本發(fā)明屬于植物有效成分提取技術領域，具體涉及一種二萜類化合物及其制備方法與應用。

背景技術：
楤木屬植物(Aralia)全世界共有40余種，主要分布在亞洲和北美，我國有28種，其中20種可供藥用，分布幾乎遍布全國，資源豐富。該屬植物主要以根、根皮入藥,有祛風除濕,利尿消腫,活血止痛的作用。用于肝炎，淋巴結腫大，腎炎水腫，糖尿病，白帶，胃痛，風濕關節(jié)痛，腰腿痛，跌打損傷。對楤木屬植物的化學成分及藥理研究主要集中在遼東楤木(A.elata(Miq.)Seem.)、黃毛楤木(A.decaisneanaHance.)、棘莖楤木(A.echinocaulisHand.-Mazz.)、龍眼獨活(A.fargesiiFranch.)、東北土當歸(A.continentalisKitag.)、食用土當歸(A.cordataThunb.)等(鄭玲玲，裴凌鵬.楤木屬植物研究進展[J].中國民族醫(yī)藥雜志,2010,6(6):57-59)。目前從楤木屬植物中已分離出二萜、三萜皂苷、脂肪油、有機酸、香豆素、黃酮、聚炔烯、木脂素、甾醇等單體化合物數(shù)百種。藥理研究表明該屬植物有抗炎、抗菌、抗腫瘤、降血糖、調(diào)節(jié)血脂、保護肝臟及保護心血管等作用。黑果土當歸(AraliadumetorumHand.-Mazz)在云南稱“牛角七”，“白九股牛”，“蜜油參”。民間以根入藥，入脾、胃二經(jīng)。中草藥，2001，32(9):847-850）報道，該植物有補中益氣、托毒外出、消炎的功效，用于淋巴腺炎、慢性化膿性骨髓炎和癤癰等癥。目前對黑果土當歸植物化學成分以及藥理活性的研究報道較少。本發(fā)明試圖對黑果土當歸中二萜類化合物的抗腫瘤作用做進一步深入研究，以期發(fā)現(xiàn)其中的細胞毒活性天然產(chǎn)物，為篩選高效、低毒的抗腫瘤藥物提供依據(jù)。

技術實現(xiàn)要素：
本發(fā)明的第一目的是提供一種二萜類化合物；第二目的在于提供所述二萜類化合物的制備方法；第三目的在于提供所述二萜類化合物的應用。本發(fā)明的第一目的是這樣實現(xiàn)的，所述的二萜類化合物是以黑果土當歸根為原料，經(jīng)浸膏提取、有機溶劑萃取、硅膠柱層析、高壓液相色譜分離得到的，該化合物分子式為C20H28O2，命名為對映-6,8(14),15-海松三烯酸(ent-pimar-6,8(14),15-trien-19-oicacid)，具有下述結構式：。本發(fā)明的第二目的是這樣實現(xiàn)的，是以黑果土當歸根為原料，經(jīng)浸膏提取、有機溶劑萃取、硅膠柱層析、高壓液相色譜分離獲得，具體為：A、浸膏提?。簩⒑诠廉敋w根晾干粉碎得到0.05~0.15cm粒徑大小的顆粒，加入黑果土當歸根重量比4~8倍的體積百分濃度80~95%乙醇溶液于65~74℃下回流提取3~5次，每次1~3h，合并提取液，提取液過濾，減壓濃縮提取液至比重為1.1~1.3得到浸膏a；B、有機溶劑萃取：浸膏a中加入重量比2~4倍量的水，依次用與水等體積的石油醚、乙酸乙酯和正丁醇溶劑進行萃取，每種溶劑萃取4~6次，蒸去溶劑分別得到石油醚萃取物b、乙酸乙酯萃取物c和正丁醇萃取物d；C、硅膠柱層析：將石油醚萃取物b上硅膠柱，裝柱硅膠為100~200目，用量為萃取物b重量6~8倍量；用體積比為25:1~0:1的石油醚-乙酸乙酯有機溶劑梯度洗脫，收集梯度洗脫液、濃縮，經(jīng)TLC監(jiān)測，合并相同的部分；D、高效液相色譜分離：將C步驟中以2:1配比的石油醚-乙酸乙酯有機溶劑進行洗脫得到的洗脫液采用半制備高效液相色譜儀分離純化，即得所述的二萜類化合物對映-6,8(14),15-海松三烯酸(ent-pimar-6,8(14),15-trien-19-oicacid)。