一種靈芝β-葡聚糖及其制備方法和用途技術領域本發(fā)明屬于生物學領域，涉及一種具有免疫調節(jié)作用的靈芝β-葡聚糖及其制備方法。

背景技術：
靈芝(Ganodermalucidum)是一種傳統(tǒng)藥用真菌，具有扶正固本、滋補強壯、延年益壽作用。靈芝多糖是其主要活性成分之一，可以通過影響免疫細胞如造血干細胞、淋巴細胞、巨噬細胞等發(fā)揮其相應的生物學活性，以增強和激活機體免疫功能。目前，靈芝多糖的研究內容主要集中在提取方法、結構表征和活性評價三個方面，但由于靈芝多糖的復雜性以及分離和分析方法的種種限制和原料來源及純化技術上的差異，靈芝多糖的種類至今尚未探明，其分子結構也未完全確定。β-葡聚糖是真菌細胞壁的主要組成部分，是一種典型的“生物反應調節(jié)劑”(biologicalresponsemodifier，BRM)。研究結果表明，真菌β-葡聚糖不僅能激活T、B淋巴細胞、巨噬細胞、自然殺傷細胞(NK)、細胞毒性T淋巴細胞(CTL)、樹突狀細胞(DC)等免疫細胞，還能促進細胞因子的生成，激活補體系統(tǒng)、促進抗體的產生，對免疫系統(tǒng)發(fā)揮多方面的調節(jié)作用，其抗腫瘤作用也認為與它激活機體的免疫系統(tǒng)有關。由于真菌類β-葡聚糖具有免疫調節(jié)和抗腫瘤等多種功效，在食品、醫(yī)藥和生物材料等領域具有廣闊的開發(fā)與應用前景。本發(fā)明通過簡單有效的純化方法，從靈芝子實體中獲得了一種高純度的β-葡聚糖，通過化學分析和光譜分析相結合的方法解析了其結構，體內外藥理實驗表明，其具有抗腫瘤和免疫調節(jié)作用，可以應用于藥品或保健品中。

技術實現要素：
本發(fā)明公開了一種靈芝β-葡聚糖及其制備方法，并公開了其在免疫調節(jié)和抗腫瘤方面的用途。本發(fā)明公開了一種靈芝β-葡聚糖，其結構以β-1，3-連接為主鏈，平均每3-7個主鏈葡萄糖殘基上含有1-2個以β-1，6-連接的葡萄糖側基，該多糖平均分子量為240萬-280萬道爾頓，分子量范圍為120萬-380萬道爾頓。本發(fā)明公開了一種靈芝β-葡聚糖的組合物，其結構以β-1，3-連接為主鏈，平均每3-7個主鏈葡萄糖殘基上含有1-2個以β-1，6-連接的葡萄糖側基，該多糖平均分子量為240萬-280萬道爾頓，分子量范圍為120萬-380萬道爾頓。本發(fā)明公開了一種靈芝β-葡聚糖的組合物，其中β葡聚糖含量75.4％-90％，其余為蛋白質和雜多糖。本發(fā)明公開了一種靈芝β-葡聚糖的組合物，其中β葡聚糖含量達到75.4％，其余為蛋白質和雜多糖。本發(fā)明公開了一種靈芝β-葡聚糖的組合物，其中β葡聚糖含量94.3％。本發(fā)明公開了一種靈芝β-葡聚糖的組合物，其中β葡聚糖含量75.4％-90％，其余為蛋白質和雜多糖，經液相檢測，含有如下兩個主峰，第一個主峰的出峰時間為22.40-38.9min，另一個峰主要為46.7-53.2min，經檢測，主峰為主要的多糖組分，次要峰在紫外280nm處有很強的吸收峰，含蛋白類成分。本發(fā)明公開了一種靈芝β-葡聚糖的組合物，其中β葡聚糖含量94.3％，經液相分析，僅含有如下一個主峰，主峰的出峰時間為22.40-38.9min，經檢測，主峰為主要的多糖組分。