本發(fā)明屬于生物
技術領域：
，涉及一種能介導多個基因同時過表達或者敲低的piggyBac轉座子系統(tǒng)及其制備和應用方法。本發(fā)明可用于細胞株改造、基因功能研究和基因治療。
背景技術：
：多基因同時操作技術在細胞株改造、基因功能研究和基因治療等領域有非常重要的應用。在細胞株改造領域，多基因同時操作在多重報告基因標記，提高抗體的活性和產量，誘導多能干細胞等分支領域被廣泛應用。在基因功能研究過程中，特別是當要確立兩個基因之間的相互作用(例如：基因間上下位效應)時，需要同時激活(過表達)這兩個基因，或同時失活(敲低)這兩個基因，或激活其中一個的同時失活另一個，隨后通過表型分析確立基因之間的相互作用關系。這種遺傳分析方法在研究各種細胞內生化代謝通路和細胞信號轉導通路中發(fā)揮了重要作用。在基因治療領域，多基因同時操作允許在導入對治療有價值的基因的同時，導入自殺基因、激活或失活輔助靶點，從而使得基因治療技術更為經濟、安全、有效?，F(xiàn)有對多個基因進行過表達或者敲低時大多采用的方法是，將單個基因過表達或敲低的構建裝入不同的基因遞送載體，然后同時或依次導入靶細胞。這種多個載體分開導入的方法存在以下兩個缺點：1)不同載體在單個靶細胞中的導入比例不可控；2)在建立多載體穩(wěn)定導入的細胞系時需要使用多個不同藥物篩選標記。解決上述問題的有效途徑是使用單一載體介導多個基因同時過表達或者敲低。piggyBac轉座子系統(tǒng)是現(xiàn)有在哺乳動物細胞中效率最高的非病毒載體。piggyBac轉座子早先于粉斑夜蛾(Trichoplusiani)的基因組中被發(fā)現(xiàn)，大小為2472bp，兩端包含反向末端重復序列(ITR)，中間包含編碼594個氨基酸的轉座酶。piggyBac轉座子類屬于DNA轉座子，通過剪切和粘貼機制可以由位于外源DNA或內源基因組的起始位點切離，并隨機插入基因組中的另一位點。piggyBac轉座子插入靶位點的序列為四核苷酸的TTAA。piggyBac轉座子在切離TTAA時一般不會改變原位點及原位點的附近序列，即所謂無痕轉座(Cary等，1989，Virology172：156-169；Fraser等，1995，Virology211：397-407；Fraser等，1996，InsectMolecularBiology5：141-151)。2005年，復旦大學研究人員發(fā)現(xiàn)，piggyBac轉座子能在體外培養(yǎng)哺乳動物細胞及小鼠基因組中轉座，并能攜帶至多10kb的外源基因而不 影響其轉座效率(Ding等，2005，Cell122：473-483)。隨后，又有研究發(fā)現(xiàn)，piggyBac轉座子可以介導200kb的外源核酸片段導入細胞基因組(Li等，2013，Dis.Mod.Mech.Mar.)。基于piggyBac轉座子能攜帶大片段外源基因以及能在哺乳動物細胞中介導高效轉座的特點，其在介導多個基因同時過表達或者敲低中的潛在應用有待被進一步開發(fā)。技術實現(xiàn)要素：為了有效地使用單一載體進行多個基因同時操作，本發(fā)明提供了一種能介導多個基因同時過表達或者敲低的piggyBac轉座子系統(tǒng)。本發(fā)明在同時過表達多個基因時所采取的技術方案是將多個基因串聯(lián)在同一DNA分子內，并置于缺陷piggyBac轉座子內，從而使得轉錄得到的單一信使RNA可以同時過表達多個蛋白質。在構建多基因過表達載體的一個優(yōu)選例中，多個基因通過2A肽連接。本發(fā)明在同時敲低多個基因時所采取的技術方案是將多個基因敲低構建串聯(lián)在同一DNA分子內，并置于缺陷piggyBac轉座子內，從而使得轉錄得到的單一信使RNA可以形成靶向多個基因的短發(fā)夾RNA，敲低這些基因。