本發(fā)明屬于環(huán)境微生物領域，具體涉及一種耐鹽的脫COD北見微桿菌及其培養(yǎng)應用，該菌株特別適用于高含鹽廢水中COD的高效去除。
背景技術(shù)：
來源于石油、化工、醫(yī)藥和化肥等行業(yè)的鹽含量高于1%的高含鹽廢水普遍含有較高的COD，廢水中污染物不斷排放到環(huán)境中會引起嚴重的污染問題。淡水資源的缺乏問題日益嚴重，廢水的處理及其回收利用更受到人們的重視。
物理或化學法處理高含鹽廢水中的COD，成本高并且可能會造成二次污染。傳統(tǒng)生物法在處理低鹽度廢水時有很大優(yōu)勢，但在高鹽、高酸堿、高溫或低溫逆環(huán)境中，微生物的降解能力就會受到抑制。耐鹽菌處理高含鹽廢水具有普通活性污泥法無可比擬的優(yōu)勢，且比物理化學法成本低，會產(chǎn)生較為明顯的經(jīng)濟效益和社會效益，可以為相關廢水處理達標排放提供技術(shù)支撐。
耐鹽菌技術(shù)正是基于工程領域的問題和急需而產(chǎn)生，通過科學方法馴化出處理高含鹽廢水的的優(yōu)勢耐鹽菌，該類菌體以其獨特的細胞結(jié)構(gòu)和物質(zhì)組成能夠在較高含鹽度的環(huán)境中生長。該類耐鹽微生物的耐鹽性狀與其適應極端環(huán)境的豐富酶系和活性產(chǎn)物有關。
在高含鹽廢水處理領域，鹽含量是影響微生物處理廢水效率的一個關鍵性因素。信欣等（生物強化技術(shù)處理高含鹽有機廢水[J].水處理技術(shù)，2008，8：66-70）采用生物強化技術(shù)處理高含鹽有機廢水，采用耐鹽菌生物強化的皂素廢水生物處理系統(tǒng)活性污泥的脫氫酶活性顯著提高，系統(tǒng)耐受氯離子濃度高達2.8%時，皂素廢水COD的去除率為84.41%。CN201210130657.0、CN201210130644.3、CN201010536065.X和CN201210130658.5涉及到采用沼澤考克氏菌（Kocuri apalustris）FSDN-A、科氏葡萄球菌（Staphylococcus cohnii）FSDN-C，節(jié)桿菌（Arthrobacter creatinolyticus）FDN-1、水氏黃桿菌（Flavobacterium mizutaii）FDN-2、脫氮副球菌（Paracoccus denitrificans）DN-3和甲基桿菌（Methylobacterium phyllosphaerae）SDN-3對含鹽廢水及催化裂化催化劑廢水中的氨氮、總氮及化學需氧量進行生物處理的方法。該方法需要培養(yǎng)多種菌株進行復配制備耐鹽菌劑，制備過程復雜，生產(chǎn)成本較高。
目前，還沒有篩選到用于處理高含鹽廢水的北見微桿菌的相關報道。
技術(shù)實現(xiàn)要素：
本發(fā)明的目的在于提供一種耐鹽的脫COD北見微桿菌及其培養(yǎng)應用。本發(fā)明提供的北見微桿菌可以快速降解脫除高含鹽廢水中的COD，具有耐鹽能力強，處理效果好等特點。
本發(fā)明提供一種北見微桿菌FSTB-4，其分類命名為北見微桿菌（Microbacterium kitamiense），已于2015年6月1日保藏于“中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心”，保藏編號為CGMCCNo.10939。
本發(fā)明提供的北見微桿菌FSTB-4，主要形態(tài)特征為：菌落顏色為較淺的灰棕色，菌株個體為桿狀。生理生化特征表現(xiàn)為：革蘭氏陽性，氧化酶陰性，接觸酶陽性，可分解利用多種碳源，具有硝酸鹽還原特性。該菌株能夠耐受氨曲南或萘啶酸。
本發(fā)明提供的北見微桿菌FSTB-4的16SrRNA基因序列見序列表。
本發(fā)明提供的北見微桿菌FSTB-4在含鹽廢水脫除COD中的應用。該菌株能夠應用于鹽含量1.0wt%-5.0wt%的含鹽廢水中COD的高效脫除。
本發(fā)明中，所述含鹽廢水可以是經(jīng)過預處理的化工合成廢水、煤化工廢水，也可以是煉油工藝、煤化工工藝及化工合成工藝等產(chǎn)生的廢水經(jīng)過反滲透減量化單元產(chǎn)生的濃鹽水。所述的含鹽廢水鹽含量為0.5wt%-5.0wt%，優(yōu)選為1.0wt%-4.5wt%，COD（Cr法，下同）含量為200 -20000mg/L。