本發(fā)明二萜類化合物是首次被分離出來的，通過核磁共振和其他波譜技術測定方法確定為二萜類化合物，并表征其具體結構為：化合物對映-6,8(14),15-海松三烯酸(ent-pimar-6,8(14),15-trien-19-oicacid)，為白色無定型粉末(溶劑為氯仿)，-48.0°(c0.11,CHCl3);IR(KBr)譜在3245-2500,1708,1636,910,863cm-1有吸收，表明分子中存在羧基、羥基和雙鍵。HRESI-MS譜顯示其準分子離子峰m/z299.2020[M-H]-(calcd.299.2011)，結合NMR譜確定其分子式為C20H28O2，不飽和度為7。1HNMR(附圖1，數(shù)據(jù)歸屬見表1)顯示分子中有3個甲基單峰，分別為δH1.32(3H,s),1.07(3H,s)及0.61(3H,s))，有1個單取代雙鍵信號（δ5.71(1H,dd,J=17.6,10.4Hz,H-15),4.96(1H,dd,J=10.4,2.0Hz,H-16a),4.86(1H,dd,J=17.6,2.0Hz,H-16b)），有1個三取代雙鍵信號（δ5.23(1H,s,H-14)），有1個順式二取代雙鍵信號（δ6.07(1H,dd,J=11.2,2.4Hz,H-6),6.03(1H,brd,J=11.2Hz,H-7)）;13CNMR(附圖2，數(shù)據(jù)歸屬見表1)顯示分子中有20個碳，其中有5個季碳(含1個羧基碳和1個烯碳)，6個次甲基(含4個烯碳)，6個亞甲基(含1個烯碳)及3個甲基。結合HSQC相關譜(附圖3)，并對比文獻數(shù)據(jù)可證實，該化合物與已知化合物ent-pimar-8(14),15–19-oicacid結構相似，區(qū)別在于分子中多了1個雙鍵(δC127.4及128.2)，少了2個亞甲基(δC24.3及36.5)；在HMBC譜(附圖6)中可看到H-6(δ6.07)與C-5(δ55.5)有相關，H-7(δ6.03)與C-8(δ135.9)有相關，證實C-6及C-7位為一雙鍵。進一步經(jīng)HMBC相關(附圖4)、COSY相關(附圖5)和ROESY(附圖6)及與文獻(KangO.H.;ChaeH.S.;ChoiJ.G.;OhY.C.;LeeY.S.;KimJ.H.;SeungM.J.;JangH.J.;LeeJ.H.;ShinD.H.;KwonD.Y.EuropeanJournalofPharmacology,2008,601,179-185)對比證實，使化合物的結構最終得到確認，化合物具有下述結構式：通過SCIFINDER數(shù)據(jù)庫檢索和文獻查詢證實該化合物為新化合物。表1本發(fā)明化合物的1H-和13C-NMR(CDCl3)數(shù)據(jù)本發(fā)明的第三目的是這樣實現(xiàn)的，所述的二萜類化合物在制備預防和/或治療腫瘤藥物中的應用。所述的二萜類化合物在制備預防和/或治療人肺腺癌、人前列腺癌或人急性髓系白血病藥物中的應用。本發(fā)明所述的二萜類化合物進行了細胞毒活性測試，實驗結果顯示出良好的抑制人肺腺癌、人前列腺癌及人急性髓系白血病細胞株活性，可為醫(yī)用工業(yè)提供有應用價值的新化合物或先導化合物。本發(fā)明的優(yōu)點：1、本發(fā)明中的二萜類化合物對人肺腺癌、人前列腺癌或人急性髓系白血病細胞株有顯著的抑制作用，提示其具有良好的抗癌活性，可以作為抗癌活性成分或先導化合物。2、本發(fā)明中的二萜類化合物可為天然存在的有機化合物，原料來源廣泛，并且化合物制備操作流程簡單，所獲得的化合物純度高，隨后的工業(yè)化生產(chǎn)易實現(xiàn)。附圖說明圖1是本發(fā)明化合物的核磁共振氫譜（1HNMR)；圖2是本發(fā)明化合物的核磁共振碳譜（13CNMR)；圖3是本發(fā)明化合物的HSQC相關譜；圖4是本發(fā)明化合物的HMBC相關譜；圖5是本發(fā)明化合物的COSY相關譜；圖6是本發(fā)明化合物的ROESY相關譜。