本發(fā)明屬于發(fā)酵生物學領域，更具體地，本發(fā)明涉及一種通過優(yōu)化發(fā)酵培養(yǎng)基提高工業(yè)阿維菌素B1a產(chǎn)量的方法。
背景技術：
：阿維菌素是由阿維鏈霉菌(Streptomycesaver-mitilis)生產(chǎn)的一組十六元大環(huán)內(nèi)酯類抗生素(BurgR，MillerB，BakerE.Avermectins，newfamilyofpotentanthelminticagents:producingorganismandfermentation.Antimicrobialagentsandchemotherapy.1979，15(3):361)，具有廣泛的殺蟲和抗寄生蟲等生物活性，在醫(yī)藥、農(nóng)業(yè)及畜牧業(yè)上有著重要的作用(CampbellWC，BurgR，F(xiàn)isherM.Thediscoveryofivermectinandotheravermectins.1984，PesticideSynthesisThroughRationalApproaches.Chapter1:5-20)。阿維菌素包含八種組分A1a，A1b，A2a，A2b，B1a，B1b，B2a，B2b，但只有B1a和B1b具有藥效，其中B1a活性最高(Wann.K.T.TheCellularActionsoftheAvermectins.Phytotherapyresearch.1987,1(4):331-334)。但是，工業(yè)上利用阿維鏈霉菌大規(guī)模生產(chǎn)阿維菌素的生物發(fā)酵過程中，一直存在著產(chǎn)素期內(nèi)B1a產(chǎn)量不高的現(xiàn)象。因此，改進工業(yè)發(fā)酵工藝，開發(fā)工業(yè)化高效生產(chǎn)B1a的方法是本領域迫切需要的。技術實現(xiàn)要素：本發(fā)明的目的在于提供一種通過優(yōu)化發(fā)酵培養(yǎng)基提高工業(yè)阿維菌素B1a產(chǎn)量的方法。在本發(fā)明的第一方面，提供一種在利用阿維鏈霉菌發(fā)酵生產(chǎn)阿維菌素B1a 的過程中提高阿維菌素B1a的產(chǎn)量的方法，所述方法包括：在阿維鏈霉菌的基本培養(yǎng)基中添加0.1±0.02g/L的氯化鈣，利用該培養(yǎng)基培養(yǎng)阿維鏈霉菌，發(fā)酵生產(chǎn)阿維菌素B1a。在本發(fā)明的一個優(yōu)選例中，所述的阿維鏈霉菌的基本培養(yǎng)基包括：可溶性淀粉，豆餅粉，酵母粉，酵母膏，硫酸銨，碳酸鈣，氯化鈷，鉬酸鈉，淀粉酶。在本發(fā)明的另一優(yōu)選例中，所述的阿維鏈霉菌的基本培養(yǎng)基包括：在另一優(yōu)選例中，所述的阿維鏈霉菌的基本培養(yǎng)基包括：在另一優(yōu)選例中，所述的阿維鏈霉菌的基本培養(yǎng)基包括：上述發(fā)酵培養(yǎng)基中，各組分在基本培養(yǎng)基中的含量還可以在±10％的范圍內(nèi)，更佳地±5％的范圍內(nèi)浮動。應理解，可以預期在一定范圍內(nèi)配方的調整仍然可實現(xiàn)所需的技術效果。在本發(fā)明的另一優(yōu)選例中，添加0.1±0.02g/L的氯化鈣的培養(yǎng)基的pH值為7.3～7.6。在本發(fā)明的另一方面，提供一種用于利用阿維鏈霉菌發(fā)酵生產(chǎn)阿維菌素B1a的發(fā)酵培養(yǎng)基，所述發(fā)酵培養(yǎng)基包括：阿維鏈霉菌的基本培養(yǎng)基以及0.1±0.02g/L的氯化鈣。