本發(fā)明涉及用于結(jié)直腸癌相關(guān)基因啟動(dòng)子超甲基化的新型標(biāo)記物，本發(fā)明結(jié)直腸癌相關(guān)基因超甲基化狀態(tài)檢測(cè)技術(shù)領(lǐng)域，特別是涉及一種甲基化熒光PCR定性檢測(cè)大腸癌技術(shù)。

背景技術(shù)：

隨著人民生活水平的提高，大腸癌（包括結(jié)直腸癌）已成為我國(guó)常見(jiàn)惡性腫瘤之一。截至2012年，我國(guó)大腸癌死亡率已躍居各腫瘤第五位，發(fā)病率也以每年4.2%的速率遞增。大腸癌及相關(guān)疾病已成為危害我國(guó)人民健康的重要因素。

由于大腸癌早期癥狀不明顯，僅有不適、消化不良、大便潛血等等，難以引起注意，加上人們長(zhǎng)期以來(lái)缺乏體檢意識(shí)，約有34%的患者入院即診斷為中晚期，并常伴有全身轉(zhuǎn)移，大大降低了治療效果。因此，迫切需要一種能夠達(dá)成早期診斷。準(zhǔn)確率高并且無(wú)痛苦的大腸癌檢測(cè)技術(shù)。

目前，市場(chǎng)上已有數(shù)種糞便檢測(cè)試劑盒，可對(duì)糞便隱血及其中少量蛋白進(jìn)行檢測(cè)，但由于糞便樣本數(shù)量的限制等因素，無(wú)法檢測(cè)出糞便中少量DNA等分子標(biāo)記物，而這類分子標(biāo)記物已被證實(shí)具有高參考價(jià)值，特別是對(duì)于大腸癌等消化道腫瘤的早期診斷具有重要意義。腸鏡是一種侵入性檢查，可能有并發(fā)癥的發(fā)生，給病人帶來(lái)的痛苦讓患者望而生畏。因此，改進(jìn)現(xiàn)有技術(shù)以提高檢測(cè)能力，對(duì)于提高大腸癌的早期診斷率至關(guān)重要。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

為了克服上述現(xiàn)有技術(shù)的不足，本發(fā)明提供了一種快速檢測(cè)大腸癌相關(guān)基因的甲基化熒光PCR技術(shù)，包括相關(guān)引物和探針組合物。與傳統(tǒng)檢測(cè)方法相比，本方案針對(duì)性更強(qiáng)，能夠有效避免假陽(yáng)性，大大提高大腸癌早期診斷率，同時(shí)具有容易操作、經(jīng)濟(jì)高效的特性。

為達(dá)到以上目的，本發(fā)明采用以下技術(shù)方案：

a 提取糞便中DNA；

b 對(duì)提取DNA進(jìn)行甲基化修飾；

c 采用PCR引物及探針對(duì)步驟b中所述的修飾后DNA進(jìn)行熒光定性檢測(cè)；

d 根據(jù)熒光PCR中手機(jī)的熒光信號(hào)形成的擴(kuò)增曲線，分析提取DNA中中是否存在大腸癌早期DNA

所述的熒光PCR定性檢測(cè)中，采用引物及探針序列如下：

FBN1

上游引物GAGTTATAGTTGGGATAGTTGCGAGC

下游引物 AACGACGACTCCGACTCCC

探針 6FAM-CGCTACAACCACTACTCGA-MGB

SNCA

上游引物 GCGTTTTGGGCGTTTTTTTAC

下游引物 CGCTATAAACCGACGACGC

探針 6FAM-CGCTAACCTATCGTCGAA-MGB

SPG20

上游引物 GCGCGTCGTGGAACGT

下游引物 CTACGCTCGCCGAAAACC

探針 6FAM-CGCGCTTACCGTAACAA-MGB

所屬的試劑盒組成包括

本發(fā)明的原理是基本原理在于：樣本經(jīng)亞硫氫酸鹽處理后,甲基化的胞嘧啶（C）保持不變,但非甲基化的胞嘧啶被轉(zhuǎn)化成脲嘧啶,因此在利用該處理產(chǎn)物作為模板的PCR產(chǎn)物中,甲基化的胞嘧啶還是胞嘧啶,但非甲基化胞嘧啶變成了脲嘧啶（胸腺嘧啶）,此時(shí)檢測(cè)到的胞嘧啶（C）即是樣品中本身的甲基化位點(diǎn)；

本發(fā)明的創(chuàng)新之處在于通過(guò)熒光PCR技術(shù)，檢測(cè)糞便樣本中大腸癌早期相關(guān)基因。相對(duì)于傳統(tǒng)技術(shù)，本方法中基因具有特異性，準(zhǔn)確性高達(dá)95%，操作簡(jiǎn)便，經(jīng)濟(jì)便捷，具有良好的臨床實(shí)用價(jià)值。

附圖說(shuō)明

圖1 熒光PCR定性檢測(cè)FBN1擴(kuò)增圖

圖2熒光PCR定性檢測(cè)SNCA擴(kuò)增圖

圖3熒光PCR定性檢測(cè)SPG20擴(kuò)增圖

圖中：包含四個(gè)樣本，陽(yáng)性對(duì)照A，陽(yáng)性病例B，陰性對(duì)照C，陰性病D。

具體實(shí)施方式

反應(yīng)體系的建立與優(yōu)化

PCR反應(yīng)體系

引物和探針濃度的優(yōu)化

DNA甲基化方法：

1、將約2ugDNA于1.5mlEP管中使用DDW稀釋至50ul；

2、加5.5ul新鮮配制的3M NaOH；

3、42℃水浴30min； 水浴期間配制；

4、10mM對(duì)苯二酚（氫醌），加30ul至上述水浴后混合液中；（溶液變成淡黃色）

5、加3.6M亞硫酸氫鈉520ul至上述水浴后溶液中；

6、EP管外裹以鋁箔紙，避光，輕柔顛倒混勻溶液；

7、加200 ul石蠟油，防止水分蒸發(fā)，限制氧化；

8、50℃避光水浴16h。