本發(fā)明涉及人汗腺再生研究領(lǐng)域。具體說(shuō)來(lái)，本發(fā)明涉及一種體外誘導(dǎo)骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞轉(zhuǎn)分化獲得汗腺細(xì)胞的microRNA誘導(dǎo)方法。

背景技術(shù)：

汗腺再生一直是創(chuàng)燒傷領(lǐng)域的熱門(mén)課題，其意義在于通過(guò)在深度燒傷創(chuàng)面建立汗腺組織，解決燒傷患者不能分泌汗液的問(wèn)題，以提高患者的生活質(zhì)量。

研究表明，BM-MSCs可直接參與了皮膚損傷修復(fù)與再生的全過(guò)程，其中包括：皮膚組織損傷后，造血干細(xì)胞和間充質(zhì)干細(xì)胞從骨髓動(dòng)員到循環(huán)細(xì)胞池，并遷移到損傷部位。從2003年起，我們又開(kāi)始了體外誘導(dǎo)MSCs向汗腺細(xì)胞分化的實(shí)驗(yàn)研究。利用BM-MSCs來(lái)再生汗腺的主要優(yōu)點(diǎn)包括：一是BM-MSCs本身具有低免疫源性和多向分化潛能；二是BM-MSCs存在于骨髓基質(zhì)，在大面積創(chuàng)傷、燒傷時(shí)受到外界的直接破壞作用比較??；三是儲(chǔ)存量比較大，在嚴(yán)重創(chuàng)傷和燒傷條件下能夠發(fā)生動(dòng)員，容易獲取。基于以上原因，深入開(kāi)展BM-MSCs的分化調(diào)控研究對(duì)皮膚汗腺再生策略具有重要的理論意義和應(yīng)用價(jià)值。

我們發(fā)現(xiàn)，MSCs經(jīng)過(guò)在體外與汗腺細(xì)胞共培養(yǎng)后，可以轉(zhuǎn)分化為汗腺細(xì)胞。在此基礎(chǔ)上，我們又獲得了以下幾方面的突破：1)通過(guò)共培養(yǎng)技術(shù)，可以將人MSCs成功誘導(dǎo)為汗腺細(xì)胞，并可在體外大量擴(kuò)增，為成體干細(xì)胞跨胚層轉(zhuǎn)分化的研究提供了可靠數(shù)據(jù)；2)免疫組織化學(xué)和流式細(xì)胞術(shù)等方法證實(shí)這些來(lái)源于MSCs的汗腺細(xì)胞，可以表達(dá)汗腺細(xì)胞的重要標(biāo)志癌胚抗原(CEA)、CK8、CK18和CK19等；3)初步闡明在MSCs轉(zhuǎn)分化為汗腺細(xì)胞的過(guò)程中涉及的信號(hào)通路主要有EDA-A1/EDAR/NF-кB和ERK的激活；4)在此基礎(chǔ)上，將上述通過(guò)細(xì)胞共培養(yǎng)技術(shù)獲得的汗腺細(xì)胞局部移植于裸鼠燙傷腳掌，觀察到有汗腺組織再生，并且碘- 淀粉發(fā)汗試驗(yàn)檢測(cè)為陽(yáng)性；5)進(jìn)一步進(jìn)行的2例人體移植實(shí)驗(yàn)，證明了這種從MSCs誘導(dǎo)產(chǎn)生的汗腺細(xì)胞可以在人體切除瘢痕的創(chuàng)面長(zhǎng)出汗腺樣結(jié)構(gòu)，并且具有發(fā)汗的功能；6)移植術(shù)后3個(gè)月和1年的隨訪表明，移植了從MSCs誘導(dǎo)產(chǎn)生的汗腺細(xì)胞的創(chuàng)面，汗液成分分析以及組織學(xué)檢查均證明這些再生的汗腺不僅具有類似正常汗腺的結(jié)構(gòu)，而且具有持續(xù)分泌正常汗液的功能。