本發(fā)明在同時過表達一些基因敲低另一些基因時所采取的技術方案是將敲低多個基因的構建串聯(lián)在過表達多個基因的構建的3’端，并置于缺陷piggyBac轉座子內，從而使得轉錄得到的單一信使RNA可以在過表達多個蛋白的同時形成多個短發(fā)夾RNA去敲低另一些基因。本發(fā)明的有益效果是，提供了一種能用于多基因同時操作的piggyBac轉座子系統(tǒng)。該系統(tǒng)可有效地用于細胞株改造、基因功能研究和基因治療。附圖說明下面結合附圖對本發(fā)明進一步說明。圖1是本發(fā)明多基因同時操作piggyBac轉座子系統(tǒng)中缺陷piggyBac轉座子的設計圖。圖A為同時過表達兩個基因(基因A和基因B)的缺陷piggyBac轉座子構建，該構建所包含的元件從5’端到3’端依次是：PBL：piggyBac轉座子左臂；Blast：blasticidine抗藥篩選標記；CAG：雞β-肌動蛋白復合啟動子；GeneA：基因A的編碼序列；2A：2A肽；GeneB：基因B的編碼序列；PA：兔β-球蛋白polyA；PBR：piggyBac轉座子右臂。圖B為同時敲低兩個基因(基因1和基因2)的缺陷piggyBac轉座子構建，該構建所包含的元件從5’端到3’端依次是：PBL；Blast；CMV：巨細胞病毒早期啟動子；shRNA1：基于miR30骨架敲低基因1的構建；shRNA2：基于miR30骨架敲低基因2的構建；PA，牛生長激素polyA；PBR。圖C為過表達一個基因(基因A)同時敲低另一個基因(基因1)的缺 陷piggyBac轉座子構建，該構建所包含的元件從5’端到3’端依次是：PBL；Blast；CMV；GeneA；shRNA1；PA；PBR。圖2是本發(fā)明多基因同時操作piggyBac轉座子系統(tǒng)用于同時過表達多個基因的一個實施例。圖A為同時過表達兩個基因(熒光素酶基因Luc和綠熒光蛋白基因EGFP)的缺陷piggyBac轉座子的示意圖。穩(wěn)定攜帶該轉座子的H1人類胚胎干細胞能同時表達綠熒光蛋白(圖B)和熒光素酶(圖C)。圖3是本發(fā)明多基因同時操作piggyBac轉座子系統(tǒng)用于同時敲低多個基因的一個實施例。圖A為同時敲低兩個基因(P53基因和PTEN基因)的缺陷piggyBac轉座子的示意圖。圖B：穩(wěn)定攜帶該轉座子的H1人類胚胎干細胞，其內源P53和PTEN基因的表達量被同時敲低。圖B中的western印跡實驗選用β-微管蛋白作為內參。圖4是本發(fā)明多基因同時操作piggyBac轉座子系統(tǒng)用于過表達一個基因同時敲低另一個基因的一個實施例。圖A為過表達一個基因(紅熒光蛋白DsRed2)同時敲低另一個基因(GAPDH基因)的缺陷piggyBac轉座子的示意圖。圖B：穩(wěn)定攜帶該轉座子的H1人類胚胎干細胞表達DsRed2紅熒光蛋白(圖B)的同時其內源GAPDH基因的表達量被敲低(圖C)。圖C中的western印跡實驗選用β-微管蛋白作為內參。具體實施方式本發(fā)明提供了一種能介導多基因同時過表達或者敲低的piggyBac轉座子系統(tǒng)。本發(fā)明使用單一載體對多基因進行同時操作。本發(fā)明多基因同時操作piggyBac轉座子系統(tǒng)可用于細胞株改造、基因功能研究和基因治療。下面結合具體實施例，進一步闡明創(chuàng)造和應用本發(fā)明的關鍵步驟。1.多基因同時過表達。本發(fā)明應用于多基因同時過表達的一個實施例中，多基因同時操作piggyBac轉座子系統(tǒng)被用于同時過表達熒光素酶基因Luc和綠熒光蛋白基因EGFP。在制備本實施例中攜帶熒光素酶基因Luc和綠熒光蛋白基因EGFP的缺陷piggyBac轉座子的過程中，所涉及的質粒抽提，質粒轉化，大腸桿菌培養(yǎng)，PCR，酶切，Klenow酶末端補平，連接為本領域人員所熟知的實驗。