本發(fā)明屬于生物發(fā)酵技術領域，具體涉及一種以木質(zhì)纖維素為原料發(fā)酵制備丁醇的方法。

背景技術：

丁醇是一種重要的有機化工原料，在化工、醫(yī)藥和石油等工業(yè)部門有廣泛的用途。而且由于比乙醇多兩個亞甲基，丁醇具有更高的疏水性，較低的揮發(fā)性，可與汽油以任意比例混合，并具有與汽油相當?shù)臒嶂怠Ｗ鳛橐环N有潛力的可以替代汽油的可再生生物能源，丁醇越來越受到世界各國的關注。

隨著石油資源的日益枯竭，降低礦物能源的使用比重，加強可再生能源開發(fā)已成為人類今后能源利用的重要趨勢。而且采用以石油為原料的丙烯羰基合成法生產(chǎn)丁醇由于技術落后，裝置偏小導致產(chǎn)能不夠，致使中國丁醇市場長期供應不足，不能滿足國內(nèi)市場的需求。生物發(fā)酵法制備丁醇有其獨到的優(yōu)勢，發(fā)展生物丁醇將極大地緩解丁醇供應不足的現(xiàn)狀。

由于我國人口眾多，用傳統(tǒng)的原料（玉米和甘蔗）發(fā)酵生產(chǎn)丁醇勢必會造成與人爭糧的問題，造成糧食短缺，因此開展以可再生的生物質(zhì)材料為原料生物轉(zhuǎn)化生產(chǎn)生物丁醇是符合國情的研究方向。木質(zhì)纖維素類農(nóng)業(yè)副產(chǎn)物，蘊含大量的纖維素和半纖維素，例如玉米秸稈干物質(zhì)中纖維素占34-42%，半纖維素占22-28%（岳國君，纖維素乙醇工程概論[M].北京：化學工業(yè)出版社，2014）。纖維素的水解產(chǎn)物為葡萄糖，而半纖維素的水解產(chǎn)物主要為木糖，還有少量甘露糖、半乳糖和阿拉伯糖，木質(zhì)纖維素原料水解產(chǎn)生的混合糖中，半纖維素糖（主要為木糖）占30%-40%，因此半纖維素糖的發(fā)酵顯得至關重要。

菌株和原料問題一直是困擾丁醇發(fā)酵的瓶頸。近年來，國內(nèi)外對纖維原料發(fā)酵產(chǎn)丁醇的研究很多，主要圍繞菌種誘變選育，尋找合適的纖維原料及其糖液制備、發(fā)酵工藝條件優(yōu)化和溶劑提取等方面進行。目前工業(yè)上用于丁醇生產(chǎn)的菌株主要是丙酮丁醇梭菌和拜氏梭菌，具有相似的代謝路徑，其發(fā)酵產(chǎn)物主要分為3 類：1)溶劑（丙酮、乙醇和丁醇）；2)有機酸（乙酸、乳酸和丁酸）；3)氣體（包括二氧化碳、氫氣等）。他們有的能夠利用葡萄糖、蔗糖和淀粉，有的可以利用木糖、半乳糖和甘露糖，因此可以利用該菌對木質(zhì)纖維素水解的混合糖進行丁醇丙酮發(fā)酵。但是，傳統(tǒng)丙酮丁醇發(fā)酵普遍存在以下問題：（1）傳統(tǒng)的丙酮丁醇發(fā)酵菌株需在嚴格厭氧條件下培養(yǎng)發(fā)酵，稍有操作不慎，很容易進入空氣，造成菌體不能正常生長，因此在發(fā)酵過程中通常需要通入惰性氣體如N₂來保證無氧環(huán)境，能耗較高；（2）丁醇產(chǎn)率低，僅20%左右（質(zhì)量分數(shù)），使得丁醇發(fā)酵過程原料成本偏高，制約了丁醇發(fā)酵產(chǎn)業(yè)的發(fā)展；（3）發(fā)酵產(chǎn)物除了丁醇外還有40%的丙酮和乙醇等副產(chǎn)物，消耗了有限的碳代謝流，降低了產(chǎn)物中丁醇所占的比例，增加了回收丁醇的難度，提高了能耗。

