本發(fā)明屬于分子生物學領(lǐng)域，涉及醫(yī)學和生物技術(shù)，具體的是涉及一種檢測皮膚癌相關(guān)標志物的探針組合及其試劑盒。
背景技術(shù)：
：MicroRNAs(miRNAs)是在真核生物中發(fā)現(xiàn)的一類內(nèi)源性的具有調(diào)控功能的非編碼RNA，其大小長約20～25個核苷酸。成熟的miRNAs是由較長的初級轉(zhuǎn)錄物經(jīng)過一系列核酸酶的剪切加工而產(chǎn)生的，隨后組裝進RNA誘導(dǎo)的沉默復(fù)合體(RNA-inducedsilencingcomplex,RISC)，通過堿基互補配對的方式識別靶miRNA，并根據(jù)互補程度的不同指導(dǎo)沉默復(fù)合體降解靶miRNA或者阻遏靶miRNA的翻譯。最近的研究表明miRNA參與各種各樣的調(diào)節(jié)途徑，包括發(fā)育、病毒防御、造血過程、器官形成、細胞增殖和凋亡、脂肪代謝等等。皮膚癌包括鱗狀細胞癌、基底細胞癌、惡性黑色素瘤、惡性淋巴瘤、特發(fā)性出血性肉瘤、汗腺癌、隆突性皮膚纖維肉瘤、血管肉瘤等。其中常見的是鱗狀細胞癌和基底細胞癌。目前，研究結(jié)果表明，多種miRNA在皮膚癌細胞或臨床樣本中呈過表達或下調(diào)表達，且發(fā)現(xiàn)有些miRNA能夠誘導(dǎo)形成皮下腫瘤?；趍iRNA的表達與皮膚癌的相關(guān)性，miRNA可以作為皮膚癌相關(guān)的標志物，通過對miRNA表達的檢測，實現(xiàn)對皮膚癌的早期診斷和治療。目前，針對miRNA的檢測方法主要有NorthernBlot、基因芯片、熒光定量探針法、基于微球的流式細胞術(shù)技術(shù)。但NorthernBlot方法敏感度低、耗時長且RNA的用量較大，不適合高通量分析；基因芯片技術(shù)能實現(xiàn)miRNA的高通量分析，即在一塊芯片上同時檢測多個miRNA，但缺點是結(jié)果準確性低，重復(fù)性差，實驗價格昂貴；熒光定量探針法檢測靈敏度高，但檢測費用昂貴；而基于微球的流式細胞術(shù)技術(shù)將探針固定于微球上并置于液相中，更有利于捕獲miRNA序列，因此提高了準確性，但是由于miRNA同源性高，長度較短，細胞或組織內(nèi)含量低，針對它的高靈敏高選擇性檢測方法仍然有待進一步完善。原位雜交技術(shù)是一種定位和形態(tài)學檢測保存的組織切片或細胞制備物中特異性miRNA序列的方法。然而目前現(xiàn)有技術(shù)中對miRNA的多重平行檢測仍存在許多困難。首先，需要分別制備各靶miRNA的標記探針；其次，難以同時原位檢測多種靶miRNA的表達。因此，目前報道的對多種miRNA的檢測只能用不同的標記方法，然而，用不同的標記方法不能很好地控制探針與細胞中非特異性序列可能的交叉雜交。技術(shù)實現(xiàn)要素：本發(fā)明的目的在于提供一種特異性強、靈敏度高的皮膚癌相關(guān)microRNA檢測試劑盒。實現(xiàn)上述目的的技術(shù)方案如下。一種探針組合物，其特征在于，所述探針組合物能夠檢測皮膚癌相關(guān)標志物，所述標志物選自hsa-miR-375、hsa-miR-149-3p、hsa-miR-221-3p、hsa-miR-222-3p、hsa-miR-34a-5p、hsa-miR-199a-5p、hsa-miR-137、hsa-miR-182-5p、hsa-miR-125b-5p、hsa-miR-31-5p、hsa-miR-21-5p或hsa-miR-365a-3p中一種或以上。所述探針組合物，其特征在于，包括捕獲探針：所述捕獲探針的核苷酸序列自5’端至3’端依次為P1序列、間隔臂序列、P2序列；所述P1序列與權(quán)利要求1所述的標志物特異性結(jié)合；在其中一個實施例中，所述間隔臂序列為5個～10個T。