本發(fā)明公開了一種靈芝β-葡聚糖的液相分析方法：經高效凝膠色譜(waters公司2695泵分離系統(tǒng))串聯TSK-GEL系列G6000PWXL和G4000PWXL色譜柱(7.8mm×300mm，TOSOH，日本)進行分離，以0.15mol/LNaNO3和0.05mol/LNaH2PO4(pH＝7，0.02％疊氮鈉)的水溶液為流動相，柱溫：35℃；流速：0.5mL/min；進樣量：100μL；以八角度激光光散射檢測器(MALLS，Wyatt公司)和Waters2414示差檢測器(RI)進行分析，激光檢測器光源波長選用623.8nm。檢測器的溫度為室溫。多糖在溶液中的折光指數增量(dn/dc)按照0.146mL/g計算。使用Astra(version6.1.1，WyattTechnology，SantaBarbara，CA)數據分析軟件對光散射數據進行采集和分析。本發(fā)明公開了一種靈芝β-葡聚糖的制備方法，包括如下步驟：1、靈芝粗多糖的提?。阂猿嘀プ訉嶓w為原料，粉碎后過10目篩，加入15-20倍重量的水中，常溫浸泡20-40分鐘，加熱至沸騰，保持微沸90-120分鐘，過濾。濾渣重復上述步驟，再提取1-2次，合并濾液。2、靈芝提取液的濃縮：提取液先用100-200目的濾網粗濾，減壓濃縮至料液比(質量/體積)為1∶3-1∶6，濃縮液再用離心機以8000rpm轉速離心20min取上清。3、乙醇沉淀粗多糖：向上述濃縮液中緩慢加入無水乙醇，邊加邊攪拌，至乙醇含量達到40％-50％，室溫靜置6-8小時，離心去除醇沉上清，收集沉淀。沉淀加水溶解后在60-80℃水浴鍋上揮去乙醇，冷凍干燥后得灰白色棉絮狀固體樣品。4、β-葡聚糖的純化：取上述固體樣品，加適量蒸餾水溶解，離心取上清液進行DEAE柱層析分離，先以1倍柱體積的蒸餾水做洗脫液進行洗脫，再以2倍柱體積的0-1MNaCl鹽溶液進行線性洗脫，洗脫的梯度見下表，收集鹽相部分濃縮，透析后冷凍干燥即獲得所需的靈芝β-葡聚糖。表DEAE-SepharoseFastFlow陰離子層析柱洗脫程序本發(fā)明涉及一種靈芝β-葡聚糖的組合物，由靈芝的提取制備得到，屬于靈芝提取物，質量穩(wěn)定，其中靈芝β-葡聚糖的含量超過90％。本發(fā)明涉及一種靈芝β-葡聚糖的組合物，用于制備刺激淋巴細胞增殖的組合物。本發(fā)明涉及一種靈芝β-葡聚糖的組合物，用于制備刺激淋巴細胞增殖的免疫調節(jié)劑。本發(fā)明涉及一種靈芝β-葡聚糖的組合物，用于制備刺激TNF-α生成的促進劑。本發(fā)明涉及一種靈芝β-葡聚糖的組合物，用于制備刺激TNF-α生成的抗腫瘤的組合物。本發(fā)明涉及一種靈芝β-葡聚糖的組合物，用于制備藥品、食品、保健品、化妝品、食品添加劑，食品補充劑。本發(fā)明涉及一種靈芝β-葡聚糖的組合物，用于制備片劑、膠囊、凍干粉、水溶液，注射劑。本發(fā)明的一種靈芝β-葡聚糖的組合物具有體外刺激小鼠脾淋巴細胞增殖的作用，還可以刺激經PMA誘導THP-1細胞產生的巨噬細胞釋放TNF-α，在動物體內試驗中表現出對小鼠Lewis肺癌的抑制作用，可以作為免疫調節(jié)劑或者抗腫瘤藥物開發(fā)中的原料。對照試驗例如下：201410293682.X專利主要以靈芝提取后的殘渣為主提取多糖，提取所得的成分β-葡聚糖含量只有50％左右，還含有其他組分，本專利主要是從靈芝子實體的水提物中直接分離，兩者之間原料來源上有很大差別。201410293682.X的實施例1公開了：1、靈芝提取殘渣的獲得：以赤靈芝子實體為原料，粉碎成粗粒，稱取200g，加入3L水，常溫浸泡30分鐘，加熱至沸騰，保持120分鐘，過濾。濾渣重復上述步驟，再提取1次，過濾后，所得殘渣在60℃鼓風干燥器中烘干。2、靈芝殘渣的超微粉碎：將干燥后的靈芝提取殘渣采用超微粉碎震動磨機粉碎30min，過200目篩，收集超細粉。