在本發(fā)明的一個優(yōu)選例中，述的阿維鏈霉菌的基本培養(yǎng)基包括：可溶性淀粉，豆餅粉，酵母粉，酵母膏，硫酸銨，碳酸鈣，氯化鈷，鉬酸鈉，淀粉酶。在本發(fā)明的另一優(yōu)選例中，所述的發(fā)酵培養(yǎng)基中，所述的阿維鏈霉菌的基本培養(yǎng)基包括：在本發(fā)明的另一優(yōu)選例中，添加0.1±0.02g/L的氯化鈣的培養(yǎng)基的pH值為7.3～7.6。在本發(fā)明的另一方面，提供一種用于利用阿維鏈霉菌發(fā)酵生產(chǎn)阿維菌素B1a的試劑盒，所述試劑盒中包括所述的發(fā)酵培養(yǎng)基。在本發(fā)明的另一方面，提供所述的發(fā)酵培養(yǎng)基的用途，用于在利用阿維鏈霉菌發(fā)酵生產(chǎn)阿維菌素B1a的過程中提高阿維菌素B1a的產(chǎn)量。本發(fā)明的其它方面由于本文的公開內(nèi)容，對本領域的技術人員而言是顯而易見的。附圖說明圖1、發(fā)酵培養(yǎng)基中添加不同鈣鹽對阿維菌素B1a效價的影響。不同的鈣鹽包括：硝酸鈣、硫酸鈣、碳酸鈣、氯化鈣、乳酸鈣。圖2、實驗組與對照組OUR的時序變化。圖3、實驗組與對照組pH的時序變化。圖4、實驗組與對照組總糖的時序變化。圖5、實驗組與對照組粘度的時序變化。圖6、實驗組與對照組PMV的時序變化。圖7、實驗組與對照組B1a的時序變化。圖8、實驗組與對照組的B1a效價。圖9A-B、標準品B1a的HPLC圖譜(A)以及放罐后收集的發(fā)酵液的HPLC圖譜(B)。具體實施方式針對工業(yè)上利用阿維鏈霉菌生產(chǎn)阿維菌素的生物發(fā)酵過程中產(chǎn)素期內(nèi)B1a產(chǎn)量不高的現(xiàn)象，本發(fā)明人采取向發(fā)酵培養(yǎng)基中添加不同濃度的各種化合物，以篩選到能夠有效提高阿維菌素B1a產(chǎn)量的物質。經(jīng)過大量的研究和篩選，發(fā)現(xiàn)在阿維鏈霉菌發(fā)酵培養(yǎng)基中添加適當濃度的氯化鈣能夠極其明顯地 提高B1a產(chǎn)量。在此基礎上完成了本發(fā)明。工業(yè)規(guī)模利用阿維鏈霉菌生物法生產(chǎn)阿維菌素的培養(yǎng)基中，碳源主要是玉米淀粉。然而，本發(fā)明人在研究中發(fā)現(xiàn)，阿維鏈霉菌在利用玉米淀粉時需要通過自身淀粉酶的水解，因此胞內(nèi)淀粉酶的活力大小將影響菌體對淀粉的利用，進而對B1a合成途徑產(chǎn)生影響。本發(fā)明人的進一步研究發(fā)現(xiàn)，通過在發(fā)酵培養(yǎng)基中添加一定量的氯化鈣，可顯著地提高菌體對底物淀粉的利用效率，增強菌體代謝能力，提高阿維菌素B1a合成通量。在本發(fā)明的具體實施例中，針對工業(yè)阿維菌素生物發(fā)酵過程中產(chǎn)素期內(nèi)B1a產(chǎn)率不高的現(xiàn)象，采取向發(fā)酵培養(yǎng)基中添加不同濃度的氯化鈣、硝酸鈣、硫酸鈣、碳酸鈣、乳酸鈣等鈣鹽的方法，發(fā)現(xiàn)在發(fā)酵培養(yǎng)基中添加0.1g/L氯化鈣能明顯提高B1a產(chǎn)量。與原發(fā)酵培養(yǎng)工藝相比，搖瓶中添加0.1g/L氯化鈣的B1a產(chǎn)量提高了22.50％，中試500L發(fā)酵罐的阿維菌素B1a產(chǎn)量提高了20.86％?？梢娐然}的添加可大大提高阿維菌素B1a產(chǎn)量，具有極其顯著的進步?；诒景l(fā)明人的新發(fā)現(xiàn)，還提供了一種用于利用阿維鏈霉菌發(fā)酵生產(chǎn)阿維菌素B1a的發(fā)酵培養(yǎng)基，所述發(fā)酵培養(yǎng)基包括：阿維鏈霉菌的基本培養(yǎng)基以及0.1±0.02g/L的氯化鈣。