本發(fā)明提供的北見微桿菌FSTB-4的培養(yǎng)方法，包括菌株活化、液體種子液培養(yǎng)、曝氣培養(yǎng)等三個階段，具體步驟為：
（1）菌株活化：將北見微桿菌FSTB-4接種到FSTB固體培養(yǎng)基的斜面或者平板中，25-35℃培養(yǎng)48小時，保存于4℃冰箱中。
（2）液體種子液培養(yǎng)：配制FSTB液體培養(yǎng)基，分裝于三角瓶中，滅菌并冷卻至室溫后，無菌環(huán)境下挑取斜面或平板中活化的菌株接種到三角瓶中，25-35℃培養(yǎng)24-72h。所述FSTB液體培養(yǎng)基為：FeSO4?7H2O 25mg/L，NH4NO3 286mg/L，KCl 929mg/L，CaCl2 2769mg/L，NaCl 21008mg/L，牛肉膏5g/L，蛋白胨10g/L，pH值范圍為6.0-8.5，優(yōu)選為6.5-8.0。FSTB固體培養(yǎng)基是在液體培養(yǎng)基中加入20g/L瓊脂。
（3）曝氣培養(yǎng)：在設有曝氣裝置的反應器中加入FSTB液體培養(yǎng)基或待處理含鹽廢水，按照體積比5%-25%的比例接種液體種子液，pH值控制在6.0-8.5，曝氣培養(yǎng)48-96小時，之后進行周期性的補料和排料操作，排料量占反應器體積的5%-90%，補料量占反應器體積的5%-90%，也可補加少量的碳源、氮源和微量元素物質(zhì)，培養(yǎng)24-48小時為1個培養(yǎng)周期，之后按照上述比例排出對應體積的培養(yǎng)液，由此得到含有較高濃度北見微桿菌的濃菌液產(chǎn)品。
本發(fā)明中，培養(yǎng)結(jié)束后，采集培養(yǎng)完畢的菌液，稀釋后涂布到含有FSTB固體培養(yǎng)基的平板中，對長出的菌落進行計數(shù)并統(tǒng)計與FSTB-4相似菌落的百分比。在封閉式培養(yǎng)環(huán)境下，北見微桿菌為純菌株，相似百分比達到95%以上。培養(yǎng)FSTB-4的生長環(huán)境盡管具有持續(xù)性的高鹽選擇壓力，但在長期開放式培養(yǎng)時仍可能會有少量的其它干擾菌株生長，為防止干擾菌持續(xù)性繁殖生長成為優(yōu)勢菌，當相似百分比接近50%時，可采取全部排料后重新進水接種培養(yǎng)的方式，之后恢復正常的開放式培養(yǎng)操作流程。
本發(fā)明還提供一種脫COD的耐鹽菌劑，該菌劑中包括北見微桿菌FSTB-4。所述的耐鹽菌劑可以是只采用北見微桿菌FSTB-4菌液制得的耐鹽菌劑，也可以與其他耐鹽菌劑復配，如可以與現(xiàn)有的具有脫氮、除磷及降解難降解有機物的微生物菌劑結(jié)合，實現(xiàn)更好的廢水處理效果。
本發(fā)明提供的耐鹽北見微桿菌FSTB-4是一株在高含鹽水體中具有較好COD脫除性能的菌株，耐鹽能力強，處理效果好，可以直接用于含鹽廢水的處理，也可以投加到現(xiàn)有含鹽廢水處理系統(tǒng)中，提高廢水處理效果。本發(fā)明提供的北見微桿菌FSTB-4的培養(yǎng)方法，可直接利用污水處理廠含鹽廢水（根據(jù)水質(zhì)條件補加少量天然培養(yǎng)基和化學合成培養(yǎng)基）進行優(yōu)勢菌株培養(yǎng)富集增濃工作，極大的維持耐鹽菌劑的生長特性和耐受特性，并降低耐鹽菌劑的培養(yǎng)成本。
生物材料保藏說明
本發(fā)明提供的北見微桿菌（Microbacterium kitamiense）FSTB-4菌株，保藏于中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心（CGMCC）；地址：北京市朝陽區(qū)北辰西路1號院3號中國科學院微生物研究所；保藏編號：CGMCC No.10939；保藏日期：2015年6月1日。
具體實施方式
本發(fā)明的北見微桿菌FSTB-4是2014年6月從取自湖南省岳陽市某石化企業(yè)用于處理環(huán)氧氯丙烷生產(chǎn)廢水的活性污泥中分離篩選得到的，其生理生化試驗結(jié)果見表1。
表1北見微桿菌FSTB-4的生理生化試驗結(jié)果
經(jīng)“中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心”鑒定，該菌株屬于北見微桿菌（Microbacterium kitamiense），命名為FSTB-4。
實施例2篩選和分離純化
