本發(fā)明屬于細胞生物學領(lǐng)域，具體涉及一種小鼠甲狀腺上皮細胞分離及培養(yǎng)方法。

背景技術(shù)：

甲狀腺是脊椎動物非常重要的腺體，屬于內(nèi)分泌器官，位于哺乳動物頸部甲狀軟骨下方，氣管兩旁。其中，甲狀腺上皮細胞(也稱為濾泡細胞或主要細胞)在甲狀腺細胞中是負責生產(chǎn)和分泌甲狀腺激素，包括四碘甲狀腺原氨酸(T4)和三碘甲腺原氨酸(T3)，具有調(diào)節(jié)動物體生長發(fā)育、基礎代謝及繁殖活動的重要生理功能。甲狀腺功能異常會引起甲狀腺腺瘤、甲狀腺癌、原發(fā)性甲狀腺功能亢進和減退等疾病，甲狀腺細胞的體外培養(yǎng)是甲狀腺疾病研究的一種重要方法。目前有關(guān)甲狀腺原代培養(yǎng)的組織多取材于體型較大的哺乳動物，如豬、狗、綿羊、兔等，成本較高，而且培養(yǎng)的甲狀腺細胞的體外生存時間和功能差異也較大。由于小鼠的甲狀腺組織較小，取材和后續(xù)處理有一定難度，但是小鼠繁殖率高，可以降低實驗成本，而且生物學性質(zhì)清晰而且便于操作等優(yōu)勢，是研究人類疾病最佳的模式生物之一，本發(fā)明所提供得甲狀腺上皮細胞的分離培養(yǎng)方法可以獲得產(chǎn)量高、純度高且生存時間較長的小鼠甲狀腺上皮細胞。

技術(shù)實現(xiàn)要素：

本發(fā)明的目的是建立一種獲得產(chǎn)量高、純度高且生存時間較長的小鼠甲狀腺上皮細胞分離培養(yǎng)的方法。

為了解決上述所涉及到的問題，本發(fā)明采取如下方法獲得小鼠甲狀腺上皮細胞：

小鼠甲狀腺上皮細胞分離方法的步驟包括：(a)腹腔注射戊巴比妥鈉處死小鼠，酒精消毒后取出與氣管相連的小鼠甲狀腺組織，置于預冷無菌含雙抗的PBS緩沖液中浸泡洗滌，并剝離甲狀腺組織；(b)機械解離甲狀腺組織后，預熱混合酶液震蕩消化30-40min，F(xiàn)icoll分離甲狀腺單個核細胞，離心獲取細胞沉淀；(c)混合完全培養(yǎng)基重懸細胞沉淀，接種于處理后的細胞瓶中，差速貼壁法獲得甲狀腺上皮細胞；(d)混合完全培養(yǎng)基培養(yǎng)純化后的甲狀腺上皮細胞。

可選的小鼠為體重20-25g，6-8周齡的小鼠。

可選的消化所用消化酶液為預先在37℃預熱的0.05％-0.1％(m/v)胰酶、0.1％-0.2％(m/v)I型膠原酶、0.05％-0.15％(m/v)II型膠原酶和1-2U/mL中性蛋白酶的酶混合液，消化時間為30-40min；

可選的震蕩消化的方法為37℃水浴震蕩，震蕩頻率為250-300次/min；

可選的細胞瓶的處理方法為含5％的小鼠血清37℃孵育過夜；

可選的差速貼壁方法為細胞懸液在37℃培養(yǎng)箱中貼壁20-30min后，將未貼壁的細胞懸液重新轉(zhuǎn)接于新的包被板中，重復一次該步驟。

可選的混合完全培養(yǎng)基的基礎培養(yǎng)基為RPMI1640、DMEM/F12和α-MEM(1∶1∶1～1∶1.5∶1)。

可選的混合完全培養(yǎng)基中的添加因子為100μg/mL牛垂體和下丘腦提取物、10ng/mL氫化可的松、10μg/mL胰島素、20-50ng/mL三碘甲狀腺原氨酸、20-50ng/mL表皮生長因子EGF和5％-10％的小鼠血清。

本發(fā)明提供的小鼠甲狀腺上皮細胞分離方法中消化液選用預熱的0.05％-0.1％(m/v)胰酶、0.1％-0.2％(m/v)I型膠原酶、0.05％-0.15％(m/v)II型膠原 酶和1-2U/mL中性蛋白酶混合液用以消化細胞，一方面減少了胰酶的用量，降低了胰酶對甲狀腺上皮細胞的損傷，提高了細胞的存活率，另一方面節(jié)省了消化所需時間。

本發(fā)明提供一種混合完全培養(yǎng)基培養(yǎng)甲狀腺細胞的方法，增加了甲狀腺上皮細胞的生存期，以及減少了添加因子的種類，降低了成本。

進一步的，本發(fā)明選用加入含有100μg/mL牛垂體和下丘腦提取物、10ng/mL氫化可的松、10μg/mL胰島素、20-50ng/mL三碘甲狀腺原氨酸、20-50ng/mL表皮生長因子EGF和10％的小鼠血清的混合完全培養(yǎng)基作為生長初期的細胞接種液，待細胞長成單層時，更換為含5％小鼠血清的混合完全培養(yǎng)基，促進小鼠甲狀腺細胞保持較長時間的上皮樣。