所述的阿維鏈霉菌的基本培養(yǎng)基可以采用本領域技術人員已知的用于阿維鏈霉菌培養(yǎng)的培養(yǎng)基，在其中添加本發(fā)明建議添加的氯化鈣即可。作為本發(fā)明的優(yōu)選方式，提供了一種用于阿維鏈霉菌發(fā)酵生產(chǎn)阿維菌素B1a的發(fā)酵培養(yǎng)基，包括：含量較佳含量更佳含量可溶性淀粉8-20g/L10-15g/L12.5g/L豆餅粉1-4g/L1.5-3g/L2.0g/L酵母粉0.2-1g/L0.3-0.7g/L0.5g/L酵母膏0.08-0.6g/L0.1-0.4g/L0.2g/L硫酸銨0.001-0.008g/L0.001-0.005g/L0.003g/L碳酸鈣0.02-0.1g/L0.03-0.08g/L0.05g/L氯化鈷0.0001-0.001g/L0.0002-0.0008g/L0.0004g/L鉬酸鈉0.0001-0.001g/L0.0002-0.0008g/L0.0003g/L淀粉酶0.02-0.15g/L0.03-0.08g/L0.057g/L上述更佳含量的發(fā)酵培養(yǎng)基中，各組分在基本培養(yǎng)基中的含量還可以在±10％的范圍內(nèi)，更佳地±5％的范圍內(nèi)浮動。應理解，可以預期在一定范圍內(nèi)配方的調整仍然可實現(xiàn)所需的技術效果。上述列出的各組分均是本領域技術人員已知的組分，可以通過商業(yè)途徑購買獲得。在進行培養(yǎng)基優(yōu)化的基礎上，所述的阿維鏈霉菌的培養(yǎng)方法可以采用本領域已知的方法。作為本發(fā)明的優(yōu)選方式，利用發(fā)酵罐進行較大規(guī)模的發(fā)酵：在28±1℃左右，罐壓0.05±0.01MPa左右，通氣量為1：1(vvm)，發(fā)酵10±1小時開攪拌，轉速為250±30rpm，發(fā)酵周期為約300-360小時。發(fā)酵約140-160小時開始，每隔24±3小時間歇補加1.5±0.3kg的淀粉。下面結合具體實施例，進一步闡述本發(fā)明。應理解，這些實施例僅用于說明本發(fā)明而不用于限制本發(fā)明的范圍。下列實施例中未注明具體條件的實驗方法，通常按照常規(guī)條件如J.薩姆布魯克等編著，分子克隆實驗指南，第三版，科學出版社，2002中所述的條件，或按照制造廠商所建議的條件。I.材料與方法1.1材料1.1.1菌種阿維鏈霉菌由內(nèi)蒙古齊魯制藥(內(nèi)蒙古)有限公司提供。1.1.2儀器、設備100L全自動機械攪拌不銹鋼高級發(fā)酵罐：上海國強生化工程裝備有限公司。500L全自動機械攪拌不銹鋼高級發(fā)酵罐：上海國強生化工程裝備有限公司。尾氣質譜儀：上海舜宇恒平科學儀器有限公司。1.1.3培養(yǎng)基斜面培養(yǎng)基配方如表1。表1(單位：g/L)種子培養(yǎng)基配方如表2。表2(單位：g/L)發(fā)酵培養(yǎng)基配方如表3。表31.2測定分析方法1.2.1總糖測定采用菲林法，如張云貴，劉祥云，李天?。弧渡锘瘜W實驗指導》，天津科學技術出版社，2005中所記載的。1.2.2菌濃PMV測定取樣搖勻發(fā)酵液后，準確量取10mL發(fā)酵液于帶刻度的離心管中，離心機轉速為4000轉/分鐘，離心10分鐘，測得沉淀物的體積占10mL發(fā)酵液體積的百分含量即得PMV。1.2.3粘度測定方法取5mL發(fā)酵液倒入DV-111Plus流變儀(Brookfieldengineeringlaboratoriesinc.