采用逐漸提高培養(yǎng)液鹽濃度的方法對取自湖南省岳陽市某石化企業(yè)用于處理環(huán)氧氯丙烷生產(chǎn)廢水的活性污泥進行馴化培養(yǎng)15天。
取上述馴化好的活性污泥，采用稀釋涂布方法在富集培養(yǎng)基中進行初步分離，由此得到15個生長狀態(tài)良好且性狀各異的菌落。所采用的富集培養(yǎng)基含有的主要成分為：COD為1000mg/L，鈣離子濃度為1000mg/L，全鹽量為10000mg/L，所采用的固體培養(yǎng)基中瓊脂含量為2.0%。
然后采用平板劃線方法對得到的菌落進行轉(zhuǎn)接，劃線轉(zhuǎn)接到篩選培養(yǎng)基中，進行進一步分離和篩選。采用的篩選培養(yǎng)基含有的主要成分為：COD為1000mg/L，鈣離子濃度為4000mg/L，全鹽量為25000mg/L，所采用的固體培養(yǎng)基中瓊脂含量為2.0%。
由上述操作得到10株純菌株，其中一株即為北見微桿菌FSTB-4。
實施例3北見微桿菌FSTB-4耐鹽能力的考察
本發(fā)明所述的北見微桿菌FSTB-4的培養(yǎng)方法包括：菌株活化、液體種子液培養(yǎng)、曝氣培養(yǎng)，具體過程如下：
（1）菌株活化：將北見微桿菌FSTB-4接種到含有FSTB固體培養(yǎng)基的平板中，30℃環(huán)境下培養(yǎng)48小時，然后保存于4℃冰箱中待用。所述FSTB固體培養(yǎng)基為：FeSO4?7H2O 25mg/L，NH4NO3 286mg/L，KCl 929mg/L，CaCl2 2769mg/L，NaCl 21008mg/L，牛肉膏5g/L，蛋白胨10g/L，瓊脂20g/L，pH值7.8。
（2）液體種子液培養(yǎng)：配制FSTB液體培養(yǎng)基，分裝于三角瓶中，滅菌并冷卻至室溫后，無菌環(huán)境下用接種環(huán)挑取平板中活化后的菌株接種到三角瓶中，30℃條件下培養(yǎng)48小時。所述FSTB液體培養(yǎng)基為：FeSO4?7H2O 25mg/L，NH4NO3 286mg/L，KCl 929mg/L，CaCl2 2769mg/L，NaCl 21008mg/L，牛肉膏5g/L，蛋白胨10g/L，pH值7.8。
（3）曝氣培養(yǎng)：采用密閉的反應器進行培養(yǎng)，所采用反應器及各種器具均需要滅菌完全，進氣和排氣位置需安裝細菌過濾裝置，培養(yǎng)液、酸堿調(diào)節(jié)劑及微量元素溶液均需要滅菌后按照無菌操作規(guī)程投加，反應器需配備曝氣裝置，并可進行進水、調(diào)酸、調(diào)堿、補料和排水排料操作，在該反應器中放入滅菌后的FSTB液體培養(yǎng)基，按照反應器體積百分比10%的比例接種液體種子液，開啟培養(yǎng)過程后，培養(yǎng)過程中采用酸堿自動控制系統(tǒng)將培養(yǎng)液pH值范圍控制在6.0-8.5，曝氣培養(yǎng)72小時之后進行周期性的補料和排料操作，排料為反應器體積百分比50%的培養(yǎng)液，補料為反應器體積百分比50%的FSTB液體培養(yǎng)基，也可同時補加少量的碳源、氮源和微量元素物質(zhì)，培養(yǎng)24小時為1個培養(yǎng)周期，之后按照上述比例排出對應體積的培養(yǎng)液，由此得到含有純北見微桿菌的濃菌液產(chǎn)品。
采集上述培養(yǎng)完畢的濃菌液，稀釋后涂布到含有FSTB固體培養(yǎng)基的平板中，對長出的菌落進行計數(shù)并統(tǒng)計與FSTB-4相似菌落的百分比，相似百分比達到95%以上，即認定該北見微桿菌為純菌株。
采用上述培養(yǎng)得到的北見微桿菌FSTB-4處理含鹽廢水。本實施例以經(jīng)過預處理的環(huán)氧氯丙烷生產(chǎn)工藝含鹽廢水為例，所處理含鹽廢水的水質(zhì)為：COD濃度范圍為800-2000mg/L，鹽含量為1wt%-5wt%，處理溫度為30℃。處理效果如表2所示。
表2北見微桿菌FSTB-4處理含鹽廢水的效果
由表2可知，北見微桿菌FSTB-4能夠耐受的鹽含量為1.0wt%-5.0wt%，可以高效脫除廢水中的COD。
實施例4北見微桿菌FSTB-4開放式培養(yǎng)
本發(fā)明北見微桿菌FSTB-4的開放培養(yǎng)方法包括：菌株活化、液體種子液培養(yǎng)、開放式曝氣培養(yǎng)、純菌株檢測和優(yōu)勢菌維護，具體過程如下：