具體實施方式下面結合實施例和附圖對本發(fā)明作進一步的說明，但不以任何方式對本發(fā)明加以限制，基于本發(fā)明教導所作的任何變換或改進，均落入本發(fā)明的保護范圍。本發(fā)明所述的二萜類化合物，是以黑果土當歸根為原料，經(jīng)浸膏提取、有機溶劑萃取、硅膠柱層析、高壓液相色譜分離得到的，該化合物分子式為C20H28O2，命名為對映-6,8(14),15-海松三烯酸(ent-pimar-6,8(14),15-trien-19-oicacid)，具有下述結構式：。本發(fā)明所述的二萜類化合物的制備方法，是以黑果土當歸根為原料，經(jīng)浸膏提取、有機溶劑萃取、硅膠柱層析、高壓液相色譜分離獲得，具體為：A、浸膏提?。簩⒑诠廉敋w根晾干粉碎得到0.05~0.15cm粒徑大小的顆粒，加入黑果土當歸根重量比4~8倍的體積百分濃度80~95%乙醇溶液于65~74℃下回流提取3~5次，每次1~3h，合并提取液，提取液過濾，減壓濃縮提取液至比重為1.1~1.3得到浸膏a；B、有機溶劑萃取：浸膏a中加入重量比2~4倍量的水，依次用與水等體積的石油醚、乙酸乙酯和正丁醇溶劑進行萃取，每種溶劑萃取4~6次，蒸去溶劑分別得到石油醚萃取物b、乙酸乙酯萃取物c和正丁醇萃取物d；C、硅膠柱層析：將石油醚萃取物b上硅膠柱，裝柱硅膠為100~200目，用量為萃取物b重量6~8倍量；用體積比為25:1~0:1的石油醚-乙酸乙酯有機溶劑梯度洗脫，收集梯度洗脫液、濃縮，經(jīng)TLC監(jiān)測，合并相同的部分；D、高效液相色譜分離：將C步驟中以2:1配比的石油醚-乙酸乙酯有機溶劑進行洗脫得到的洗脫液采用半制備高效液相色譜儀分離純化，即得所述的二萜類化合物對映-6,8(14),15-海松三烯酸(ent-pimar-6,8(14),15-trien-19-oicacid)。A步驟所述的過濾是經(jīng)80~120μm的濾紙進行過濾。A步驟所述的減壓濃縮是在50℃以下的溫度條件下用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀進行減壓濃縮。B步驟中所述的蒸去溶劑是采用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀蒸去溶劑。C步驟中所述的石油醚-乙酸乙酯有機溶劑的體積配比為25:1、20:1、15:1、10:1、7:1、5:1、2:1和0:1。D步驟所述的高效液相色譜分離純化包括以下步驟：1）將C步驟中以2:1配比的石油醚-乙酸乙酯有機溶劑進行洗脫得到的洗脫液經(jīng)半制備高效液相色譜儀，以體積配比為80:20的甲醇-水為流動相，流速2.5ml/min，250×10mm，5μm的C18為固定相，紫外檢測器檢測波長為210nm，每次進樣50μL，分別收集6~13min，15~21min，22~29min，32~39min，41~46min的色譜峰，多次累加后蒸干，依次合并相同部分得到5個流分；2）將步驟1）中的第32~39min色譜峰的流分經(jīng)半制備高效液相色譜，以體積配比為78:22的甲醇-水為流動相，流速2.5ml/min，250×10mm，5μm的C18為固定相，紫外檢測器檢測波長為210nm，每次進樣50μL，收集42~44min的色譜峰，多次累加后蒸干，得到所述的二萜類化合物對映-6,8(14),15-海松三烯酸(ent-pimar-6,8(14),15-trien-19-oicacid)。本發(fā)明的應用為所述的二萜類化合物在制備預防和/或治療腫瘤藥物中的應用。本發(fā)明的應用為所述的二萜類化合物在制備預防和/或治療人肺腺癌、人前列腺癌或人急性髓系白血病藥物中的應用。下面以具體實施例對本發(fā)明做進一步說明：實施例1化合物的制備材料來源：黑果土當歸采于云南昆明，經(jīng)云南民族大學民族醫(yī)藥學院楊青松副教授鑒定為AraliadumetorumHand.