常規(guī)實驗條件可參照M.R.格林和J.薩姆布魯克編著的《分子克隆實驗指南》第四版。攜帶熒光素酶基因Luc和綠熒光蛋白基因EGFP的缺陷piggyBac轉座子的具體建立步驟是：抗藥篩選標記Blast編碼基因由pLKO.1-Blast質粒(購自Addgene)酶切獲得，裝入pcDNA3質粒(購自Addgene)的StuI和BstBI位點間。隨后，抗藥篩選標記Blast基因 表達盒再通過酶切裝入缺陷piggyBac轉座子中的NheI位點內，獲得PB[Blast]質粒。使用引物EcoLucF(SEQIDNo：1)和2ALucR(SEQIDNo：2)，以pGL3-Basic質粒(購自Promega)為模板，PCR擴增熒光素酶Luc編碼基因；使用引物2AGFPF(SEQIDNo：3)和EcoGFPR(SEQIDNo：4)，以pCAG-EGFP質粒(購自Addgene)為模板，PCR擴增綠熒光蛋白EGFP編碼基因。使用引物EcoLucF(SEQIDNo：1)和EcoGFPR(SEQIDNo：4)，以Luc和EGFP片段為模板，重疊延伸PCR擴增獲得Luc-2A-GFP編碼基因。隨后，酶切裝入pCAG-EGFP質粒的兩個EcoRI位點間。雞β-肌動蛋白復合啟動子CAG、Luc-2A-EGFP編碼序列和兔β-球蛋白polyA由SalI和HindIII酶切，末端補平后，裝入PB[Blast]質粒中的PmeI位點內。最終獲得的用于同時過表達熒光素酶基因Luc和綠熒光蛋白基因EGFP的piggyBac轉座子PB[Blast，Luc-2A-GFP]如圖2所示。在應用PB[Blast，Luc-2A-GFP]轉座子同時過表達熒光素酶基因Luc和綠熒光蛋白基因EGFP的一個具體實施例中，PB[Blast，Luc-2A-GFP]轉座子在人胚胎干細胞中同時過表達Luc和EGFP。人胚胎干細胞培養(yǎng)于Matrigel(購自BDPharmingen)包被的培養(yǎng)皿上，培養(yǎng)基的成分為：DMEM/F12(購自Gibco)，1％非必需氨基酸，1％L型谷氨酰胺(購自Invitrogen)，50ng/mL成纖維細胞生長因子(購自Millipore)，1xN2添加物和1xB27添加物(購自Invitrogen)。培養(yǎng)箱條件設定為37℃，5％CO2，5％O2，90-95％濕度。將PB[Blast，Luc-2A-GFP]轉座子的核酸和編碼piggyBac轉座酶的核酸各1ug與10uLLipofectamine2000脂質體(購自Invitrogen)混合于500uLOpti-MEM培養(yǎng)基中。收集106H1人類胚胎干細胞懸浮于核酸脂質體混合液，37℃轉染孵育15分鐘。隨后，將被轉染的H1人類胚胎干細胞置于含2mL培養(yǎng)基并由Matrigel包被的6孔板內培養(yǎng)，并在培養(yǎng)基中加入1μg/mlBlasticidine(購自Invitrogen)，藥物篩選兩周，得到攜帶轉座子的H1人類胚胎干細胞。攜帶PB[Blast，Luc-2A-GFP]轉座子的H1人類胚胎干細胞同時過表達熒光素酶基因Luc和綠熒光蛋白基因EGFP。其中綠熒光可使用Nikon熒光顯微鏡用藍光照射觀察，如圖2所示。檢測熒光素酶表達的具體方法是：在培養(yǎng)基中加入150ug/mL熒光素酶底物D-luciferin(購自Sigma)，隨后使用XenogenIVISspectrum成像儀觀察熒光信號，如圖2所示。2.多基因同時敲低。本發(fā)明應用于多基因同時敲低的一個實施例中，多基因同時操作piggyBac轉座子系 統(tǒng)被用于同時敲低內源P53基因和PTEN基因。