但上述以共培養(yǎng)為基礎(chǔ)的誘導(dǎo)體系還需要進(jìn)一步改進(jìn)和完善。一方面共培養(yǎng)體系需要原代分離大量的汗腺細(xì)胞，但原代汗腺細(xì)胞難分離，而且不能傳代，不能計(jì)數(shù)，因此提供的誘導(dǎo)微環(huán)境體系不穩(wěn)定。另外，還存在細(xì)胞融合和細(xì)胞容易混雜等缺點(diǎn)。而本技術(shù)發(fā)明了一種骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞轉(zhuǎn)分化為汗腺樣細(xì)胞的microRNA誘導(dǎo)方法。我們選擇靶向性調(diào)控NF-кB的microRNA即has-miR-138-5p inhibitor，轉(zhuǎn)染BM-MSCs后，流式分選陽(yáng)性細(xì)胞，并繼續(xù)培養(yǎng)分選后的BM-MSCs 7-9天獲得汗腺或汗腺樣細(xì)胞。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

因此，本發(fā)明提供了一種骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞轉(zhuǎn)分化為汗腺樣細(xì)胞的microRNA誘導(dǎo)方法，包括以下步驟：

a)分離并培養(yǎng)BM-MSCs，用免疫細(xì)胞化學(xué)法鑒定其表面標(biāo)志性蛋白CD44。

b)利用Lipo2000將has-miR-138-5p inhibitor轉(zhuǎn)染到第三代BM-MSCs。has-miR-138-5p inhibitor的轉(zhuǎn)染濃度為600pmol，轉(zhuǎn)染時(shí)BM-MSCs的密度為3×10⁵/ml。

c)流式分選轉(zhuǎn)染陽(yáng)性的BM-MSCs細(xì)胞。

d)繼續(xù)培養(yǎng)分選后的BM-MSCs 7-9天并獲得汗腺或汗腺樣細(xì)胞。

附圖說(shuō)明

圖1描述了BM-MSCs的培養(yǎng)和表面標(biāo)志性蛋白CD44的免疫細(xì)胞化學(xué)鑒定。其中A：剛接種未貼壁第三代MSCs，呈細(xì)小圓形(×100)；B：接種24h后第三代MSCs貼壁，形態(tài)呈長(zhǎng)梭形(×100)；C：傳代十次之后MSCs形態(tài)明顯衰老(×100)；D：CD44免疫細(xì)胞化學(xué)染色陽(yáng)性(×100)。

圖2描述了化學(xué)合成的microRNA(has-miR-138-5p inhibitor)-cy3轉(zhuǎn)染MSCs的過(guò)程和流式分選結(jié)果。其中A：DAPI染核為藍(lán)色(×100)；B：cy3紅色熒光(×100)；C：組合圖像(×100)；D：流式細(xì)胞儀檢測(cè)。

圖3描述了Has-miR-138-5p inhibitor轉(zhuǎn)染BM-MSCs 7d后，汗腺表面標(biāo)志性蛋白CEA、CK19、CK7、CK8和CK14表達(dá)。其中A、C、E、G和I分別為轉(zhuǎn)染Has-miR-138-5p inhibitor-cy3后，CEA、CK19、CK7、CK8和CK14分子的表達(dá)；B、D、F、H和J分別為轉(zhuǎn)染microRNA inhibitor-cy3 negative control后，CEA、CK19、CK7、CK8和CK14分子的表達(dá)(×100)。

具體實(shí)施方式

以下本發(fā)明以具體實(shí)施例的方式具體闡述發(fā)明。本領(lǐng)域技術(shù)人員可以理解的是，以下的實(shí)施例是為了闡述發(fā)明，而非限定發(fā)明的范圍。

實(shí)施例

實(shí)施例1BM-MSCs的分離培養(yǎng)及鑒定

1.BM-MSCs的分離培養(yǎng)：無(wú)菌條件下取正常志愿者的髂骨骨髓約2ml，采用直接貼壁法，以含10％胎牛血清、青霉素(100U/ml)和鏈霉素(100μg/ml)的DMEM為培養(yǎng)液，在37℃、5％CO2孵育箱內(nèi)培養(yǎng)，24h后更換培養(yǎng)基，棄掉未貼壁細(xì)胞，以后每2～3d換液1次。待細(xì)胞達(dá)80％融合時(shí)，用0.125％的胰蛋白酶消化，給予傳代培養(yǎng)(圖1A-C)。

2.免疫細(xì)胞化學(xué)檢測(cè)結(jié)果：取細(xì)胞爬片，用預(yù)冷的甲醛丙酮混合液(體積比1∶1))固定30min，按二步法免疫組化檢測(cè)試劑盒說(shuō)明進(jìn)行CD44檢測(cè)。檢測(cè)結(jié)果表明BM-MSCs內(nèi)CD44呈強(qiáng)陽(yáng)性表達(dá)(圖1D)。