本發(fā)明解決了甲狀腺上皮細胞分離培養(yǎng)過程成本高，存活時間短的問題，使獲得的小鼠甲狀腺上皮細胞產(chǎn)量高、純度高且生存時間較長。

附圖說明

圖1：培養(yǎng)5天的小鼠甲狀腺上皮細胞；

圖2：小鼠甲狀腺上皮細胞免疫熒光鑒定。

具體實施方式

為了使本發(fā)明的目的及優(yōu)勢更清新地展現(xiàn)，現(xiàn)將具體實施方式進一步闡述。此處所闡述的具體實施方式僅針對本發(fā)明進行解釋，并不用于限定本發(fā)明。

本發(fā)明選擇6-8周齡的雄性小鼠，分離甲狀腺上皮細胞。具體操作如下：

1、取6-8周齡的雄性小鼠，腹腔注射戊巴比妥鈉處死小鼠，固定小鼠，75％的酒精消毒后取出與氣管相連的小鼠甲狀腺組織，置于預冷無菌含雙抗的PBS 緩沖液中浸泡洗滌，并剝離甲狀腺組織；

2、在冰上于顯微鏡下迅速地去除甲狀腺上的包膜、血細胞及結(jié)締組織等附著物，將剝離后的甲狀腺轉(zhuǎn)至新的PBS緩沖液中清洗2次；

3、在冰上用解剖剪機械剪碎甲狀腺組織，大小約1mm³左右的碎塊；

4、將剪碎的組織加入預熱的4-5倍體積的消化混合液，于37℃震蕩消化30-40min，震蕩頻率為250-300次/min；所述消化混合液包括0.05％-0.1％(m/v)胰酶、0.1％-0.2％(m/v)I型膠原酶、0.05％-0.15％(m/v)II型膠原酶和1-2U/mL中性蛋白酶；

5、吹打使細胞分散，經(jīng)200目篩網(wǎng)過濾后，加入至含F(xiàn)icoll的分離液中，2000r/min離心，取中間白色層，1500rpm/min離心5min，棄上清；

6、制備含10％小鼠血清的混合完全培養(yǎng)基：將RPMI1640、DMEM/F12和α-MEM培養(yǎng)基按照1∶1∶1～1∶1.5∶1比例配置成混合基礎培養(yǎng)基，在混合基礎培養(yǎng)基中加入100μg/mL牛垂體和下丘腦提取物、10ng/mL氫化可的松、10μg/mL胰島素、20-50ng/mL三碘甲狀腺原氨酸、20-50ng/mL表皮生長因子EGF和10％的小鼠血清。

制備含5％小鼠血清的混合完全培養(yǎng)基：將RPMI1640、DMEM/F12和α-MEM培養(yǎng)基按照1∶1∶1～1∶1.5∶1比例配置成混合基礎培養(yǎng)基，在混合基礎培養(yǎng)基中加入100μg/mL牛垂體和下丘腦提取物、10ng/mL氫化可的松、10μg/mL胰島素、20-50ng/mL三碘甲狀腺原氨酸、20-50ng/mL表皮生長因子EGF和5％的小鼠血清。

7、用10％小鼠血清的混合完全培養(yǎng)基重懸細胞沉淀，接種于經(jīng)5％的小鼠血清37℃孵育過夜處理后的細胞瓶中，置于37℃、5％(m/v)的CO₂飽和濕度的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)20-30min后，將未貼壁的細胞懸液轉(zhuǎn)移至新的處理后的細胞瓶中， 重復一次上述差速貼壁步驟。

8、培養(yǎng)24h后，更換為5％小鼠血清的混合完全培養(yǎng)基，顯微鏡下可見細胞貼壁，呈聚集生長，細胞呈圓形或橢圓形。

9、免疫熒光鑒定：(1)待細胞生長5d后，棄去培養(yǎng)基，用溫育的PBS沖洗細胞2次，每次10min，然后用4％多聚甲醛在室溫條件下固定細胞15min；(2)PBS沖洗細胞2次，每次10min，然后在4℃條件下，用0.1％Triton X-100透膜15min；(3)PBS沖洗細胞2次，每次10min，然后在室溫條件下，用4％BSA封閉細胞30min；(4)按1∶100的比例稀釋單克隆Cytokeratin-18一抗，然后將其放在4℃冰箱中孵育過夜；(5)PBS沖洗細胞3次，每次10min，按1∶100的比例稀釋二抗，37℃條件下放置1h；(6)用PBS沖洗3次，每次10min，最后DAPI染細胞核并用熒光顯微鏡拍照。

以上已經(jīng)對本發(fā)明創(chuàng)造的較佳實施例進行詳細闡述，但本發(fā)明創(chuàng)造不限定于上述實施例，凡在本發(fā)明的精神和原則之內(nèi)作出任何修改，等同替換和改進等，均應包含在本發(fā)明的保護范圍內(nèi)。