，USA)的樣品適配器中，根據(jù)發(fā)酵液粘度高低選擇合適轉子，設定測定流變控制程序，即確定初始轉速和最終轉速及轉速增量。開始程序后測定的參數(shù)即為發(fā)酵液粘度值。1.2.4阿維菌素測定方法取樣品液2.0mL于50mL容量瓶中，用分析純甲醇稀釋，定容至50mL，超聲破碎20分鐘，過濾，取上清液HPLC測定阿維菌素B1a效價。色譜條件如下：色譜柱為C18反相柱(250×4.6mm)；檢測波長為246nm；流動相為V(甲醇)：V(水)＝(87:13)；流速為1.0mL/min；柱溫25℃；進樣量：20uL。根據(jù)積分面積，利用外標法計算出發(fā)酵液中B1a效價。II.實驗結果與分析實施例1、發(fā)酵搖瓶培養(yǎng)發(fā)酵培養(yǎng)基中分別添加0.1g/L、0.2g/L、0.3g/L三組不同濃度的不同種鈣鹽，如表4。表4、鈣鹽添加方案種子搖瓶：用接種鏟挖取1cm2種子斜面接種到種子搖瓶中進行培養(yǎng)，種子搖瓶為500ml，裝液量60ml，搖床轉速250rpm/min，28℃恒溫條件下培養(yǎng)2天。種子搖瓶不添加氯化鈣，無誘導、無攪拌、無通氣。發(fā)酵搖瓶：種子搖瓶取2ml培養(yǎng)好的種子液至發(fā)酵搖瓶中進行發(fā)酵培養(yǎng)，發(fā)酵搖瓶為500ml，裝液量40ml，搖床轉速250rpm/min，28℃恒溫條件下培養(yǎng)10天。發(fā)酵搖瓶培養(yǎng)為批發(fā)酵，過程無操作變量，即不添加氯化鈣，無誘導、無攪拌、無通氣。培養(yǎng)10天后，測定發(fā)酵液中阿維菌素B1a效價，結果見圖1。由圖1可見，發(fā)酵搖瓶培養(yǎng)10天后，對照組中B1a平均總效價為1.20×105U；實驗組中，除了添加0.1g/L氯化鈣高于對照組外，其它鈣鹽的添加與對照組相比無明顯優(yōu)勢，添加0.1g/L氯化鈣的B1a平均總效價為1.47×105U。發(fā)酵搖瓶培養(yǎng)基中添加不同鈣鹽的實驗結果表明，發(fā)酵培養(yǎng)基中添加0.1g/L的氯化鈣有利于阿維菌素B1a的合成，阿維菌素的B1a產(chǎn)量比對照組顯著 提高了22.50g/L。但是，本發(fā)明人也發(fā)現(xiàn)，添加其它類型的鈣鹽效果不明顯。實施例2、發(fā)酵罐培養(yǎng)100L高級發(fā)酵罐作為種子罐，500L高級發(fā)酵罐作為發(fā)酵罐。對照組發(fā)酵培養(yǎng)基不作變化，實驗組發(fā)酵培養(yǎng)基中添加0.1g/L的氯化鈣。種子罐采用100L高級發(fā)酵罐。消后pH調至7.5，發(fā)酵液體積為60L，培養(yǎng)溫度28℃，罐壓0.05MPa，通氣量為1：1.5(vvm)，發(fā)酵25小時開攪拌，轉速為300rpm，培養(yǎng)40小時轉種，接種方式為管道接種，轉種量為8％。培養(yǎng)過程無其他操作變量，即不添加氯化鈣、無誘導。發(fā)酵罐采用500L高級發(fā)酵罐。消后pH調至7.2，發(fā)酵液體積為300L，培養(yǎng)溫度28℃，罐壓0.05MPa，通氣量為1：1(vvm)，發(fā)酵10小時開攪拌，轉速為250rpm，發(fā)酵周期為330小時。培養(yǎng)過程中不補加氯化鈣、無誘導，發(fā)酵150小時開始，每隔24小時間歇補加1.5kg的淀粉(補料液中淀粉含量按20％w/v進行配料滅菌)。培養(yǎng)10天后，測定發(fā)酵液中阿維菌素B1a效價。