3、靈芝多糖的提取分離：稱取上述靈芝殘渣超細粉150g，加入2L蒸餾水，常溫60分鐘，加熱至沸騰，保持微沸60分鐘，離心。沉淀重復提取1次，離心后，收集合并提取液，減壓濃縮至料液比為1∶1(質量/體積，單位：千克/升)，緩慢加入無水乙醇，邊加邊攪拌，至乙醇含量達到50％，室溫靜置4小時，離心去除醇沉上清，收集沉淀。4、干燥：沉淀加水溶解，揮干乙醇后置于-20℃冰箱中凍存2h，然后再放到-80℃冰箱中冷凍3h，最后放入冷凍干燥機中凍干，即獲得所需的靈芝多糖。制備所得靈芝多糖的得率為0.91％，多糖含量為82.52％，β-葡聚糖含量為53.21％。與201410293682.X的實施例1相比，本發(fā)明在如下方面進行了創(chuàng)新：乙醇沉淀粗多糖：向上述濃縮液中緩慢加入無水乙醇，邊加邊攪拌，至乙醇含量達到40％-50％，室溫靜置6-8小時，離心去除醇沉上清，收集沉淀。沉淀加水溶解后在60-80℃水浴鍋上揮去乙醇，冷凍干燥后得灰白色棉絮狀固體樣品。β-葡聚糖的純化：取上述固體樣品，加適量蒸餾水溶解，離心取上清液進行DEAE柱層析分離，先以1倍柱體積的蒸餾水做洗脫液進行洗脫，再以2倍柱體積的0-1MNaCl鹽溶液進行線性洗脫，收集鹽相部分濃縮，透析后冷凍干燥即獲得所需的靈芝β-葡聚糖。其中，乙醇沉淀粗多糖的工藝優(yōu)選過程是：對靈芝子實體提取物濃縮液分別以終濃度為20％、30％、40％、50％的乙醇進行沉淀，對所得的組分進行了分析比較，發(fā)現隨著乙醇濃度的增加，靈芝粗多糖的得率從0.4％提高到1.25％，且乙醇濃度為40％-50％范圍內，得率較穩(wěn)定，此時β葡聚糖含量達到75.4％。其中，β-葡聚糖的純化的工藝優(yōu)選過程是：將上述靈芝粗多糖進行DEAE-SepharoseFastFlow陰離子交換柱層析分離，對上樣體積、洗脫條件進行了優(yōu)化，并且對分離所得的水相組分和鹽相組分進行分析比較，發(fā)現鹽相組分的得率較高，可以達到80％，經檢測，該組分β-葡聚糖含量也達到90％以上。在β-葡聚糖的純化過程中，經液相檢測，含有如下兩個峰，第一個主峰的出峰時間為22.40-38.9min，另一個峰主要為46.7-53.2min，經檢測，主峰為主要的多糖組分，次要峰在紫外280nm處有很強的吸收峰，含蛋白類成分。在β-葡聚糖的純化過程中，經液相檢測，僅含有如下一個峰，主峰的出峰時間為22.40-38.9min，經檢測，主峰為主要的多糖組分。附圖說明圖1靈芝子實體β-葡聚糖的高效液相圖譜圖2靈芝子實體β-葡聚糖的紅外分析圖譜圖3靈芝子實體β-葡聚糖甲基化產物的GC分析圖譜圖4：靈芝子實體β-葡聚糖的1H-NMR譜圖圖5：靈芝子實體β-葡聚糖的13C-NMR譜圖圖6：靈芝子實體β-葡聚糖的1H-13CHMQC圖譜圖7：靈芝子實體β-葡聚糖刺激小鼠脾淋巴細胞增殖作用圖8：靈芝子實體β-葡聚糖對PMA誘導THP-1細胞形成的巨噬細胞釋放TNF-α的影響具體實施方式：實施例1：靈芝子實體β-葡聚糖的制備取赤芝子實體(購自浙江龍泉基地)粉碎后過10目篩，稱取2kg加入40L蒸餾水中，常溫浸泡30分鐘，加熱至沸騰，保持微沸120分鐘，過濾。濾渣再加入30L蒸餾水煮沸提取90-120min，過濾后合并濾液。濾液先用100-200目的濾網粗濾，減壓濃縮至10L后，再用離心機以8000rpm轉速離心20min，向上清液中緩慢加入無水乙醇，邊加邊攪拌，至乙醇含量達到40％，室溫靜置6-8小時，8000rpm離心收集沉淀，加水溶解揮干乙醇后冷凍干燥得到25g灰白色固體產物(得率為1.25％)。