本發(fā)明屬于生物醫(yī)學(xué)領(lǐng)域，涉及一種能夠刺激促紅細(xì)胞生成素分泌的環(huán)狀多肽，具體地說，本發(fā)明涉及一種能夠和促紅細(xì)胞生成素受體結(jié)合并激活促紅細(xì)胞生成素受體或者能起促紅細(xì)胞生成素激動(dòng)作用的促紅細(xì)胞生成素模擬肽的制備方法，本發(fā)明還涉及所述模擬肽衍生物在制備治療以缺乏紅細(xì)胞生成素或紅細(xì)胞群缺少或缺陷為特征的疾病的藥物中的用途。
背景技術(shù)：
：促紅細(xì)胞生成素(EPO)是體內(nèi)紅細(xì)胞增殖、分化以及維持外周循環(huán)紅細(xì)胞數(shù)量正常的最主要的造血生長因子，臨床上主要用于：腎功能不全所致的貧血，非骨髓惡性腫瘤應(yīng)用化療引起的貧血。中國慢性腎臟病(CKD)的患者人數(shù)估計(jì)約為1.2億，其中腎性貧血是影響CKD患者生活質(zhì)量的最常見并發(fā)癥，全國每年新發(fā)腫瘤病例約為312萬例，約50％的化療患者會(huì)出現(xiàn)貧血。近年來，我國的CKD的患病率逐年增高，已成為影響公眾健康的問題之一，根據(jù)北京大學(xué)及浙江大學(xué)調(diào)研數(shù)據(jù)：CKD的總患病率為10.8％(10.2-11.3)，因此，中國慢性腎臟病的患者人數(shù)估計(jì)約為1.195億(1.129-1.250億)其中腎性貧血是影響CKD患者生活質(zhì)量的最常見并發(fā)癥。有研究表明隨著腎功能的降低(CKD期數(shù)的增加)貧血的發(fā)生率是增加的。其中CKD3期患者有接近一半(49.9％)存在貧血，血透析患者貧血發(fā)生率至少較非CKD患者高10倍。全國腫瘤登記中心發(fā)布的《2012年中國腫瘤登記年報(bào)》顯示：全國每年新發(fā)腫瘤病例估計(jì)約為312萬例，平均每天8550人，全國每分鐘有6人被診斷為惡性腫瘤?；熑詾槟壳澳[瘤治療的最重要手段，約50％的化療患者會(huì)出現(xiàn)貧血。由此可以看出國內(nèi)貧血市場巨大。環(huán)狀多肽相對(duì)于直線肽鏈而言的，具有生物活性環(huán)肽具有明確的限制構(gòu)像，能夠與受體很好的契合。環(huán)肽對(duì)于氨肽酶和羧肽酶的敏感性大大降低，與直鏈肽相比，環(huán)肽在抗真菌和殺滅腫瘤細(xì)胞等方面都表現(xiàn)出天然的優(yōu)勢，將直線肽鏈形成環(huán)肽，或者在具活性的直線肽鏈上連接一個(gè)環(huán)肽單元，往往可使多肽的活性和穩(wěn)定性都得到明顯提高。Tamilarasu等通過計(jì)算機(jī)模擬構(gòu)想發(fā)現(xiàn)，肽鏈在環(huán)合前后構(gòu)想變化越小，對(duì)直線肽鏈的生物活性保持就越有利，而應(yīng)用側(cè)鏈成環(huán)對(duì)肽鏈的構(gòu)想影響最小，總之，環(huán)肽獨(dú)特的結(jié)構(gòu)使之在多肽藥物結(jié)構(gòu)穩(wěn)定性研究中備受關(guān)注，有廣闊的開發(fā)和應(yīng)用前景。目前EPO蛋白都是通過發(fā)酵手段得到的，由于其發(fā)酵條件要求苛刻，成本極高也限制了他的應(yīng)該，然而某種程度上能夠作用促紅細(xì)胞生成素受體的肽已經(jīng)被確定和敘述。特別是確定了一組含有主要肽段的肽，這些肽可以和促紅細(xì)胞生成素受體結(jié)合并能剌激促紅細(xì)胞生成素細(xì)胞的分化增殖。但是能夠刺激紅細(xì)胞增殖分化的肽的EC50卻很低，在20nM和250nM之間，因此這些肽在臨床應(yīng)用上受到了較大的限制。