在其中一個實施例中，所述P1序列選自SEQIDNO:1～12，所述P2序列選自SEQIDNO:13～24。在其中一個實施例中，所述的探針組合物，其特征在于，所述捕獲探針選自以下序列：自5’端至3’端順序連接的SEQIDNO:1、5個T、SEQIDNO:13；自5’端至3’端順序連接的SEQIDNO:2、5個T、SEQIDNO:14；自5’端至3’端順序連接的SEQIDNO:3、5個T、SEQIDNO:15；自5’端至3’端順序連接的SEQIDNO:4、5個T、SEQIDNO:16；自5’端至3’端順序連接的SEQIDNO:5、5個T、SEQIDNO:17；自5’端至3’端順序連接的SEQIDNO:6、5個T、SEQIDNO:18；自5’端至3’端順序連接的SEQIDNO:7、5個T、SEQIDNO:19；自5’端至3’端順序連接的SEQIDNO:8、5個T、SEQIDNO:20；自5’端至3’端順序連接的SEQIDNO:9、5個T、SEQIDNO:21；自5’端至3’端順序連接的SEQIDNO:10、5個T、SEQIDNO:22；自5’端至3’端順序連接的SEQIDNO:11、5個T、SEQIDNO:23；自5’端至3’端順序連接的SEQIDNO:12、5個T、SEQIDNO:24。本發(fā)明的另一目的是提供一種皮膚癌相關(guān)標志物檢測試劑盒，其特征在于，包含上述的捕獲探針和信號放大組合物。所述一種皮膚癌相關(guān)標志物檢測試劑盒，其特征在于，所述信號放大組合物為：一級信號放大探針，在一級信號放大探針的5’端修飾熒光基團；或一級信號放大探針，二級信號放大探針，在二級信號放大探針的3’端修飾熒光基團；或一級信號放大探針、二級信號放大探針，三級信號放大探針，在三級信號放大探針的5’端修飾熒光基團；針對所述捕獲探針中的任一種，所述一級信號放大探針與所述捕獲探針特異性結(jié)合；針對所述一級信號放大探針中的任一種，所述二級信號放大探針與所述一級信號放大探針特異性結(jié)合；針對所述二級信號放大探針中的任一種，所述三級信號放大探針與所述二級信號放大探針特異性結(jié)合。本發(fā)明提供的一種皮膚癌相關(guān)標志物檢測試劑盒，其另一特征在于，所述：一級信號放大探針自5’端至3’端依次為P4序列、間隔臂序列、P3序列；二級信號放大探針自5’端至3’端依次為P5序列、間隔臂序列、P6序列；三級信號放大探針自5’端至3’端依次為P8序列、間隔臂序列、P7序列；所述P3序列與P2序列特異性結(jié)合；所述P5序列與P4序列特異性結(jié)合；所述P6序列與P7序列特異性結(jié)合；所述間隔臂序列獨立的為2個～20個T；所述P8序列為5個T。在其中一個實施例中，所述P4序列選自SEQIDNO:25～36；所述P6序列選自SEQIDNO:49～60。在其中一個實施例中，所述熒光基團選自FAM、TET、JOE、HEX、Cy3、TAMRA、ROX、TexasRed、LCRED640、Cy5、LCRED705或AlexaFluor488，且針對不同捕獲探針的信號放大探針上修飾的熒光基團互不相同。本發(fā)明的主要優(yōu)點在于：(1)原位雜交方法本身具有熒光信號靈敏度低的缺點，但是本發(fā)明采用新型的原位雜交方法所設(shè)計的檢測試劑盒，通過信號放大體系提高熒光信號強度。本發(fā)明檢測流程能夠在8h內(nèi)完成，單一拷貝的核酸雜交探針通過信號放大系統(tǒng)，與相應(yīng)的熒光探針結(jié)合，顯著提高miRNA原位雜交的檢測靈敏度，此外，由于多位點特異配對、級聯(lián)放大的方式來實現(xiàn)信號的放大，而不是PCR擴增的方法，提高了檢測信號，實現(xiàn)了檢測的特異性，避免了逆轉(zhuǎn)錄PCR和實時熒光定量PCR技術(shù)的假陽性。