-Mazz，標本保存于云南民族大學民族醫(yī)藥學院標本館。采用以下步驟：（1）將10Kg黑果土當歸根晾干粉碎成粒徑0.1cm大小的顆粒，得黑果土當歸粉，將黑果土當歸粉在65℃的溫度下每次用60Kg80%濃度的乙醇回流提取4次，每次2小時，合并乙醇提取液，備用；（2）將步驟（1）制得的乙醇提取液經(jīng)80-120微米濾紙過濾并在50℃的溫度下用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀進行減壓濃縮，至比重為1.2時，得浸膏1380g，備用；（3）將（2）中的1380g浸膏混懸于4500ml水中，依次用4500ml石油醚、4500ml乙酸乙酯以及4500ml正丁醇進行萃取，每種溶劑萃取5次，再用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀蒸去溶劑，分別得石油醚、乙酸乙酯以及正丁醇萃取物390g、112g、405g；（4）將（3）中的石油醚萃取物（150g）經(jīng)100-200目硅膠柱色譜，用體積比25:1、20:1、15:1、10:1、7:1、5:1、2:1、0:1的石油醚-乙酸乙酯梯度洗脫得到Fr.1-Fr.8共8個組分，F(xiàn)r.1為6.4g，F(xiàn)r.2為6.5g，F(xiàn)r.3為3.1g，F(xiàn)r.4為16.1g，F(xiàn)r.5為3.2g，F(xiàn)r.6為60.8g，F(xiàn)r.7為2.8g，F(xiàn)r.8為39.3g，F(xiàn)r.7（1.5g）經(jīng)半制備高效液相色譜儀，以體積配比為80:20的甲醇-水為流動相，流速2.5ml/min，250×10mm，5μm的C18為固定相，紫外檢測器檢測波長為210nm，每次進樣50μL，分別收集6~13min，15~21min，22~29min，32~39min，41~46min的色譜峰，多次累加后蒸干，依次合并相同部分得到5個流分（Fr.7-1-Fr.7-5)，F(xiàn)r.7-1為0.5g，F(xiàn)r.7-2為0.3g，F(xiàn)r.7-3為0.2g，F(xiàn)r.7-4為0.2g，F(xiàn)r.7-5為0.05g，F(xiàn)r.7-4經(jīng)半制備高效液相色譜，以體積配比為78:22的甲醇-水為流動相，流速2.5ml/min，250×10mm，5μm的C18為固定相，紫外檢測器檢測波長為210nm，每次進樣50μL，收集42~44min的色譜峰，多次累加后蒸干，制備得到目標化合物對映-6,8(14),15-海松三烯酸(ent-pimar-6,8(14),15-trien-19-oicacid)(14mg)。實施例2化合物的制備采用以下步驟：（1）將10Kg黑果土當歸根晾干粉碎成粒徑0.1cm大小的顆粒，得黑果土當歸粉，將黑果土當歸粉在67℃的溫度下每次用60Kg84%濃度的乙醇回流提取3次，每次2.5小時，合并乙醇提取液，備用；（2）將步驟（1）制得的乙醇提取液經(jīng)80-120微米濾紙過濾并在50℃的溫度下用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀進行減壓濃縮，至比重為1.2時，得浸膏1340g，備用；（3）將（2）中的1340g浸膏混懸于4000ml水中，依次用4000ml石油醚、4000ml乙酸乙酯以及4000ml正丁醇進行萃取，每種溶劑萃取4次，再用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀蒸去溶劑，分別得石油醚、乙酸乙酯以及正丁醇萃取物372g、103g、396g；（4）將（3）中的石油醚萃取物（150g）經(jīng)100-200目硅膠柱色譜，用體積比25:1、20:1、15:1、10:1、7:1、5:1、2:1、0:1的石油醚-乙酸乙酯梯度洗脫得到Fr.1-Fr.8共8