中國專利201110047422.0提供了一種利用丙酮丁醇羧菌厭氧發(fā)酵產(chǎn)丁醇的方法，以葡萄糖為底物，初始葡萄糖濃度為60g/L，在通入N₂保持發(fā)酵罐嚴格厭氧環(huán)境的情況下，對丙酮丁醇羧菌產(chǎn)酸期和產(chǎn)醇期的pH進行調(diào)控，總?cè)軇┖投〈嫉漠a(chǎn)量分別為19.20-19.65g/L和11.43%-12.30g/L，丁醇選擇性為58.2%- 63.1%，溶劑產(chǎn)率為32.0%-32.8%，丁醇產(chǎn)率為19.1%-20.5%。

中國專利201210089406.2公開了一株產(chǎn)丁醇的拜氏梭菌（Clostridium beijerinckii）Y-3，該菌是通過對出發(fā)菌株Clostridium beijerinckii NCIMB8052采用甲基磺酸乙酯（EMS）誘變獲得的突變株，可以木糖渣為原料制備生物丁醇，在以木糖渣酶解液為碳源時，總?cè)軇┊a(chǎn)量為16g/L，丁醇產(chǎn)量為8.2g/L，解決了傳統(tǒng)生物發(fā)酵生產(chǎn)丁醇菌種能力和原料不足的問題。

中國專利201210163123.8通過基因工程手段抑制丙酮丁醇梭菌中葡萄糖轉(zhuǎn)運蛋白基因（glcG）的表達，增加木糖轉(zhuǎn)運蛋白、木糖異構酶和木糖糖激酶的表達或活力，提高了丙酮丁醇梭菌對木糖的利用率，以丙酮丁醇梭菌ATCC 824為出發(fā)菌株，獲得一株基因工程菌株824GlcG-TBA，使得對木糖的利用率從48.7%增加到93.6%。初始菌株ATCC824的溶劑產(chǎn)量為12.99g/L，其中丁醇7.85g/L，溶劑和丁醇產(chǎn)率分別為22.5%和13.6%。工程菌株824GlcG-TBA的溶劑產(chǎn)量為16.06g/L，其中丁醇9.11g/L，溶劑和丁醇產(chǎn)率分別為28.2%和16.0%。

但是，丙酮丁醇發(fā)酵菌株存在糖代謝的阻遏效應，即在葡萄糖存在時會優(yōu)先利用葡萄糖，木糖等其他糖類幾乎不消耗。同時丙酮丁醇梭菌本身利用木糖代謝的效率也較低，利用木糖發(fā)酵的速率遠低于葡萄糖發(fā)酵速率。

技術實現(xiàn)要素：

針對現(xiàn)有技術的不足，本發(fā)明提供了一種以木質(zhì)纖維素為原料發(fā)酵制備丁醇的方法。本發(fā)明以拜氏梭菌（Clostridium beijerinckii）XH0906為發(fā)酵菌株，可以同時利用纖維素和半纖維素的水解產(chǎn)物作為發(fā)酵底物，具有發(fā)酵產(chǎn)率高、丁醇選擇性高、耐氧能力強等特點。

本發(fā)明以木質(zhì)纖維素為原料發(fā)酵制備丁醇的方法，包括如下內(nèi)容：

（1）將木質(zhì)纖維素原料進行預處理；

（2）對預處理后原料進行酶解，得到纖維素和半纖維素水解混合糖液；

（3）利用氫氧化鈣對水解混合糖液進行脫毒處理；

（4）以脫毒后糖液為碳源，補加營養(yǎng)元素制備發(fā)酵培養(yǎng)基；

（5）將拜氏梭菌XH0906接種至發(fā)酵培養(yǎng)基中，發(fā)酵制備丁醇；所述拜氏梭菌XH0906，其分類命名為拜氏梭菌（Clostridium beijerinckii），已于2014年05月04日保藏于中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心，保藏編號為CGMCC No. 9124；保藏地址：北京市朝陽區(qū)北辰西路1號院3號中國科學院微生物研究所。