(2)本發(fā)明所選擇的信號放大探針，是發(fā)明人經(jīng)過大量試驗進行綜合評估、統(tǒng)計分析、多種參數(shù)的優(yōu)化組合而得出的。本發(fā)明方法采用多重信號放大探針，該探針的選取，能夠?qū)崿F(xiàn)包括二級探針或三級使用，均能夠?qū)崿F(xiàn)信號放大檢測，當三種探針共同使用時，極大地提高檢測的靈敏度。(3)本發(fā)明所設(shè)計的12中miRNA的各種具體探針，能夠在均一的反應(yīng)條件下進行雜交反應(yīng)，且各種探針之間基本不存在非特異性結(jié)合；所設(shè)計的探針在檢測中特異性好、信噪比高。同時，多種探針的組合使用使鑒定試劑盒和檢測方法形成一個檢測效果完好的系統(tǒng)。具體實施方式本發(fā)明提供了一種皮膚癌相關(guān)標志物、其檢測探針與檢測方法，本領(lǐng)域技術(shù)人員可以借鑒本文內(nèi)容，適當改進工藝參數(shù)實現(xiàn)。特別需要指出的是，所有類似的替換和改動對本領(lǐng)域技術(shù)人員來說是顯而易見的，它們都被視為 包括在本發(fā)明。本發(fā)明的方法及應(yīng)用已經(jīng)通過較佳實施例進行了描述，相關(guān)人員明顯能在不脫離本
發(fā)明內(nèi)容、精神和范圍內(nèi)對本文的方法和應(yīng)用進行改動或適當變更與組合，來實現(xiàn)和應(yīng)用本發(fā)明技術(shù)。除非另有定義，本發(fā)明所使用的所有的技術(shù)和科學術(shù)語與屬于本發(fā)明的
技術(shù)領(lǐng)域：
的技術(shù)人員通常理解的含義相同。本發(fā)明的說明書中所使用的術(shù)語只是為了描述具體的實施例的目的，不用于限制本發(fā)明。實施例1皮膚癌相關(guān)miRNA檢測試劑盒本實施例提供一種皮膚癌相關(guān)miRNA檢測試劑盒，包括有捕獲探針以及信號放大探針，信號放大探針包括有，一級信號放大探針、二級信號放大探針、三級信號放大探針。以上探針具有特異性強、靈敏度高的特點。1、捕獲探針捕獲探針是連接靶核酸與一級信號放大探針，每條捕獲探針的堿基序列從5’端到3’端依次為與待檢測的靶核酸結(jié)合的特異性序列P1、間隔臂序列、能與P2序列，所述P3序列為與P2序列反向互補的堿基序列；針對不同目標基因的P2序列互不相同。所述間隔臂為用于將捕獲探針P2序列與特異性序列P1間隔開來，通過在探針內(nèi)部設(shè)置適當長度的間隔臂序列，可減少空間位阻，提高雜交反應(yīng)的效率以及雜交反應(yīng)的特異性。本發(fā)明捕獲探針的間隔臂優(yōu)選為5－10個T，本實施例優(yōu)選為5個T。本實施例針對hsa-miR-375、hsa-miR-149-3p、hsa-miR-221-3p、hsa-miR-222-3p、hsa-miR-34a-5p、hsa-miR-199a-5p、hsa-miR-137、hsa-miR-182-5p、hsa-miR-125b-5p、hsa-miR-31-5p、hsa-miR-21-5p或hsa-miR-365a-3p設(shè)計捕獲探針，具體如表1、表2：表1捕獲探針的P1序列SEQIDNO.miRNAP1序列(5’→3’)1hsa-miR-375TCACGCGAGCCGAACGAACAAA2hsa-miR-149-3pGCACAGCCCCCGTCCCTCCCT3hsa-miR-221-3pGAAACCCAGCAGACAATGTAGCT4hsa-miR-222-3pACCCAGTAGCCAGATGTAGCT5hsa-miR-34a-5pACAACCAGCTAAGACACTGCCA6hsa-miR-199a-5pGAACAGGTAGTCTGAACACTGGG7hsa-miR-137CTACGCGTATTCTTAAGCAATAA8hsa-miR-182-5pAGTGTGAGTTCTACCATTGCCAAA9hsa-miR-125b-5pTCACAAGTTAGGGTCTCAGGGA10hsa-miR-31-5pAGCTATGCCAGCATCTTGCCT11hsa-miR-21-5pTCAACATCAGTCTGATAAGCTA12hsa-miR-365a-3pATAAGGATTTTTAGGGGCATTA表2捕獲探針的P2序列SEQIDNO.P2序列(5’→3’)SEQIDNO.P2序列(5’→3’)13GTCTATAGTG19GATGACAGTA14GATTCAGTGA20AGTACTTGTG15TTGAGTAATG21AGTCTTGAAG16TGTAATGAGT22TGATGAATTG17GATTAGTGAT23ATGACGATAG18GTAGATTAGT24TTGACGTGAA2、信號放大探針1)一級信號放大探針信號放大組分中包括一條或以上的一級信號放大探針，所述每條一級信號放大探針從5’端到3’端依次為：與P2序列反向互補配對結(jié)合的P3序列、間隔臂序列、P4序列，P3序列通過與捕獲探針P2序列的結(jié)合實現(xiàn)目標信號的級聯(lián)放大。本發(fā)明P3與P4序列之間的間隔臂序列可以選自5－20個T，本實施例使用的間隔臂為10個T。所述P4序列含有一個或以上與二級信號放大探針的P5序列反向互補的堿基片段，優(yōu)選含有2～5個與P2序列互補配對的堿基片段，本實施例中，P4含有3個與P5反向互補的堿基片段，相同堿基片段之間設(shè)有間隔臂序列，所述間隔臂序列優(yōu)選為3—10個T，本實施例中為設(shè)有3個T，具體如表3：表3一級信號放大探針的P4序列SEQIDNO.P4序列(5’→3’)25GATCTCTTTGATCTCTTTGATCTC26ATATCATTTATATCATTTATATCA27TATCTCTTTTATCTCTTTTATCTC28CACATCTTTCACATCTTTCACATC29TCACATTTTTCACATTTTTCACAT30ACATCATTTACATCATTTACATCA31CATCGATTTCATCGATTTCATCGA32TCAGTCTTTTCAGTCTTTTCAGTC33ACTCTCTTTACTCTCTTTACTCTC34ATCATCTTTATCATCTTTATCATC35ACATCCTTTACATCCTTTACATCC36TCAGGATTTTCAGGATTTTCAGGA2)二級信號放大探針本發(fā)明含有一條或以上的二級信號放大探針，所述二級信號放大探針從5’端到3’端依次為：與P4序列反向互補結(jié)合的P5序列、間隔臂序列、P6序列，所述P4含有一個或以上的P5序列反向互補堿基序列。本發(fā)明P5與P6序列之間的間隔臂序列可以選自5－10個T，本實施例使用的間隔臂為6個T，具體如表4：表4二級信號放大探針的P5序列SEQIDNO.P5序列(5’→3’)SEQIDNO.P5序列(5’→3’)37GAGATC43TCGATG38TGATAT44GACTGA39GAGATA45GAGAGT40GATGTG46GATGAT41ATGTGA47GGATGT42TGATGT48TCCTGA所述P6序列含有一個或以上與三級信號放大探針的P7序列反向互補的堿基序列，優(yōu)選含有2-5個與P7序列互補配對的堿基片段，本實施例中，所述P6序列含有三個與P7序列反向互補片段，相同堿基序列之間設(shè)有間隔臂序列，間隔臂序列優(yōu)選為2—10個T，本實施例中為有2個T，具體見表5：表5二級信號放大探針的P6序列SEQIDNO.P6序列(5’→3’)49CACTCTTCACTCTTCACTC50CATGATTCATGATTCATGA51ACGACTTACGACTTACGAC52GACTCTTGACTCTTGACTC53CTGACTTCTGACTTCTGAC54ACACGTTACACGTTACACG55AGCATTTAGCATTTAGCAT56CAGCTTTCAGCTTTCAGCT57ACGTGTTACGTGTTACGTG58GACGATTGACGATTGACGA59CTAGCTTCTAGCTTCTAGC60TACGATTTACGATTTACGA3)三級信號放大探針本發(fā)明所述三級信號放大探針從5’端到3’端依次為：P8序列、間隔臂序列、P7序列，所述P6序列含有一個或以上與P7序列反向互補序列；所述P8序列5’端還修飾有熒光基團；本發(fā)明P7與P8序列之間的間隔臂序列可以選自3－10個T，本實施例 使用的間隔臂為5個T，具體如表6：表6三級信號放大探針的P7序列SEQIDNO.P7序列(5’→3’)SEQIDNO.P7序列(5’→3’)61GAGTG67ATGCT62TCATG68AGCTG63GTCGT69CACGT64GAGTC70TCGTC65GTCAG71GCTAG66CGTGT72TCGTA本發(fā)明所設(shè)計的信號放大探針，除上述條件限定的特定探針反向互補完全匹配的情況以外，所述P3、P4、P5、P6、P7、P8序列為不存在發(fā)夾結(jié)構(gòu)，探針內(nèi)部和探針間不形成二聚體、不存在錯配，與整個檢測體系的其它核酸之間均不存在特異性結(jié)合的序列。本實施例中，P8序列為5個堿基的polyT序列，其5’端帶有熒光基團標記，熒光基團可以選自：FAM、TET、JOE、HEX、Cy3、TAMRA、ROX、TexasRed、LCRED640、Cy5、LCRED705和AlexaFluor488，針對不同目標核酸的熒光基團互不相同，且所選擇的熒光基團的顏色互不相同或發(fā)射波長互不相同，以便于區(qū)分不同類型的目標核酸。實施例2一種檢測皮膚癌相關(guān)miRNA試劑盒本發(fā)明提供了一種皮膚癌相關(guān)miRNA檢測試劑盒，該試劑盒能夠檢測靶標miRNA包括：hsa-miR-375、hsa-miR-149-3p、hsa-miR-221-3p、hsa-miR-222-3p、hsa-miR-34a-5p、hsa-miR-199a-5p、hsa-miR-137、hsa-miR-182-5p、hsa-miR-125b-5p、hsa-miR-31-5p、hsa-miR-21-5p或hsa-miR-365a-3p等表達水平，在實際檢測中，能根據(jù)具體的需要，使用相應(yīng)的P1～P8序列，組成檢測試劑盒，即可實現(xiàn)檢測。本實施例檢測試劑盒的組分包括有：捕獲探針、信號放大探針和熒光基團，具體探針組分見表7所示。本實施例將hsa-miR-375、hsa-miR-149-3p、hsa-miR-221-3p、hsa-miR-222-3p、hsa-miR-34a-5p、hsa-miR-199a-5p、hsa-miR-137、hsa-miR-182-5p、hsa-miR-125b-5p、hsa-miR-31-5p、hsa-miR-21-5p以及hsa-miR-365a-3p等12種miRNA隨機分成3組，以檢測針對不同miRNA的 試劑盒組分，其可靠性和重復(fù)性。本實施例檢測試劑盒的組分包括有：捕獲探針、信號放大探針和熒光基團，具體探針組分見表7所示。表7針對具體目標基因的檢測試劑盒(表格數(shù)字為SEQIDNO.)實施例3運用實施例2中的試劑盒對樣品進行檢測本實施例將使用實施例2的試劑盒，對皮膚癌細胞進行檢測，本實施例以皮膚癌細胞株HS-1為例，本領(lǐng)域技術(shù)人員，根據(jù)細胞株名稱，即可在現(xiàn)有產(chǎn)品中獲得相關(guān)的細胞株。所述各種溶液的配方如下：本實施例中的信號放大探針混合液均使用實施例1相應(yīng)列表中的全部探針。