個組分，F(xiàn)r.1為6.8g，F(xiàn)r.2為6.9g，F(xiàn)r.3為3.7g，F(xiàn)r.4為17.3g，F(xiàn)r.5為2.8g，F(xiàn)r.6為58.2g，F(xiàn)r.7為2.9g，F(xiàn)r.8為37.0g，F(xiàn)r.7（1.5g）經(jīng)半制備高效液相色譜儀，以體積配比為80:20的甲醇-水為流動相，流速2.5ml/min，250×10mm，5μm的C18為固定相，紫外檢測器檢測波長為210nm，每次進樣50μL，分別收集6~13min，15~21min，22~29min，32~39min，41~46min的色譜峰，多次累加后蒸干，依次合并相同部分得到5個流分（Fr.7-1-Fr.7-5)，F(xiàn)r.7-1為0.5g，F(xiàn)r.7-2為0.3g，F(xiàn)r.7-3為0.3g，F(xiàn)r.7-4為0.2g，F(xiàn)r.7-5為0.05g，F(xiàn)r.7-4經(jīng)半制備高效液相色譜，以體積配比為78:22的甲醇-水為流動相，流速2.5ml/min，250×10mm，5μm的C18為固定相，紫外檢測器檢測波長為210nm，每次進樣50μL，收集42~44min的色譜峰，多次累加后蒸干，制備得到目標化合物對映-6,8(14),15-海松三烯酸(ent-pimar-6,8(14),15-trien-19-oicacid)(16mg)。實施例3化合物的制備采用以下步驟：（1）將10Kg黑果土當歸根晾干粉碎成粒徑0.1cm大小的顆粒，得黑果土當歸粉，將黑果土當歸粉在69℃的溫度下每次用60Kg88%濃度的乙醇回流提取5次，每次2小時，合并乙醇提取液，備用；（2）將步驟（1）制得的乙醇提取液經(jīng)80-120微米濾紙過濾并在50℃的溫度下用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀進行減壓濃縮，至比重為1.2時，得浸膏1410g，備用；（3）將（2）中的1410g浸膏混懸于4500ml水中，依次用4500ml石油醚、4500ml乙酸乙酯以及4500ml正丁醇進行萃取，每種溶劑萃取5次，再用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀蒸去溶劑，分別得石油醚、乙酸乙酯以及正丁醇萃取物395g、117g、411g；（4）將（3）中的石油醚萃取物（150g）經(jīng)100-200目硅膠柱色譜，用體積比25:1、20:1、15:1、10:1、7:1、5:1、2:1、0:1的石油醚-乙酸乙酯梯度洗脫得到Fr.1-Fr.8共8個組分，F(xiàn)r.1為7.2g，F(xiàn)r.2為7.4g，F(xiàn)r.3為3.9g，F(xiàn)r.4為17.8g，F(xiàn)r.5為3.1g，F(xiàn)r.6為57.3g，F(xiàn)r.7為3.2g，F(xiàn)r.8為36.3g，F(xiàn)r.7（1.5g）經(jīng)半制備高效液相色譜儀，以體積配比為80:20的甲醇-水為流動相，流速2.5ml/min，250×10mm，5μm的C18為固定相，紫外檢測器檢測波長為210nm，每次進樣50μL，分別收集6~13min，15~21min，22~29min，32~39min，41~46min的色譜峰，多次累加后蒸干，依次合并相同部分得到5個流分（Fr.7-1-Fr.7-5)，F(xiàn)r.7-1為0.5g，F(xiàn)r.7-2為0.3g，F(xiàn)r.7-3為0.2g，F(xiàn)r.7-4為0.2g，F(xiàn)r.7-5為0.1g，F(xiàn)r.7-4經(jīng)半制備高效液相色譜，以體積配比為78:22的甲醇-水為流動相，流速2.5ml/min，250×10mm，5μm的C18為固定相，紫外檢測器檢測波長為210nm，每次進樣50μL，收集42~44min的色譜峰，多次累加后蒸干，制備得到目標化合物對映-6,8(14),15-海松三烯酸(ent-pimar-6,8(14),15-trien-19-oicacid)(19mg)。