由Affymax/Takeda共同研發(fā)的聚乙二醇肽peginesatide,Omontys就是依據(jù)能夠激動(dòng)促紅細(xì)胞生成素合成的多肽經(jīng)聚乙二醇修飾得到的，Omontys是一種新紅細(xì)胞生成-刺激藥物(ESA)幫助紅細(xì)胞形成。其作用通過刺激骨髓生成更多紅細(xì)胞，通常測量血紅蛋白水平，減低慢性腎病患者輸血需求。Omontys是一個(gè)月注射一次給藥，但是由于引發(fā)嚴(yán)重過敏反應(yīng),包括潛在致命過敏反應(yīng)而退市，據(jù)分析可能是由于PEG的超敏反應(yīng)導(dǎo)致的，本文的目的就是通過使用環(huán)肽修飾的方法延長主要肽段的作用時(shí)間，避免超敏反應(yīng)。技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：為了克服現(xiàn)有技術(shù)的不足，本發(fā)明提供了一種生物活性更好、生物利用度更高的促紅細(xì)胞生成素環(huán)狀多肽的制備方法及其應(yīng)用。一方面，本發(fā)明的目的是提供一種具有長效促紅細(xì)胞生成功能的環(huán)狀多肽及其制備方法。再一方面，本發(fā)明還提供了本發(fā)明促紅細(xì)胞生成素模擬肽衍生物的治療以缺乏紅細(xì)胞生成素或紅細(xì)胞群缺少或缺陷為特征的疾病的藥物中的用途。本發(fā)明的又一方面還提供一種藥物組合物，該藥物組合物包含本發(fā)明的促紅細(xì)胞生成素的環(huán)狀多肽衍生物。優(yōu)選地，本發(fā)明藥物組合物為注射劑；更優(yōu)選地，本發(fā)明藥物組合物為凍干粉針或溶液注射劑。在一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案中，本發(fā)明藥物組合物還包含藥學(xué)上可接受的輔料成分。本發(fā)明提供了一種具有體內(nèi)生物活性的促紅細(xì)胞生成素環(huán)狀多肽衍生物及其可藥用鹽，其中，所述環(huán)狀多肽衍生物為SEQIDNO:1如上序列所示直鏈1：(Ac)GGLYADHMGPIT(Nal)VKQPLR(Sar)K直鏈2：HMGPIT(Nal)V其中直鏈1N6的Asp側(cè)鏈與鏈2的N末端形成酰胺鍵，直鏈1N15的Lys的側(cè)鏈與鏈2的C末端形成酰胺鍵SEQIDNO：2如上序列所示直鏈1：(Ac)GGLYACHMGPIT(Nal)VKQPLR(Sar)K直鏈2：(Ac)GGLYACHMGPIT(Nal)V其中直鏈1N6的Cys側(cè)鏈巰基與鏈2的Cys側(cè)鏈巰基形成二硫鍵，直鏈1N15的Lys的側(cè)鏈與鏈2的C末端形成酰胺鍵SEQIDNO：3如上序列所示直鏈1：(Ac)CGLYAKHMGPIT(Nal)VKQPLR(Sar)K直鏈2：(Ac)CGLYAKHMGPIT(Nal)V其中直鏈1N1的Cys側(cè)鏈巰基與鏈2的Cys側(cè)鏈巰基形成二硫鍵，直鏈1N15的Lys的側(cè)鏈與鏈2的C末端形成酰胺鍵。根據(jù)SEQIDNO:1選擇氨基酸，使用Fmoc固相多肽合成法合成多肽，其中，本發(fā)明所述的Fmoc固相多肽合成方法是指以聚合物樹脂作為固相反應(yīng)基質(zhì)，將氨基端Fmoc保護(hù)的氨基酸在偶聯(lián)試劑的存在下依次縮合，從而合成多肽的合成方法。首先合成直鏈1，然后片段合成直鏈二，通過直鏈1N1的Cys側(cè)鏈巰基與鏈2的Cys側(cè)鏈巰基形成二硫鍵，直鏈1N15的Lys的側(cè)鏈與鏈2的C末端形成酰胺鍵來形成環(huán)肽，優(yōu)選地，所述制備方法還包括將制得的二聚體純化，經(jīng)脫鹽及冷凍干燥得到多肽凍干粉的步驟；優(yōu)選地，所述純化使用HPLCC18半制備柱進(jìn)行，流動(dòng)相為乙腈。與現(xiàn)有技術(shù)相比,本專利涉及的具有長效促紅細(xì)胞生成功能的環(huán)狀多肽能夠明顯刺激小鼠外周血網(wǎng)織紅細(xì)胞計(jì)數(shù)的升高，說明它們刺激紅細(xì)胞生成，同時(shí)還能夠大大延長藥物在體內(nèi)的半衰期。