本發(fā)明所述的拜氏梭菌XH0906為革蘭氏陽性菌，細胞形態(tài)為桿狀，可以形成芽孢；接觸酶陰性，氧化酶陰性，不同化硝酸鹽。該菌株能夠高效利用葡萄糖之外其他多種糖類發(fā)酵，如可以利用葡萄糖、木糖、半乳糖、甘露糖、果糖、麥芽糖、纖維二糖、低聚葡萄糖和低聚木糖等中一種或幾種作為發(fā)酵制備丁醇的碳源；特別是能夠高效利用木質(zhì)纖維素水解糖液中的葡萄糖、木糖、甘露糖和半乳糖等作為發(fā)酵底物。該菌株在對含有葡萄糖的混合糖液發(fā)酵產(chǎn)丁醇的過程中，無葡萄糖優(yōu)先選擇性。

本發(fā)明所述拜氏梭菌XH0906可在非嚴格厭氧環(huán)境下生長和發(fā)酵，在pH4.0-9.0，溫度20-42℃的條件下均能良好生長，主要產(chǎn)物為丁醇，幾乎無丙酮和乙醇副產(chǎn)物產(chǎn)生。

本發(fā)明步驟（1）所述的木質(zhì)纖維素原料含有纖維素、半纖維素和木質(zhì)素，可以采用秸稈、木屑、能源植物等，優(yōu)選采用玉米秸稈。所述預處理方式可以采用一切可提高木質(zhì)纖維素酶解性能的物理、化學和熱化學技術，包括機械粉碎、輻射、微波、酸處理、堿處理、蒸汽爆破預處理和溶劑預處理，或上述方法的組合預處理等，優(yōu)選采用蒸汽爆破預處理。具體過程如下：將切碎的玉米秸稈進入到蒸汽爆破裝置的滯留器，在160-210℃下維持5-10分鐘，瞬間泄壓釋放，即得到蒸汽爆破與處理的玉米秸稈。

本發(fā)明步驟（2）預處理后的原料調(diào)節(jié)pH為4.5-5.0，用自來水配制成固液比為2%-10%（w/v），固體質(zhì)量與液體體積的百分比，g:mL），加入纖維素酶進行酶解。所述纖維素酶為一切可以把纖維素水解成單糖的酶蛋白，或酶蛋白混合物，其中至少包括3類酶蛋白組分：纖維素外切酶、纖維素內(nèi)切酶和β-葡萄糖苷酶。所述纖維素酶可以是商品酶，優(yōu)選諾維信的Ctec系列。纖維素酶的加入量為5-50 FPIU/g纖維素，酶解的pH值為4.5-5.0，溫度為45-55℃，攪拌速率為50-300r/min，酶解時間為24-72h。

本發(fā)明步驟（3）利用氫氧化鈣對水解混合糖液進行脫毒處理，直接加入氫氧化鈣固體顆粒調(diào)節(jié)酶解液的pH至9-12，于40-60℃，50-300r/min攪拌1h，采用常規(guī)方法進行固液分離，液體即為脫毒后的糖液。主要原理為：弱堿性的Ca(OH)₂能夠中和部分低分子量的有機酸，處理過程中形成的鈣鹽沉淀能夠吸附部分抑制劑，通過離心的方式得以分離，且Ca²⁺能夠增強細胞膜穩(wěn)定性，對細胞內(nèi)糖運輸相關基因、產(chǎn)丁醇相關基因都有重要影響。

本發(fā)明步驟（4）以脫毒后的糖液為碳源，配制用于XH0906菌株發(fā)酵用的培養(yǎng)基，其中糖濃度為25-50g/L，補加營養(yǎng)元素配成發(fā)酵培養(yǎng)基。

本發(fā)明步驟（5）發(fā)酵條件為厭氧發(fā)酵或兼氧發(fā)酵，培養(yǎng)基無需加入保險粉脫氧，接種量為（體積分數(shù)）1%-10%，發(fā)酵溫度為28-42℃，發(fā)酵過程不用通入N₂保持無氧環(huán)境，自然pH，發(fā)酵時間24-72小時，即得到含有丁醇的發(fā)酵液。本發(fā)明中，優(yōu)選在發(fā)酵前16h不控制，任pH自然下降，16h后通過流加10M的NaOH溶液調(diào)節(jié)pH為5.5-6.5。

