bp擴(kuò)增子及800bp擴(kuò)增子明顯分成彼此分離的四大區(qū)塊。因此，可得知本發(fā)明所提出的擴(kuò)增子長度的測量方法可在每一擴(kuò)增子含量彼此相同時，精確地分辨出每一擴(kuò)增子的長度。

圖7為本發(fā)明一實施例的擴(kuò)增子長度的測量方法所執(zhí)行的實驗例中，正規(guī)化Eva green染料熒光強(qiáng)度與擴(kuò)增子長度的曲線圖。圖7是以上述實驗例中100bp擴(kuò)增子、200bp擴(kuò)增子、400bp擴(kuò)增子及800bp擴(kuò)增子分別測得的Evagreen染料熒光強(qiáng)度平均值對應(yīng)各擴(kuò)增子的長度作圖。如圖7所示，呈現(xiàn)接近平滑的直線，且R²為0.998，相當(dāng)接近1。因此，可得知本發(fā)明所提出的擴(kuò)增子長度的測量方法可在每一擴(kuò)增子含量彼此相同時，精確地測量出每一擴(kuò)增子的長度。

綜上所述，本發(fā)明所提出的擴(kuò)增子長度的測量方法，因同時使用兩種類 型的染料(雜交探針及雙股DNA結(jié)合染料)進(jìn)行qPCR反應(yīng)，可精確地測定每一擴(kuò)增子的長度。另一方面，由于核酸樣品在極端稀釋范圍下進(jìn)行qPCR反應(yīng)，可利用統(tǒng)計分布原理計算含量，因此不需進(jìn)行序列稀釋制作標(biāo)準(zhǔn)曲線，故本發(fā)明所提出的測量方法僅需少量核酸樣品即可執(zhí)行，且檢測限制較低。因此本發(fā)明方法可于同一次的qPCR實驗中，即能夠同時分析核酸樣品中擴(kuò)增子的長度及含量，可用于次世代定序技術(shù)的品質(zhì)管控，或是其他任何需要同時精確地分析核酸樣品中擴(kuò)增子的長度及含量的分子生物學(xué)領(lǐng)域相關(guān)應(yīng)用。

最后應(yīng)說明的是：以上各實施例僅用以說明本發(fā)明的技術(shù)方案，而非對其限制；盡管參照前述各實施例對本發(fā)明進(jìn)行了詳細(xì)的說明，本領(lǐng)域的普通技術(shù)人員應(yīng)當(dāng)理解：其依然可以對前述各實施例所記載的技術(shù)方案進(jìn)行修改，或者對其中部分或者全部技術(shù)特征進(jìn)行等同替換；而這些修改或者替換，并不使相應(yīng)技術(shù)方案的本質(zhì)脫離本發(fā)明各實施例技術(shù)方案的范圍。