實施例4化合物的制備采用以下步驟：（1）將10Kg黑果土當歸根晾干粉碎成粒徑0.1cm大小的顆粒，得黑果土當歸粉，將黑果土當歸粉在71℃的溫度下每次用60Kg92%濃度的乙醇回流提取4次，每次2小時，合并乙醇提取液，備用；（2）將步驟（1）制得的乙醇提取液經(jīng)80-120微米濾紙過濾并在50℃的溫度下用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀進行減壓濃縮，至比重為1.2時，得浸膏1480g，備用；（3）將（2）中的1480g浸膏混懸于5000ml水中，依次用5000ml石油醚、5000ml乙酸乙酯以及5000ml正丁醇進行萃取，每種溶劑萃取6次，再用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀蒸去溶劑，分別得石油醚、乙酸乙酯以及正丁醇萃取物387g、111g、408g；（4）將（3）中的石油醚萃取物（150g）經(jīng)100-200目硅膠柱色譜，用體積比25:1、20:1、15:1、10:1、7:1、5:1、2:1、0:1的石油醚-乙酸乙酯梯度洗脫得到Fr.1-Fr.8共8個組分，F(xiàn)r.1為7.5g，F(xiàn)r.2為7.7g，F(xiàn)r.3為4.2g，F(xiàn)r.4為18.2g，F(xiàn)r.5為3.2g，F(xiàn)r.6為61.3g，F(xiàn)r.7為3.3g，F(xiàn)r.8為34.2g，F(xiàn)r.7（1.5g）經(jīng)半制備高效液相色譜儀，以體積配比為80:20的甲醇-水為流動相，流速2.5ml/min，250×10mm，5μm的C18為固定相，紫外檢測器檢測波長為210nm，每次進樣50μL，分別收集6~13min，15~21min，22~29min，32~39min，41~46min的色譜峰，多次累加后蒸干，依次合并相同部分得到5個流分（Fr.7-1-Fr.7-5)，F(xiàn)r.7-1為0.4g，F(xiàn)r.7-2為0.4g，F(xiàn)r.7-3為0.25g，F(xiàn)r.7-4為0.2g，F(xiàn)r.7-5為0.05g，F(xiàn)r.7-4經(jīng)半制備高效液相色譜，以體積配比為78:22的甲醇-水為流動相，流速2.5ml/min，250×10mm，5μm的C18為固定相，紫外檢測器檢測波長為210nm，每次進樣50μL，收集42~44min的色譜峰，多次累加后蒸干，制備得到目標化合物對映-6,8(14),15-海松三烯酸(ent-pimar-6,8(14),15-trien-19-oicacid)(21mg)。實施例5化合物的制備采用以下步驟：（1）將10Kg黑果土當歸根晾干粉碎成粒徑0.1cm大小的顆粒，得黑果土當歸粉，將黑果土當歸粉在74℃的溫度下每次用60Kg95%濃度的乙醇回流提取5次，每次2小時，合并乙醇提取液，備用；（2）將步驟（1）制得的乙醇提取液經(jīng)80-120微米濾紙過濾并在50℃的溫度下用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀進行減壓濃縮，至比重為1.2時，得浸膏1520g，備用；（3）將（2）中的1520g浸膏混懸于4500ml水中，依次用4500ml石油醚、4500ml乙酸乙酯以及4500ml正丁醇進行萃取，每種溶劑萃取5次，再用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀蒸去溶劑，分別得石油醚、乙酸乙酯以及正丁醇萃取物420g、130g、450g；（4）將（3）中的石油醚萃取