與現(xiàn)有技術相比，本發(fā)明所具有的優(yōu)點是：利用拜氏梭菌（Clostridium beijerinckii）XH0906為發(fā)酵菌株，以氫氧化鈣脫毒后的木質(zhì)纖維素水解混合糖液作為底物發(fā)酵生產(chǎn)丁醇，發(fā)酵培養(yǎng)基中無需加入保險粉脫氧，發(fā)酵過程中不需要通入N₂保持無氧環(huán)境，丁醇的選擇性達到100%，幾乎無丙酮和乙醇副產(chǎn)物產(chǎn)生，葡萄糖和木糖混合為碳源時無選擇性，丁醇產(chǎn)量為7-10g/L，丁醇產(chǎn)率為20%-40%。本發(fā)明發(fā)酵生產(chǎn)丁醇的過程操作簡單，原料單耗低，產(chǎn)品更容易提純，對利用木質(zhì)纖維素原料生產(chǎn)丁醇的大規(guī)模工業(yè)應用具有重要意義。

具體實施方式

下面結合具體實施例對本發(fā)明方法和效果做進一步詳細說明。實施例在以本發(fā)明技術方案為前提下進行實施，給出了詳細的實施方式和具體的操作過程，但本發(fā)明的保護范圍不限于下述的實施例。本發(fā)明中，wt%為質(zhì)量分數(shù)。

本發(fā)明實施例使用的木質(zhì)纖維素原料為玉米干秸稈，其中纖維素38.2 wt%，半纖維素22.1 wt%，木質(zhì)素20.2 wt%，灰分3.9 wt%，用粉碎機粉碎至顆粒大小為1-5mm。

實施例1 以木糖為底物發(fā)酵產(chǎn)丁醇

發(fā)酵培養(yǎng)基成分：蛋白胨10 g/L、牛肉膏6 g/L、木糖30 g/L、氯化鈉0.5 g/L、硫酸銨0.9 g/L、硫酸鐵0.1 g/L、硫酸鎂0.3 g/L、氯化鈣0.1 g/L，pH 7.0，在121℃下滅菌15min。

以拜氏梭菌（Clostridium beijerinckii）XH0906為發(fā)酵菌株，制備發(fā)酵種子液。種子培養(yǎng)基同發(fā)酵培養(yǎng)基，將保藏的拜氏梭菌從斜面上刮下1-2環(huán)接入搖瓶種子培養(yǎng)基中，不需要通入N₂，30℃靜置培養(yǎng)36 h，制備得到發(fā)酵種子液。

利用5L發(fā)酵罐發(fā)酵，裝液量3 L，接種量10%，攪拌速率150 r/min，控制pH為6.0，發(fā)酵48h后木糖完全消耗，發(fā)酵液中的丁醇、乙酸和丁酸濃度分別為8.96 g/L、0.08 g/L和0.03 g/L，木糖到丁醇的產(chǎn)率為29.9%。

實施例2 以葡萄糖和木糖混合碳源為底物發(fā)酵產(chǎn)丁醇

發(fā)酵培養(yǎng)基成分：蛋白胨10 g/L、牛肉膏6 g/L、葡萄糖12 g/L、木糖18 g/L、氯化鈉0.5 g/L、硫酸銨0.9 g/L、硫酸鐵0.1 g/L、硫酸鎂0.3 g/L、氯化鈣0.1 g/L, pH 7.0，在121℃下滅菌15min。

以拜氏梭菌（Clostridium beijerinckii）XH0906為發(fā)酵菌株，制備發(fā)酵種子液。種子培養(yǎng)基同發(fā)酵培養(yǎng)基，將保藏的拜氏梭菌從斜面上刮下1-2環(huán)接入搖瓶種子培養(yǎng)基中，不需要通入N₂，30℃靜置培養(yǎng)36 h，制備得到發(fā)酵種子液。

利用5L發(fā)酵罐發(fā)酵，裝液量3 L，接種量為10%，攪拌速率150 r/min，發(fā)酵48h后葡萄糖和木糖完全消耗，發(fā)酵液中的丁醇、乙酸和丁酸濃度分別為8.85 g/L、0.09 g/L和0.04 g/L，葡萄糖和木糖到丁醇的產(chǎn)率為30.4%。