實(shí)施例2Has-miR-138-5p inhibitor轉(zhuǎn)染BM-MSCs及流式分選

microRNA轉(zhuǎn)染BM-MSCs：把化學(xué)合成的Has-miR-138-5p inhibitor和negative control of microRNA inhibitors加入DEPC水，稀釋成20uM濃度。第三代MSCs以3×10⁵/ml密度接種于T25cm²的無(wú)菌塑料培養(yǎng)瓶中，培養(yǎng)至細(xì)胞融合達(dá)60％。取一次性無(wú)菌無(wú)酶1.5ml EP管，先加入500ul Opti-MEM I，再加入上述稀釋好的化學(xué)合成的microRNA mimics(inhibitor)各30ul(600pmol)，輕柔混勻；另 取一次性無(wú)菌無(wú)酶1.5ml EP管，先加入500ul Opti-MEM I，再加入15ul Lipo2000，輕柔混勻，室溫靜置5min；將上述1.5ml EP管中稀釋好的化學(xué)合成microRNAs和Lipo 2000用無(wú)菌無(wú)酶吸頭緩慢輕柔混勻，室溫下靜置，孵育20min(促使microRNA-Lipo2000復(fù)合物的形成)；將上述孵育好的合成microRNAs與Lipo2000混合液(約1ml)，逐滴均勻滴入至MSCs培養(yǎng)瓶底部細(xì)胞，待前一滴均勻擴(kuò)散后再滴下一滴，前后反向輕柔晃勻；在Opti-MEM I培養(yǎng)基中，37℃、5％的CO₂細(xì)胞培養(yǎng)箱培養(yǎng)5h；棄除Opti-MEM I培養(yǎng)基，更換成MSC培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)，過(guò)夜后監(jiān)測(cè)細(xì)胞cy3紅色熒光的表達(dá)(觀察轉(zhuǎn)染效率)。MSC培養(yǎng)過(guò)夜后，紅色熒光下細(xì)胞輪廓清晰易辨，培養(yǎng)40h后，紅色熒光幾乎鋪滿整個(gè)細(xì)胞，形態(tài)清晰，胞內(nèi)紅色均勻飽滿(圖2A-C)。將轉(zhuǎn)染后的BM-MSCs經(jīng)常規(guī)消化后分散成單細(xì)胞，流式細(xì)胞分選檢測(cè)結(jié)果顯示，microRNAs轉(zhuǎn)染MSCs的轉(zhuǎn)染效率高達(dá)98.56％(圖2D)

實(shí)施例3microRNAs轉(zhuǎn)染BM-MSCs 7d后汗腺表面標(biāo)志性蛋白檢測(cè)(細(xì)胞免疫化學(xué)染色)

microRNAs誘導(dǎo)7d后，4％多聚甲醛固定15～20min，0.2％Triton X-100打孔通透10min，加入3％H₂O₂室溫孵育約10min去除內(nèi)源性過(guò)氧化物酶，加入一定比例稀釋后的CEA、CK19、CK7、CK8和CK14一抗，4℃過(guò)夜，PBS潤(rùn)洗3次，加入HRP標(biāo)記的抗鼠、抗兔二抗，室溫覆蓋30min，PBS潤(rùn)洗3次，DAB顯色，蘇木素復(fù)染細(xì)胞核。結(jié)果表明，has-miR-138-5p inhibitor轉(zhuǎn)染組有部分細(xì)胞汗腺標(biāo)志性蛋白CEA、CK19、CK7、CK8和CK14表達(dá)陽(yáng)性(呈棕黃色)(圖3A、C、E、G和I)，但而陰性對(duì)照組中未發(fā)現(xiàn)棕黃色染色陽(yáng)性的細(xì)胞(圖3B、D、F、H和J)。

以上結(jié)果說(shuō)明：經(jīng)調(diào)控汗腺發(fā)育相關(guān)通路的小分子microRNA誘導(dǎo)后，中胚層來(lái)源的BM-MSCs可以通過(guò)跨胚層轉(zhuǎn)分化轉(zhuǎn)變?yōu)楹瓜贅蛹?xì)胞，為解決燒傷病人后期出汗難的問(wèn)題提供參考。