物（150g）經(jīng)100-200目硅膠柱色譜，用體積比25:1、20:1、15:1、10:1、7:1、5:1、2:1、0:1的石油醚-乙酸乙酯梯度洗脫得到Fr.1-Fr.8共8個組分，F(xiàn)r.1為9.5g，F(xiàn)r.2為8.8g，F(xiàn)r.3為3.5g，F(xiàn)r.4為18.0g，F(xiàn)r.5為3.7g，F(xiàn)r.6為65.3g，F(xiàn)r.7為3.6g，F(xiàn)r.8為35.3g，F(xiàn)r.7（1.5g）經(jīng)半制備高效液相色譜儀，以體積配比為80:20的甲醇-水為流動相，流速2.5ml/min，250×10mm，5μm的C18為固定相，紫外檢測器檢測波長為210nm，每次進樣50μL，分別收集6~13min，15~21min，22~29min，32~39min，41~46min的色譜峰，多次累加后蒸干，依次合并相同部分得到5個流分（Fr.7-1-Fr.7-5)，F(xiàn)r.7-1為0.4g，F(xiàn)r.7-2為0.2g，F(xiàn)r.7-3為0.2g，F(xiàn)r.7-4為0.3g，F(xiàn)r.7-5為0.1g，F(xiàn)r.7-4經(jīng)半制備高效液相色譜，以體積配比為78:22的甲醇-水為流動相，流速2.5ml/min，250×10mm，5μm的C18為固定相，紫外檢測器檢測波長為210nm，每次進樣50μL，收集42~44min的色譜峰，多次累加后蒸干，制備得到目標化合物對映-6,8(14),15-海松三烯酸(ent-pimar-6,8(14),15-trien-19-oicacid)(24mg)。實施例6本發(fā)明化合物的結構鑒定取實施例1制備的二萜類化合物對映-6,8(14),15-海松三烯酸(ent-pimar-6,8(14),15-trien-19-oicacid)，為白色無定型粉末（溶劑為氯仿）；測定方法為：用核磁共振，結合其它波譜技術鑒定結構。-48.0°(c0.11,CHCl3);IR(KBr)譜在3245-2500,1708,1636,910,863cm-1有吸收，表明分子中存在羧基、羥基和雙鍵。HRESI-MS譜顯示其準分子離子峰m/z299.2020[M-H]-(calcd.299.2011)，結合NMR譜確定其分子式為C20H28O2，不飽和度為7。1HNMR(附圖1，數(shù)據(jù)歸屬見表1)顯示分子中有3個甲基單峰，分別為δH1.32(3H,s),1.07(3H,s)及0.61(3H,s))，有1個單取代雙鍵信號（δ5.71(1H,dd,J=17.6,10.4Hz,H-15),4.96(1H,dd,J=10.4,2.0Hz,H-16a),4.86(1H,dd,J=17.6,2.0Hz,H-16b)），有1個三取代雙鍵信號（δ5.23(1H,s,H-14)），有1個順式二取代雙鍵信號（δ6.07(1H,dd,J=11.2,2.4Hz,H-6),6.03(1H,brd,J=11.2Hz,H-7)）;13CNMR(附圖2，數(shù)據(jù)歸屬見表1)顯示分子中有20個碳，其中有5個季碳(含1個羧基碳和1個烯碳)，6個次甲基(含4個烯碳)，6個亞甲基(含1個烯碳)及3個甲基。結合HSQC相關譜(附圖3)，并對比文獻數(shù)據(jù)可證實，該化合物與已知化合物ent-pimar-8(14),15–19-oicacid結構相似，區(qū)別在于分子中多了1個雙鍵(δC127.4及128.2)，少了2個亞甲基(δC24.3及36.5)；在HMBC譜(附圖6)中可看到H-6(δ6.07)與C-5(δ55.5)有相關，H-7(δ6.03)與C-8(δ135.9)有相關，證實C-6及C-7位為一雙鍵。