實施例3 以玉米秸稈水解混合糖液為底物發(fā)酵產(chǎn)丁醇

（1）將玉米秸稈進行預處理：取粉碎的玉米秸稈利用2.0wt%的稀硫酸浸漬，固液比為1g:2ml，進入到蒸汽爆破裝置的滯留器中，在溫度170℃，壓力0.7MPa下維持5分鐘，瞬間泄壓爆破，得到稀酸蒸汽爆破預處理的玉米秸稈，主要由木糖、纖維素和木質(zhì)素組成，干物質(zhì)濃度為32%，木糖含量為21.2%（相對于干物質(zhì)），纖維素含量為38.6%。

（2）對預處理后玉米秸稈進行酶解：把經(jīng)過稀酸蒸汽爆破預處理的玉米秸稈物料利用NaOH調(diào)節(jié)pH 到5.0。加入自來水調(diào)節(jié)干物質(zhì)濃度為5%，加入諾維信的Ctec2纖維素酶（10 IU/g纖維素），于50℃、150r/min酶解24 h，酶解的pH 值為5.0，酶解液利用液相色譜檢測，木糖濃度為10.6 g/L，葡萄糖濃度為20.3 g/L，纖維素的葡萄糖酶解得率為94.6%。

（3）利用氫氧化鈣對水解混合糖液進行脫毒處理：直接加入氫氧化鈣固體調(diào)節(jié)酶解液的pH 至10.5，于50℃，120r/min攪拌1h，固液分離后，液體即為脫毒后的糖液。

（4）以脫毒后糖液為碳源，補加以下營養(yǎng)元素配成發(fā)酵培養(yǎng)基：酵母粉1g/L，磷酸氫二鉀0.5g/L，磷酸二氫鉀0.5g/L，乙酸銨2.2g/L，七水合硫酸鎂0.2g/L，一水合硫酸錳0.01g/L，七水合硫酸亞鐵0.01g/L，氯化鈉0.01 g/L，對氨基苯甲酸0.001 g/L，維生素B1 0.001 g/L，生物素0.0001g/L，調(diào)節(jié)pH至6-7。

（5）將拜氏梭菌XH0906種子液按照5%的接種量接種至發(fā)酵培養(yǎng)基中，發(fā)酵制備生物丁醇：培養(yǎng)基無需加入保險粉脫氧，發(fā)酵溫度為37℃，發(fā)酵過程不用通入N₂保持無氧環(huán)境，自然pH，發(fā)酵48小時，即得到含有丁醇的發(fā)酵液，發(fā)酵液中的丁醇濃度為7.7 g/L，葡萄糖和木糖全部利用，葡萄糖和木糖到丁醇的產(chǎn)率為24.9%。

實施例4

處理流程和操作條件同實施例3，不同之處在于：步驟（5）在發(fā)酵前16h不控制，任pH自然下降，16h后通過流加10M的NaOH溶液調(diào)節(jié)pH為6.0。

發(fā)酵48小時，即得到含有丁醇的發(fā)酵液，發(fā)酵液中的丁醇濃度為8.5 g/L，葡萄糖和木糖全部利用，葡萄糖和木糖到丁醇的產(chǎn)率為27.5 %。

比較例1

處理流程和操作條件同實施例3，不同之處在于：采用拜氏梭菌（Clostridium beijerinckii) NCIMB 8052，購于英國國家工業(yè)、海洋和食品菌種保藏中心。發(fā)酵72小時，即得到含有丁醇的發(fā)酵液，發(fā)酵液中的總?cè)軇舛?.0 g/L，其中丁醇濃度為3.1 g/L，丙酮濃度為1.6 g/L和乙醇濃度0.3 g/L，葡萄糖和木糖到丁醇的產(chǎn)率為19.9 %，殘余葡萄糖濃度8.9 g/L，殘余木糖6.4 g/L。

比較例2

處理流程和操作條件同實施例3，不同之處在于：采用CN201410731297.9所述的拜氏梭菌（Clostridium beijerinckii）CM20，保藏編號為CGMCC No. 9354。發(fā)酵72小時，即得到含有丁醇的發(fā)酵液，發(fā)酵液中的總?cè)軇舛?.4 g/L，其中丁醇濃度為5.8 g/L，丙酮濃度為2.7 g/L和乙醇濃度0.9 g/L，葡萄糖和木糖到丁醇的產(chǎn)率為20.5 %，殘余木糖2.6 g/L，葡萄糖全部利用。