取1g上述固體樣品，加100mL水溶解后，離心，上清液采用primeplus層析系統(tǒng)分離，經DEAE-SepharoseFastFlow陰離子層析柱(XK50/100)對樣品進行離子交換層析分離。先以1倍柱體積的蒸餾水做洗脫液進行洗脫，再以2倍柱體積的0-1MNaCl鹽溶液進行線性洗脫，具體洗脫程序如下表1。收集鹽相部分濃縮，透析后冷凍干燥即得靈芝多糖(800mg)，苯酚硫酸法檢測其多糖含量為94.3％。表1DEAE-SepharoseFastFlow陰離子層析柱洗脫程序經高效凝膠色譜(waters公司2695泵分離系統(tǒng))串聯TSK-GEL系列G6000PWXL和G4000PWXL色譜柱(7.8mm×300mm，TOSOH，日本)進行分離，以0.15mol/LNaNO3和0.05mol/LNaH2PO4(pH＝7，0.02％疊氮鈉)的水溶液為流動相，柱溫：35℃；流速：0.5mL/min；進樣量：100μL；以八角度激光光散射檢測器(MALLS，Wyatt公司)和Waters2414示差檢測器(RI)進行分析，激光檢測器光源波長選用623.8nm。檢測器的溫度為室溫。多糖在溶液中的折光指數增量(dn/dc)按照0.146mL/g計算。使用Astra(version6.1.1，WyattTechnology，SantaBarbara，CA)數據分析軟件對光散射數據進行采集和分析，計算靈芝子實體多糖分子量為260萬道爾頓。單糖組成分析結果顯示該多糖為葡聚糖。用NMR、IR和甲基化分析證明該靈芝多糖為β-葡聚糖，平均每3個主鏈葡萄糖殘基上含有1個以1，6-鍵連接的葡萄糖側基。通過GC-MS的MS圖譜分析，GC圖譜中保留時間11.12min的為t-末端葡萄糖，保留時間15.91min的為1，3-linked-葡萄糖殘基，保留時間23.67min的為1，3，6-linked-葡萄糖殘基，其摩爾比約為1∶2∶1。結合1H-NMR、13C-NMR、C-H二維譜圖、推測靈芝子實體多糖具有以下的結構單元：實施例2：靈芝子實體β-葡聚糖體外刺激小鼠脾淋巴細胞增殖1、樣品的配制精密稱取樣品約5mg，加入定量的PBS溶液使其充分溶解后，18000g離心30min除菌，上清液轉移至無菌管中，稀釋成一系列濃度備用。2、小鼠脾淋巴細胞的制備選取8-10周齡，體重28±1g的BALB/c小鼠頸椎脫臼處死，取脾臟，用PBS沖洗3-4次。將脾臟磨碎后過100目篩，過篩后的混懸液以1000rpm離心6min。吸去上清液，沉淀中按每只小鼠1.5mL的量加入氯化銨溶液，反復沖打，靜置10min后，加PBS至50mL，然后以400g/min離心6min，吸去上清液，加PBS緩沖液沖洗并離心2遍后，吸去上清，加入培養(yǎng)基混勻，用細胞計數儀計數并稀釋成2×106cells/mL細胞液備用。3、小鼠脾淋巴細胞增殖率的測定將2×106cells/mL淋巴細胞懸浮液加至96孔板中，每孔加180μL，同時加入20μL樣品液(或每孔加199μL細胞懸液，同時加入1μL樣品液)，以20μLPBS(或1μLDMSO)和20μL的60μg/mL的PHA溶液分別作陰、陽性對照。于37℃、含5％的CO2條件下培養(yǎng)3d，加入20μLAlamarBlue試劑，再培養(yǎng)，加AlamarBlue試劑前及變色后分別用ELISA自動讀板儀測定570nm和600nm處的吸光度，然后根據AlamarBlue試劑公式計算各種樣品對淋巴細胞增殖率。