攜帶P53基因和PTEN基因敲低構建的缺陷piggyBac轉座子的具體建立步驟是：分別以含有靶向P53基因和PTEN基因的短發(fā)夾RNA編碼序列的寡核苷酸shP53(SEQIDNo：5)和shPTEN(SEQIDNo：6)為模板，使用引物TRIPZF(SEQIDNo：7)和TRIPZR(SEQIDNo：8)，用VENT聚合酶(購自NewEnglandBiolabs)PCR擴增。上述PCR反應的反應體系和反應條件如表1和表2所示。PCR擴增后的產物酶切裝入pTRIPZ(購自Openbiosystems)的XhoI和EcoRI位點間。表1：PCR擴增短發(fā)夾RNA編碼序列的反應體系。10xThermoPol緩沖液(購自NEB)5uLDMSO2.5uL10mMdNTP1uL10uMTRIPZF引物2.5uL10uMTRIPZR引物2.5uL100ng/uLshP53或shPTEN模板DNA1uL100mMMg2SO41uL2U/uLVENT聚合酶1uL水33.5uL總體積50uL表2：PCR擴增短發(fā)夾RNA編碼序列的反應條件。將P53基因和PTEN基因敲低構建從pTRIPZ質粒骨架上通過ClaI和MluI酶切，末端補平，先后裝入pcDNA3(購自Addgene)質粒的HindIII位點和BamHI位點。隨后通過酶切將巨細胞病毒早期啟動子CMV、P53基因和PTEN基因敲低構建shP53和shPTEN，以及牛生長激素polyA裝入PB[Blast]質粒的PmeI位點內。最終獲得的用于同時敲低內源P53基因和PTEN基因的piggyBac轉座子PB[Blast，shP53，shPTEN]如圖3所示。在應用PB[Blast，shP53，shPTEN]轉座子同時敲低內源P53基因和PTEN基因的一個具體實施例中，PB[Blast，shP53，shPTEN]轉座子在H1人類胚胎干細胞中同時敲低內源P53基因和PTEN基因。將PB[Blast，shP53，shPTEN]轉座子的核酸和編碼piggyBac轉座酶的核酸各1ug與10uLLipofectamine2000脂質體(購自Invitrogen)混合于500uLOpti-MEM培養(yǎng)基中。收集106H1人類胚胎干細胞懸浮于核酸脂質體混合液，37℃轉染孵育15分鐘。隨后，將被轉染的H1人類胚胎干細胞置于含2mL培養(yǎng)基并由Matrigel包被的6孔板內培養(yǎng)，并在培養(yǎng)基中加入1μg/mlBlasticidine(購自Invitrogen)，藥物篩選兩周，得到攜帶轉座子的H1人類胚胎干細胞。攜帶PB[Blast，shP53，shPTEN]轉座子的H1人類胚胎干細胞其內源P53基因和PTEN基因的表達量被降低。檢測內源基因表達量的方法是Western印跡實驗，其中涉及的SDS-PAGE凝膠電泳，轉膜，免疫雜交，和顯色為本領域人員所熟知的實驗。常規(guī)實驗條件可參照Abeam公司提供的Western印跡實驗說明書。檢測內源P53基因和PTEN基因的表達量時，使用的P53和PTEN抗體(購自CellSignaling)的稀釋比例皆為1∶1000。內參β-微管蛋白抗體(購自Abcam)的稀釋比例為1∶5000。3.同時過表達一些基因敲低另一些基因。本發(fā)明應用于同時過表達一些基因敲低另一些基因的一個實施例中，多基因同時操作piggyBac轉座子系統(tǒng)被用于同時過表達DsRed2紅色熒光蛋白并敲低GAPDH基因。攜帶DsRed2紅熒光蛋白表達盒和GAPDH基因敲低構建的缺陷piggyBac轉座子的具體建立步驟是：DsRed2紅熒光蛋白由pDsRed2-N1質粒通過AgeI和NotI酶切，末端補平后裝入pcDNA3質粒(購自Addgene)的HindIII位點。以靶向GAPDH基因的短發(fā)夾RNA編碼序列的寡核苷酸shGAPDH(SEQIDNo：9)為模板，使用引物TRIPZF(SEQIDNo：7)和TRIPZR(SEQIDNo：8)，用VENT聚合酶(購自NewEnglandBiolabs)PCR擴增。