（1）菌株活化：將北見微桿菌FSTB-4接種到含有FSTB固體培養(yǎng)基的平板中，30℃環(huán)境下培養(yǎng)48小時，然后保存于4℃冰箱中待用。所述FSTB固體培養(yǎng)基為：FeSO4?7H2O 25mg/L，NH4NO3 286mg/L，KCl 929mg/L，CaCl2 2769mg/L，NaCl 21008mg/L，牛肉膏5g/L，蛋白胨10g/L，瓊脂20g/L，pH值7.8。
（2）液體種子液培養(yǎng)：配制FSTB液體培養(yǎng)基，分裝于三角瓶中，滅菌并冷卻至室溫后，無菌環(huán)境下用接種環(huán)挑取平板中活化后的菌株接種到三角瓶中，30℃條件下培養(yǎng)48小時。所述FSTB液體培養(yǎng)基為：FeSO4?7H2O 25mg/L，NH4NO3 286mg/L，KCl 929mg/L，CaCl2 2769mg/L，NaCl 21008mg/L，牛肉膏5g/L，蛋白胨10g/L，pH值7.8。
（3）開放式培養(yǎng)：在設有曝氣裝置的開放式反應器中加入待處理的含鹽廢水，本實施例以經(jīng)過預處理的環(huán)氧氯丙烷生產(chǎn)工藝含鹽廢水為例，所處理含鹽廢水的水質(zhì)為：COD濃度范圍為1000mg/L，鹽含量為1wt%-5.0wt%，培養(yǎng)溫度為35℃，按照體積比10%的比例接種液體種子液，曝氣培養(yǎng)96小時，培養(yǎng)液菌體濃度變化（以600nm時的吸光度數(shù)值OD600表示菌體濃度）如表3所示。
表3北見微桿菌FSTB-4菌體濃度變化
（4）純菌株檢測：采集上述培養(yǎng)完畢的生物菌劑混合液，稀釋后涂布到含有FSTB固體培養(yǎng)基的平板中，對長出的菌落進行計數(shù)并統(tǒng)計與FSTB-4相似菌落的百分比，相似百分比達到50%以上，則認定北見微桿菌為優(yōu)勢菌株。
（5）優(yōu)勢菌株維護：在純菌株檢測FSTB-4相似菌落百分比接近50%時，采取全部排料后重新進水并重新接種培養(yǎng)的方式，之后恢復正常的開放式培養(yǎng)流程。
本發(fā)明所述北見微桿菌FSTB-4對實際含鹽廢水的適應性和處理效果非常好，具有較強的COD降解功能，可單獨采用該菌株的純培養(yǎng)用于含鹽廢水的處理，也可放大培養(yǎng)后作為外源功能微生物投加到現(xiàn)有工藝流程，有針對性地對實際工藝狀況進行優(yōu)化調(diào)節(jié)，解決高鹽環(huán)境下活性污泥處理效果差且易退化的問題。采用耐鹽菌處理高含鹽廢水比物理化學法成本低，直接應用會產(chǎn)生較為明顯的經(jīng)濟效益和社會效益，可為高含鹽相關廢水處理達標排放提供技術(shù)支撐。
SEQUENCE LISTING
<110> 中國石油化工股份有限公司
中國石油化工股份有限公司大連石油化工研究院
<120> 一種北見微桿菌及其培養(yǎng)應用
<130> 新申請
<170> PatentIn version 3.5
<211> 1304
<212> DNA
<213> Microbacterium
aacgggtgag taacacgtga gcaacctgcc ctgaactctg ggataagcgc tggaaacggc 60
gtctaatact ggatatgagc tgcggaggca tcttcgtggt tggaaagatt tttcggtttg 120
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ctaaaactca aaggaattga cggggacccg cacaagcggc ggagcatgcg gattaattcg 840
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gccccttatg tcttgggctt cacgcatgct acaatggccg gtacaaaggg ctgcgatacc 1140
gcgaggtgga gcgaatccca aaaagccggt cccagttcgg attgaggtct gcaactcgac 1200
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