進一步經(jīng)HMBC相關(附圖4)、COSY相關(附圖5)和ROESY(附圖6)及與文獻(KangO.H.;ChaeH.S.;ChoiJ.G.;OhY.C.;LeeY.S.;KimJ.H.;SeungM.J.;JangH.J.;LeeJ.H.;ShinD.H.;KwonD.Y.EuropeanJournalofPharmacology,2008,601,179-185)對比證實，使化合物的結構最終得到確認，命名為對映-6,8(14),15-海松三烯酸(ent-pimar-6,8(14),15-trien-19-oicacid)。實施例7取實施例2制備的化合物，為黃色膠狀物；按實施例6中的方法進行結構測定，結果為：其結構同實施例6，分子式為C20H28O2。確認實施例2制備的化合物為所述的二萜類化合物對映-6,8(14),15-海松三烯酸(ent-pimar-6,8(14),15-trien-19-oicacid)。實施例8取實施例3制備的化合物，為黃色膠狀物；按實施例6中的方法進行結構測定，結果為：其結構同實施例6，分子式為C20H28O2。確認實施例3制備的化合物為所述的二萜類化合物對映-6,8(14),15-海松三烯酸(ent-pimar-6,8(14),15-trien-19-oicacid)。實施例9取實施例4制備的化合物，為黃色膠狀物；按實施例6中的方法進行結構測定，結果為：其結構同實施例6，分子式為C20H28O2。確認實施例4制備的化合物為所述的二萜類化合物對映-6,8(14),15-海松三烯酸(ent-pimar-6,8(14),15-trien-19-oicacid)。實施例10取實施例5制備的化合物，為黃色膠狀物；按實施例6中的方法進行結構測定，結果為：其結構同實施例6，分子式為C20H28O2。確認實施例5制備的化合物為所述的二萜類化合物對映-6,8(14),15-海松三烯酸(ent-pimar-6,8(14),15-trien-19-oicacid)。實施例11本發(fā)明化合物抗腫瘤活性檢測取實施例1~5所制備的任一二萜類化合物進行抗腫瘤活性檢測試驗，試驗情況如下：采用改良MTT法評價本發(fā)明化合物對腫瘤細胞的增值抑制作用：取備用的腫瘤細胞懸液接種于96孔培養(yǎng)板，90μL/孔，繼續(xù)培養(yǎng)24h后加入不同濃度的受試樣品，10μL/孔，使其終濃度為100、10、1、0.1、0.01μg/mL，每個濃度均設3個復孔。順鉑（DDP）為陽性對照，等體積RPMI1640培養(yǎng)基為陰性對照。同時設化合物100、10μg/mL時相應的DMSO濃度為溶媒對照，以消除DMSO對細胞生長的影響。加藥后繼續(xù)置于37℃，5%CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)72h，每孔加入MTT（5mg/mL）20μL，繼續(xù)培養(yǎng)4h，每孔加入三聯(lián)液[10%SDS-5%異丁醇—0.012mol/LHCl（W/V/V）]100μL溶解甲臜。用酶標儀在570nm波長下測定各孔的OD值。按下列公式計算細胞增值抑制率：抑制率（%）=（OD值對照孔—OD值給藥孔）/OD值對照孔×100%數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析：采用MicrosoftExcel2003計算抑制率，采用logit法，SPSS11.5軟件包計算半數(shù)抑制濃度IC50。計算半數(shù)抑制濃度IC50，對人肺腺癌細胞株(A549)、人前列腺癌細胞株(PC3)及人急性髓系白血病細胞株(HL60)的半數(shù)抑制濃度(IC50)測定結果分別為5.6±0.7μM，5.1±0.9μM，8.9±0.9μM，表明本發(fā)明的化合物具有較好的抗腫瘤活性。以上所述僅為本發(fā)明的較佳實施例而已，并不用以限制本發(fā)明，凡在本發(fā)明的精神和原則之內(nèi)所作的任何修改等同替換和改進等，均應包含在本發(fā)明的保護范圍之內(nèi)。