表5、鈣鹽添加方案對照組原始的發(fā)酵培養(yǎng)基實驗組發(fā)酵培養(yǎng)基中添加0.1g/L的氯化鈣發(fā)酵過程中相關參數(shù)變化見圖2至圖7。其中，實驗組與對照組OUR的時序變化見圖2。實驗組與對照組pH的時序變化見圖3。實驗組與對照組的發(fā)酵液中總糖的時序變化見圖4。實驗組與對照組的發(fā)酵液粘度的時序變化見圖5。實驗組與對照組的發(fā)酵液中PMV的時序變化見圖6。實驗組與對照組的發(fā)酵液中B1a的時序變化見圖7。由阿維菌素發(fā)酵過程參數(shù)結果表明，阿維菌素為典型的非生長相關性產(chǎn) 物，隨著培養(yǎng)周期的進行：生長期前期(0-15h)內(nèi)：OUR增大、pH回升、總糖下降、粘度與PMV增大；生長后期(15-40h)內(nèi)：OUR下降、pH回升、總糖下降、粘度與PMV增加；生長與產(chǎn)素(即生產(chǎn)阿維菌素)的過渡期(40-60h)內(nèi)：OUR相對穩(wěn)定、pH下降、總糖下降、粘度下降、PMV相對穩(wěn)定；產(chǎn)素期(60h-放罐)內(nèi)：OUR緩慢下降、pH緩慢下降、總糖不斷下降、PMV與粘度相對平穩(wěn)、B1a效價增加。發(fā)酵前期OUR快速上升、pH回升、粘度與PMV增大，總糖含量下降等現(xiàn)象表明，生長期內(nèi)菌體利用培養(yǎng)基中的營養(yǎng)成分快速繁殖、生物量不斷增加，該時期菌體對氮源分解速率超過對碳源的分解速率，隨著有機氮源中的碳骨架被利用合成菌體，脫去的含氮部分使得發(fā)酵液中pH回升。與對照組對比，生長期內(nèi)添加0.1g/L氯化鈣的實驗組中，OUR、pH值、PMV較高，而總糖及粘度較低，表明實驗組中添加的氯化鈣促進了菌體對碳、氮源的利用，提高了菌體的代謝能力，分解和利用碳、氮源速度較快，菌體生物量較多，并且菌體成球數(shù)量較多。發(fā)酵中后期，實驗組與對照組相比，OUR較高、pH較低、總糖含量較低、B1a效價較高。這一結果表明，實驗組中添加0.1g/L氯化鈣改善了阿維鏈霉菌在發(fā)酵前期菌體生長和代謝能力，提高產(chǎn)素期內(nèi)阿維菌素B1a組分的合成。最終在放罐時，對照組中B1a效價為6049U/ml，放罐總效價為1.39×109U；添加氯化鈣實驗批B1a效價為7200U/ml，放罐總效價為1.68×109U，與對照組相比，添加氯化鈣實驗組中B1a總產(chǎn)量顯著提高了20.86％。取發(fā)酵上清液HPLC測定阿維菌素B1a效價，實驗組與對照組的B1a效價見圖8。進行HPLC檢測，結果如圖9。由HPLC測定結果可見，標品的出峰時間為10.740min，發(fā)酵液樣品的出峰時間為10.782min，并且出峰附近無雜峰。該結果表明添加氯化鈣的發(fā)酵工藝下，發(fā)酵產(chǎn)品主要為B1a，并且B1a 組分純度也較高。結論：通過上述實驗結果表明，發(fā)酵培養(yǎng)基中添加0.1g/L氯化鈣有利于提高阿維菌素B1a的產(chǎn)量。其中，發(fā)酵搖瓶中B1a產(chǎn)量提高了22.50％，500L發(fā)酵罐中B1a產(chǎn)量提高了20.86％。本發(fā)明的技術方案的實施，將為阿維菌素生物發(fā)酵科技進步作出貢獻的同時，也可使得企業(yè)在生產(chǎn)上獲得巨大經(jīng)濟效益。在本發(fā)明提及的所有文獻都在本申請中引用作為參考，就如同每一篇文獻被單獨引用作為參考那樣。此外應理解，在閱讀了本發(fā)明的上述講授內(nèi)容之后，本領域技術人員可以對本發(fā)明作各種改動或修改，這些等價形式同樣落于本申請所附權利要求書所限定的范圍。當前第1頁1 2 3