計算公式為：淋巴細胞增殖率(％)＝[117216×A570(樣品)-80586×A600(樣品)]/[117216×A570(對照)-80586×A600(對照)]×100％對實施例1中的靈芝子實體β-葡聚糖樣品進行了活性測試，結果見(圖7靈芝子實體β-葡聚糖刺激小鼠脾淋巴細胞增殖作用)?？梢钥闯觯`芝β-葡聚糖具有刺激小鼠脾淋巴細胞增殖的作用，可以增強機體的免疫力。實施例3：靈芝子實體β-葡聚糖體外刺巨噬細胞釋放TNF-α活性分析1、樣品的配制精密稱取樣品約5mg，加入定量的PBS溶液使其充分溶解后，18000g離心30min除菌，上清液轉移至無菌管中，稀釋成一系列濃度備用。2、THP-1細胞培養(yǎng)及巨噬細胞的誘導細胞株THP-1在RPMI1640完全培養(yǎng)基中，37℃、含5％CO2條件下培養(yǎng)到對數期后，180×g離心后收集細胞，稀釋成5×105個/mL的細胞液。將細胞液按照每孔1mL的體積轉入24孔板中，加入終濃度為30ng/mL的PMA誘導細胞成巨噬細胞，48h后誘導結束。3、THP-1細胞誘導的巨噬細胞上清液中TNF-α含量的測定及比較將上述誘導成巨噬細胞的培養(yǎng)液上清棄去，加入含有不同濃度的樣品的培養(yǎng)基至細胞中，共同培養(yǎng)48h后取上清，利用北京正四柏公司的TNF-α測定用ELISA試劑盒測定上清液中TNF-α的含量。4、結果分析從圖8(靈芝子實體β-葡聚糖對PMA誘導THP-1細胞形成的巨噬細胞釋放TNF-α的影響)結果可以看出，靈芝子實體β-葡聚糖具有很好的刺激巨噬細胞釋放TNF-α的活性，可明顯增強巨噬細胞的吞噬殺傷能力，從而增強機體的抗腫瘤能力。實施例4：靈芝子實體β-葡聚糖抑制小鼠Lewis肺癌活性試驗1、實驗材料：生理鹽水做溶劑；陽性對照品：順鉑10mg/瓶，齊魯制藥有限公司生產，批號111024CF；瘤源：小鼠Lewis肺癌模型由上海醫(yī)藥工業(yè)研究院藥效學研究評價中心傳代維持。2、實驗動物：C57BL/6小鼠由上海斯萊克實驗動物責任有限公司提供，合格證號：SCXK(滬)2012-0002；雄性，18-20g，試驗組及陽性對照組每組10只小鼠，陰性對照為兩組。3、劑量設置：樣品設兩個劑量組，分別為50mg/kg、12.5mg/kg。4、給藥方案：多糖給藥方式采用腹腔給藥，每天1次，連續(xù)14天。陰性對照組給以與試驗組等體積等濃度的相應溶劑，陽性對照環(huán)順鉑2mg/kg/d每天腹腔給藥一次，連續(xù)七天。5、試驗主要步驟：無菌條件下取生長旺盛的瘤源，以1∶8-10的比例勻漿制備成約2×107/mL細胞懸液，于相應宿主腋皮下接種0.2mL/每鼠，次日按實驗設計方案給藥，給藥結束后約次日處死各組動物，稱體重、脾臟重、胸腺重后剖取腫瘤稱重，按下列公式計算腫瘤抑制率：腫瘤抑制率％＝[(對照組平均瘤重-給藥組平均瘤重)/對照組平均瘤重]×100％試驗結束后，取動物血清，按照ELISA試劑盒的方法對其中的IgG和IgM抗體量進行測定。6、結果分析多糖樣品以腹腔注射，每天1次，連續(xù)14天(ig×14qd)的給藥方案，對小鼠Lewis肺癌的抗腫瘤療效試驗，抑瘤率結果見表2。結果顯示，靈芝β葡聚糖對應兩個劑量組50mg/kg、12.5mg/kg，腫瘤抑制率分別為28.41％和12.53％，陽性對照順鉑2mg/kg，腫瘤抑制率為78.27％。另外，表3結果顯示，多糖給藥組小鼠的脾臟指數、胸腺指數和血清中IgG、IgM的量都明顯高于化療組和模型組，證明多糖組老鼠的免疫系統(tǒng)沒有受到明顯的損傷，多糖可以增強荷瘤小鼠的免疫系統(tǒng)，從而起到抑制腫瘤的作用。