PCR擴增后的產物酶切裝入pTRIPZ(購自Openbiosystems)的XhoI和EcoRI位點間。將GAPDH基因敲低構建從pTRIPZ質粒骨架上通過ClaI和MluI酶切，末端補平，裝入pcDNA3(購自Addgene)質粒的BamHI位點。隨后通過酶切將巨細胞病毒早期啟動子CMV、DsRed2紅熒光基因編碼序列、GAPDH基因敲低構建shGAPDH，以及牛生長激素polyA裝入PB[Blast]質粒的PmeI位點內。最終獲得的用于同時過表達DsRed2紅熒光蛋白并敲低內源GAPDH基因的piggyBac轉座子PB[Blast，DsRed，shGAPDH]如圖4所示。在應用PB[Blast，DsRed，shGAPDH]轉座子同時過表達DsRed2紅熒光蛋白并敲低內源GAPDH基因的一個具體實施例中，PB[Blast，DsRed，shGAPDH]轉座子在H1人類胚胎干細胞中同時過表達DsRed2紅熒光蛋白并敲低內源GAPDH基因。將PB[Blast，DsRed，shGAPDH]轉座子的核酸和編碼piggyBac轉座酶的核酸各1ug與10uLLipofectamine2000脂質體(購自Invitrogen)混合于500uLOpti-MEM培養(yǎng)基中。收集106H1人類胚胎干細胞懸浮于核酸脂質體混合液，37℃轉染孵育15分鐘。隨后，將被轉染的H1人類胚胎干細胞置于含2mL培養(yǎng)基并由Matrigel包被的6孔板內培養(yǎng)，并在培養(yǎng)基中加入1μg/mlBlasticidine(購自Invitrogen)，藥物篩選兩周，得到攜帶轉座子的H1人類胚胎干細胞。攜帶PB[Blast，DsRed，shGAPDH]轉座子的H1人類胚胎干細胞過表達DsRed2紅熒光蛋白的同時其內源GAPDH基因的表達量被降低。其中紅色熒光可使用Nikon熒光顯微鏡用綠光照射觀察，如圖4所示。檢測內源GAPDH基因表達量的方法是Western印跡實驗，其中使用的GAPDH抗體(購自Abcam)的稀釋比例為1∶1000。內參β-微管蛋白抗體(購自Abcam)的稀釋比例為1∶5000。在本發(fā)明的另一些實施例中，多基因同時操作轉座子系統(tǒng)可以通過磷酸鈣轉染、聚乙二醇-聚乙烯亞胺共聚物轉染、或電穿孔轉染導入體外培養(yǎng)的動物細胞。在本發(fā)明的另一些實施例中，多基因同時操作轉座子系統(tǒng)可以被裝入病毒載體。這里所述的病毒載體包括但不限于腺病毒、腺相關病毒，反轉錄病毒，慢病毒和單純皰疹病毒。隨后，對攜帶轉座子系統(tǒng)的病毒進行包裝，并感染導入靶細胞或哺乳動物體內。在本發(fā)明的另一些實施例中，多基因同時操作轉座子系統(tǒng)可以通過納米顆粒導入哺乳動物體內。在本發(fā)明的另一些實施方式中，多基因同時操作轉座子系統(tǒng)可以通過上呼吸道，肌肉注射，靜脈注射導入哺乳動物體內。在本發(fā)明的另一些實施方式中，多基因同時操作轉座子系統(tǒng)可以先行導入離體的成纖維細胞、血液細胞(包括：造血干細胞或各祖細胞)、間質干細胞、誘導多能干細胞，隨后將細胞植入哺乳動物體內。在本發(fā)明的另一些實施方式中，多基因同時操作轉座子系統(tǒng)可以在導入對治療有價值的基因(包括但不限于腺苷脫氨酶，凝血因子VIII，β-球蛋白，血紅蛋白，抗肌萎縮蛋白，α-抗胰蛋白酶，低密度蛋白受體，囊性纖維化跨膜通道調節(jié)因子，嵌合抗原受體)的同時，過表達自殺基因(如：可誘導型Caspase-9)以提高基因治療安全性。在本發(fā)明應用于基因治療的一些更具體實施方式中，多基因同時操作轉座子系統(tǒng)可以在T細胞中導入對嵌合抗原受體CAR的同時，過表達各類白介素、趨化因子，或敲低治療輔助靶點(如：程序性死亡受體PD-1和T細胞受體TCR)，以提高CAR-T治療經濟性，有 效性和廣譜性。當前第1頁1 2 3