一、樣本預(yù)處理，將樣品細胞過濾至濾膜上1.將樣本保存管中的皮膚癌細胞(HS-1)600×g水平離心5min，棄上清。2.加入4mLPBS和1mL固定劑，渦旋混勻，室溫靜置8min。3.樣本過濾：將樣本保存管中的液體轉(zhuǎn)移至過濾器中，打開真空抽濾泵抽盡液體；在本保存管中加入4mLPBS，洗滌管壁后抽濾液體。4.將濾膜轉(zhuǎn)移至24孔板中，加入400μL4％甲醛溶液，室溫固定1h。5.去除液體，每孔加入1mLPBS洗滌三次，每次浸泡2min。二、透化處理1.在新的24孔板中每孔加入50μL透化劑，將濾膜從PBS中取出，濾膜片邊緣接觸吸水紙，去除多余的液體，將濾膜倒扣在透化劑上，即濾膜鐵圈刻有編碼的一面向下貼近液體。室溫孵育5min。2.去除液體，每孔加入1mlPBS洗滌兩次，每次浸泡2min。將濾膜保持在PBS中至下一步實驗操作。三、消化細胞，暴露miRNA，使其與探針雜交1.配制相應(yīng)濃度的消化酶工作液：試劑組分每個樣本用量消化酶1.25μLPBS48.75μL總體積50μL2.消化酶工作液渦旋混勻，分裝至24孔板中，每孔50μl。3.將濾膜取出，倒扣至24孔板中消化酶工作液上，保證濾膜向下一面與液體充分接觸，不能有氣泡存在。室溫靜置1h。4.去除液體，每孔加入1mlPBS洗滌三次，每次浸泡2min。將濾膜保持在PBS緩沖液中至下一步實驗操作。四、探針雜交，探針特異性序列與目標miRNA序列結(jié)合1.捕獲探針混合液、探針緩沖液使用前需40℃水浴預(yù)熱20min。2.配制捕獲探針工作液：試劑組分每個樣本用量捕獲探針混合液8μL探針緩沖液(40℃預(yù)熱)42μL總體積50.0μL渦旋混勻，分裝至24孔板中，每孔50μl。3.將濾膜取出，倒扣至24孔板中捕獲探針工作液上，保證濾膜向下一面與液體充分接觸，不能有氣泡存在。4.蓋上24孔板蓋，40±1℃孵育3小時。5.去除液體，每孔加入1ml洗滌液洗滌三次，每次浸泡2min。將濾膜保持在洗滌液中至下一步實驗操作，樣本在洗滌液中浸泡時間不能超過30min。五、目標mRNA序列信號放大1.探針緩沖液使用前需40℃水浴預(yù)熱20min。2.配制探針工作液：試劑組分每個樣本用量信號放大探針混合液8μL探針緩沖液(40℃預(yù)熱)42μL總體積50.0μL渦旋混勻，分裝至24孔板中，每孔50μl。3.將濾膜取出，倒扣至24孔板中探針工作液上，保證濾膜向下一面與液體充分接觸，不能有氣泡存在。4.蓋上24孔板蓋，40±1℃孵育3小時。5.去除液體，每孔加入1ml洗滌液洗滌三次，每次浸泡2min。將濾膜保持在洗滌液中至下一步實驗操作，樣本在洗滌液中浸泡時間不能超過30min。六、顯色，熒光標記目標信號1.顯色緩沖液(40℃預(yù)熱)避光渦旋混勻，分裝至24孔板中，每孔50μl。2.將濾膜取出，倒扣至24孔板中顯色緩沖液上，保證濾膜向下一面與液體充分接觸，不能有氣泡存在。3.蓋上24孔板蓋，40±1℃孵育3小時。4.去除液體，每孔加入1ml洗滌液洗滌三次，每次浸泡2min。將濾膜保持在洗滌液中至下一步實驗操作，樣本在洗滌液中浸泡時間不能超過30min。七、熒光顯微鏡觀察本發(fā)明的對照品使用DAPI作為細胞核熒光基團，其發(fā)射藍色熒光信號。1.將濾膜細胞面朝上置于載玻片上，沿鐵圈內(nèi)環(huán)將濾膜割下，加10μL抗淬滅劑，蓋上18mm×18mm的蓋玻片，直接鏡檢或置于-20℃保存。2.通過20倍物鏡計數(shù)樣本細胞數(shù)量。3.根據(jù)10倍物鏡定位異性核位置，滴油，用油鏡觀察實驗結(jié)果，并拍照記錄結(jié)果。4.然后再根據(jù)10倍物鏡定位下一個異性核位置，滴油，用油鏡觀察實驗結(jié)果并視野拍照記錄結(jié)果。5.重復(fù)操作至拍完所有的異性核，數(shù)量與20倍物鏡計數(shù)結(jié)果一致。