表2.靈芝子實體β-葡聚糖對小鼠Lewis肺癌的療效試驗表3靈芝子實體β-葡聚糖對Lewis肺癌小鼠脾臟指數、胸腺指數和血清中IgG、IgM的影響實施例5：靈芝子實體β-葡聚糖的劑型靈芝子實體β-葡聚糖的片劑：靈芝子實體β-葡聚糖10mg，淀粉87g，硬脂酸鎂2g制備工藝：取實施例1的靈芝子實體β-葡聚糖過100目篩，加淀粉、硬脂酸鎂混合均勻，制成顆粒，干燥，壓片，即得。靈芝子實體β-葡聚糖的膠囊：靈芝子實體β-葡聚糖10mg，淀粉87g，硬脂酸鎂2g制備工藝：取實施例1的靈芝子實體β-葡聚糖過100目篩，加淀粉、硬脂酸鎂混合均勻，制成顆粒，干燥，裝膠囊，即得。靈芝子實體β-葡聚糖的凍干粉：靈芝子實體β-葡聚糖2.0g，乙二胺四乙酸二鈉4.0g，加水定容至1000mL；制備工藝：靈芝子實體β-葡聚糖分散在水中，在超聲或攪拌條件下將乙二胺四乙酸二鈉加入，使成澄清透明溶液；補加水定容至足量；經0.22μM微孔濾膜過濾，冷凍干燥得到。實施例6：片劑中靈芝子實體β-葡聚糖的含量的檢測樣品經高效凝膠色譜(waters公司2695泵分離系統(tǒng))串聯TSK-GEL系列G6000PWXL和G4000PWXL色譜柱(7.8mm×300mm，TOSOH，日本)進行分離，以0.15mol/LNaNO3和0.05mol/LNaH2PO4(pH＝7，0.02％疊氮鈉)的水溶液為流動相，柱溫：35℃；流速：0.5mL/min；進樣量：100μL；以八角度激光光散射檢測器(MALLS，Wyatt公司)和Waters2414示差檢測器(RI)進行分析，激光檢測器光源波長選用623.8nm。檢測器的溫度為室溫。多糖在溶液中的折光指數增量(dn/dc)按照0.146mL/g計算。片劑樣品用流動相配成1mg/mL溶液，上樣量50μL。對照樣品是：實施例1的樣品。實施例7：膠囊中靈芝子實體β-葡聚糖的含量的檢測樣品經高效凝膠色譜(waters公司2695泵分離系統(tǒng))串聯TSK-GEL系列G6000PWXL和G4000PWXL色譜柱(7.8mm×300mm，TOSOH，日本)進行分離，以0.15mol/LNaN03和0.05mol/LNaH2PO4(pH＝7，0.02％疊氮鈉)的水溶液為流動相，柱溫：35℃；流速：0.5mL/min；進樣量：100μL；以八角度激光光散射檢測器(MALLS，Wyatt公司)和Waters2414示差檢測器(RI)進行分析，激光檢測器光源波長選用623.8nm。檢測器的溫度為室溫。多糖在溶液中的折光指數增量(dn/dc)按照0.146mL/g計算。膠囊內容物的樣品用流動相配成1mg/mL溶液，上樣量50μL。對照樣品是：實施例1的樣品。實施例8：凍干粉中靈芝子實體β-葡聚糖的含量的檢測樣品經高效凝膠色譜(waters公司2695泵分離系統(tǒng))串聯TSK-GEL系列G6000PWXL和G4000PWXL色譜柱(7.8mm×300mm，TOSOH，日本)進行分離，以0.15mol/LNaNO3和0.05mol/LNaH2PO4(pH＝7，0.02％疊氮鈉)的水溶液為流動相，柱溫：35℃；流速：0.5mL/min；進樣量：100μL；以八角度激光光散射檢測器(MALLS，Wyatt公司)和Waters2414示差檢測器(RI)進行分析，激光檢測器光源波長選用623.8nm。檢測器的溫度為室溫。多糖在溶液中的折光指數增量(dn/dc)按照0.146mL/g計算。凍干粉用流動相配成1mg/mL溶液，上樣量50μL。對照樣品是：實施例1的樣品。