具有長效促紅細(xì)胞生成功能的環(huán)狀多肽和促紅細(xì)胞生成素蛋白對(duì)成熟的紅細(xì)胞、血細(xì)胞壓積、血紅蛋白含量沒有明顯的影響，對(duì)外周血白細(xì)胞計(jì)數(shù)液沒有明顯影響。具體實(shí)施方式下面結(jié)合具體實(shí)施方式對(duì)本發(fā)明進(jìn)行進(jìn)一步的詳細(xì)描述，給出的實(shí)施例僅為了闡明本發(fā)明，而不是為了限制本發(fā)明的范圍。在以下的實(shí)施例中，未詳細(xì)描述的各種過程和方法是本領(lǐng)域中公知的常規(guī)方法。實(shí)施例1促紅細(xì)胞生成素環(huán)狀多肽的合成以下結(jié)合具體實(shí)施例對(duì)本發(fā)明作進(jìn)一步詳細(xì)說明。本發(fā)明以SEQIDNO:1為例，其中直鏈的制備使用Fmoc固相多肽合成方法，使用CSBio公司生產(chǎn)的CS336X型儀器進(jìn)行本發(fā)明的多肽的合成。合成的方法按照生產(chǎn)商的儀器說明書進(jìn)行。本文所述的Fmoc固相多肽合成方法是指以聚合物樹脂作為固相反應(yīng)基質(zhì)，將氨基端Fmoc保護(hù)的氨基酸在偶聯(lián)試劑的存在下依次縮合，從而合成多肽的合成方法。其具體方法參見Fmocsolidphasepeptidesynthesis:apracticalapproach,2000,OxfordUniversityPress。并通過氧化方法形成分子間的二硫鍵，例如20％DMSO氧化法以及碘氧化法。肽鏈間的酰胺鍵的形成方法同肽鏈間的方法，不同之處就是延長時(shí)間。將制得的多肽使用HPLCC18半制備柱進(jìn)行純化，流動(dòng)相為乙腈。經(jīng)脫鹽及冷凍干燥得到多肽凍干粉。實(shí)施例2.促紅細(xì)胞生成素環(huán)狀多肽對(duì)小鼠的作用采用小鼠評(píng)價(jià)并比較促紅細(xì)胞生成素環(huán)狀多肽及促紅細(xì)胞生成素蛋白對(duì)小鼠紅細(xì)胞生成的影響。其中，EPO藥品購自沈陽三生制藥有限責(zé)任公司；昆明種小鼠，購自中科院上海實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心，體重25～30g，均為雌性小鼠，試驗(yàn)中各組動(dòng)物數(shù)：10只，分為5組。其中，3組小鼠分別皮下注射SEQIDNO：1、SEQIDNO：2、SEQIDNO：3，1組小鼠注射促紅細(xì)胞生成素蛋白，1組小鼠為空白對(duì)照，注射PBS緩沖液，劑量均為4.5mg/kg，連續(xù)三天，然后處死小鼠，取全血進(jìn)行外周血細(xì)胞及網(wǎng)織紅細(xì)胞計(jì)數(shù)，血細(xì)胞計(jì)數(shù)用全自動(dòng)血球計(jì)數(shù)儀計(jì)數(shù)。結(jié)果如表1所示，發(fā)現(xiàn)促紅細(xì)胞生成素環(huán)狀多肽及促紅細(xì)胞生成素蛋白均能明顯刺激小鼠外周血網(wǎng)織紅細(xì)胞計(jì)數(shù)的升高，說明它們剌激紅細(xì)胞生成(見表1)。表1、促紅細(xì)胞生成素模擬肽衍生物對(duì)小鼠網(wǎng)織紅細(xì)胞生成的影響名稱劑量網(wǎng)織紅細(xì)胞數(shù)目空白PBS緩沖液135.44±2.13SEQIDNO：14.5mg/kg572.31±1.61SEQIDNO：24.5mg/kg583.23±2.01SEQIDNO：34.5mg/kg561.15±2.23EPO4.5mg/kg432.11±1.93。當(dāng)前第1頁1 2 3