顯微鏡使用通道如下：表8熒光基團的激發(fā)波長和發(fā)射波長熒光基團激發(fā)波長(Excitationfilter)發(fā)射波長(Emissionfilter)DAPI330-385nm420nmAlexaFluor488460-495nm510-550nmCy3545-580nm610nmCy5616-649nm667-751nmTET521nm536nmHEX535nm556nmTAMRA555nm576nmTexasRed560-580nm600-650nm八、檢測結(jié)果判斷及分析1.陽性皮膚癌細胞鑒定標準在濾膜上，富集有皮膚癌細胞，皮膚癌細胞陽性的判定標準為：1)具有相應(yīng)靶標miRNA特異性標識物，在本試劑盒中表現(xiàn)為在相應(yīng)的熒光通道下顯示熒光信號點。2)細胞核DAPI染色陽性。3)皮膚癌細胞核形狀不規(guī)則，直徑大于10μm，明顯大于濾膜孔徑，濾膜孔徑為7μm。白細胞大小與濾膜孔大小相近。2.使用上述檢測方法，對每個樣本進行檢測和觀察，其中，針對細胞核的DAPI染色，使用“-”或“+”表示是否檢測到熒光；針對目標檢測miRNA的熒光信號強度，分別讀取每個樣本中10個皮膚癌細胞的相應(yīng)顏色的miRNA熒光點數(shù)量，并計算平均點數(shù)，具體結(jié)果為：表9樣本檢測結(jié)果(熒光信號點數(shù))實施例4試劑盒的穩(wěn)定性1、試劑盒穩(wěn)定性檢測本發(fā)明提供一種miRNA檢測的試劑盒，所述的試劑盒針對不同的目標檢測miRNA，選取不同數(shù)量的捕獲探針，組成相應(yīng)的探針混合液，從而實現(xiàn)不同數(shù)量miRNA的并行檢測。本實施例將使用實施例1探針組Group1組成的試劑盒，對三組不同細胞株的15種樣本(每種細胞株5個樣本)中的hsa-miR-375、hsa-miR-149-3p、hsa-miR-221-3p、hsa-miR-222-3p表達情況進行檢測，從而評估本發(fā)明試劑盒的穩(wěn)定性。2、關(guān)于檢測樣本本實施例使用皮膚癌的3種皮膚癌細胞作為檢測對象，從而驗證其有效性和穩(wěn)定性(可重復(fù)性)，具體細胞株和樣本如表10所示，本領(lǐng)域技術(shù)人員，根據(jù)細胞株名稱，即可在現(xiàn)有產(chǎn)品中獲得相關(guān)的細胞株。本實施例所述探針選自實施例1，實驗步驟參考實施例2。表10細胞株和檢測樣本樣本號皮膚癌細胞株實驗組樣本16～樣本20HS-1Group4樣本21～樣本25A431Group5樣本26～樣本30HS-4Group63、檢測結(jié)果使用上述試劑盒，對每個樣本進行檢測和觀察，其中，針對細胞核的DAPI染色，使用“-”或“+”表示是否檢測到熒光；針對目標檢測miRNA標志物的熒光信號強度，分別讀取每個樣本中10個皮膚癌細胞的相應(yīng)顏色的miRNA熒光點數(shù)量，并計算平均點數(shù)，具體結(jié)果為：表11樣本檢測結(jié)果(熒光信號點數(shù))從上述檢測結(jié)果可見，一方面，不同細胞株的樣本，其檢測結(jié)果不同，因此，本發(fā)明是能夠?qū)崿F(xiàn)不同miRNA表達水平檢測的，是有效的；另一方面，相同細胞株的5個樣本，其hsa-miR-375、hsa-miR-149-3p、hsa-miR-221-3p、hsa-miR-222-3p等4中miRNA的熒光點數(shù)檢測結(jié)果相近(±3)，具體見Group4(樣本16～20)、Group5(樣本21～25)或Group6(樣本26～30)，因此，本試劑盒重復(fù)性好；由此可見，本發(fā)明試劑盒是有效的，穩(wěn)定性可靠的，其它針對不同miRNA種類的試劑盒，其結(jié)果依然穩(wěn)定可靠，具體數(shù)據(jù)省略。實施例5靶標miRNA數(shù)量選擇1、試劑盒制備的設(shè)計(捕獲探針數(shù)量的選擇)本發(fā)明提供一種miRNA檢測的試劑盒，所述的試劑盒針對不同的目標檢測miRNA，選取不同數(shù)量的捕獲探針，組成相應(yīng)的探針混合液，從而實現(xiàn)不同數(shù)量miRNA的并行檢測。本實施例分別針對1種、3種、5種、7種miRNA，選用捕獲探針，信號 放大探針選擇一級信號方法探針、二級放大探針以及三級信號放大探針，組成檢測試劑盒，對同一細胞株HS-1的樣本進行檢測，對比其檢測效果，.具體組成如表12，所述探針選自實施例1，實驗步驟參考實施例2。表12選擇不同數(shù)量靶標miRNA的捕獲探針(表格數(shù)字為SEQIDNO.)2、使用上述試劑盒，對每個樣本進行檢測和觀察，其中，針對細胞核的DAPI染色，使用“-”或“+”表示是否檢測到熒光；針對目標檢測miRNA標志物的熒光信號強度，分別讀取每個樣本中10個皮膚癌細胞的相應(yīng)顏色的miRNA熒光點數(shù)量，并計算平均點數(shù)，具體結(jié)果為：表13樣本檢測結(jié)果(熒光信號點數(shù))通過上述4組實驗對比可知，本試劑盒可以針對不同數(shù)量的靶標miRNA進行檢測，使用1條、3條和5條、7條的針對不同miRNA捕獲探針均可完成檢測，特異性和穩(wěn)定性都很好。其它針對標志基因的使用不同數(shù)量捕獲探針的試劑盒，其結(jié)果依然穩(wěn)定可靠，具體數(shù)據(jù)省略。實施例6標記探針的選擇1、試劑盒制備的設(shè)計(信號放大探針組合的選擇)本發(fā)明提供一種皮膚癌相關(guān)miRNA檢測的試劑盒，所述的試劑盒針對不同的目標檢測miRNA，選取不同信號探針組合，組成相應(yīng)的探針混合液，從而實現(xiàn)miRNA的并行檢測。本實施例將使用實施例1的所提供的各級信號放大探針組成的試劑盒，對同一細胞株(HS-1)的5個樣本中的hsa-miR-149-3p、hsa-miR-222-3p、hsa-miR-199a-5p和hsa-miR-125b-5p表達情況進行檢測，從而評估本發(fā)明所提供的P2，P3，P4，P5，P6，P7信號放大探針的適用性。具體的試劑盒組成如下：表14不同信號放大探針組合(表格數(shù)字為SEQIDNO.)2、使用上述試劑盒，對每個樣本進行檢測(應(yīng)用實施例2所述檢測方法)和觀察，其中，針對細胞核的DAPI染色，使用“-”或“+”表示是否檢測到熒光；針對目標檢測miRNA標志物的熒光信號強度，分別讀取每個樣本中10個前列腺癌細胞的相應(yīng)顏色的miRNA熒光點數(shù)量，并計算平均點數(shù)，具體結(jié)果為：表15不同信號放大探針組合的檢測結(jié)果通過上述3組實驗對比可知，使用不同信號探針組合組成的試劑盒對miRNA進行檢測，其檢測結(jié)果相一致，除了本實施例檢測的miRNA以及其放大探針組合外，本發(fā)明所提供的其他miRNA以及其他信號放大探針的組合，同樣能實現(xiàn)本實施例的檢測效果，具體試驗結(jié)果省略。由此可知，本發(fā)明提供的信號放大探針可以根據(jù)實際操作需要進行任意搭配，并且能實現(xiàn)本發(fā)明所述的miRNA檢測，其檢測結(jié)果一致，說明本發(fā)明所提供的信號放大探針對于皮膚癌相關(guān)miRNA檢測具有良好的適用性。以上僅是本發(fā)明的優(yōu)選實施方式，應(yīng)當指出，對于本
技術(shù)領(lǐng)域：
的普通技術(shù)人員來說，在不脫離本發(fā)明原理的前提下，還可以做出若干改進和潤飾，這些改進和潤飾也應(yīng)視為本發(fā)明的保護范圍。當前第1頁1 2 3