本發(fā)明屬于生物技術(shù)和生物能源領(lǐng)域，具體涉及一株產(chǎn)油單針藻及其培養(yǎng)應(yīng)用。
背景技術(shù)：
隨著社會(huì)的快速發(fā)展，化石能源日益短缺，環(huán)境污染日趨嚴(yán)重，能源問題成為了制約整個(gè)人類社會(huì)發(fā)展的關(guān)鍵，尋找一種清潔、經(jīng)濟(jì)、高效、可再生的新能源成為了當(dāng)前急需解決的問題，世界正逐步走向“后石油時(shí)代”。
生物質(zhì)是一種可持續(xù)、可再生、低成本，且可代替化石燃料的新能源。微藻，作為一種水生生物質(zhì)資源，具有光合作用效率高、生長速率快、生物質(zhì)產(chǎn)量高、環(huán)境適應(yīng)能力強(qiáng)等優(yōu)點(diǎn)，有綜合利用價(jià)值，可用于生產(chǎn)生物質(zhì)能源，包括生物柴油，生物燃料乙醇等，且不與糧爭地，不與人爭糧，可作為生物燃料原料，并具有較好的發(fā)展前景。開發(fā)微藻生物能源，具有多重效果，既可減少化石燃料的使用、減少CO2的排放又可凈化廢氣和污水。
微藻在光合作用自養(yǎng)的過程中，細(xì)胞內(nèi)可積累油脂、淀粉、糖原等成分，某些藻類中淀粉和糖原含量占細(xì)胞干重的30%，也有一些藻類在特定培養(yǎng)條件下油脂含量可高達(dá)80%。如何有效的篩選獲得具有高油脂或高淀粉含量、環(huán)境適應(yīng)能力強(qiáng)、可規(guī)模化培養(yǎng)且成本較低的新藻種，便成了各國工作者研究的重點(diǎn)。
楊勛等（富油微藻Monoraphidium sp.的分離及其油脂提取工藝研究，安徽農(nóng)業(yè)科學(xué)，2011年第32期）采用尼羅紅熒光染料對分離自海南淡水水體的微藻進(jìn)行初篩，得到油脂含量較高的Monoraphidium sp.，采用Bligh-Dyer超聲法提取該微藻的油脂，并通過正交試驗(yàn)優(yōu)化微藻油脂提取的工藝條件為：溶劑氯仿、甲醇和水的比例為10:10:9，超聲功率600W、提取溫度50℃、提取時(shí)間30 min。在該條件下出油率為22.95%。
CN103540533A公開了一種產(chǎn)油單針藻LB59的獲得及應(yīng)用，自野外環(huán)境分離獲得，能夠耐受高濃度碳酸氫鈉并以其為碳源，培養(yǎng)溫度30-35℃，油脂含量可達(dá)到細(xì)胞干重的30.2%。CN103555584A公開了一種產(chǎn)油單針藻LB50的獲得及應(yīng)用，能夠耐受高濃度碳酸氫鈉并以其為碳源，培養(yǎng)溫度25-30℃，油脂含量可達(dá)到細(xì)胞干重的30.4%。CN104073437A公開了一種單針藻C29，開放式培養(yǎng)的溫度為16-40℃，作為優(yōu)選，開放式培養(yǎng)的溫度為28℃。CN104611228A公開了一種富含油脂的單針藻（Monoraphidium sp.）SS-B1及其培養(yǎng)應(yīng)用，該藻株可以利用含CO2和SO2的廢氣或煙氣進(jìn)行光照自養(yǎng)生長獲取富含油脂的生物質(zhì)，培養(yǎng)溫度為15-40℃，優(yōu)選25-28℃，細(xì)胞總脂含量占細(xì)胞干重的40%以上。
但是，上述分離篩選出來的微藻，有的不能利用CO2進(jìn)行自養(yǎng)生長，有的耐低溫性能差，在低溫條件下（低于15℃），生長速度緩慢，有的甚至死亡。在冬天寒冷的天氣下，需要進(jìn)行加熱培養(yǎng)，能耗較高。
技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：
針對現(xiàn)有產(chǎn)油微藻的不足，本發(fā)明提供了一株產(chǎn)油單針藻及其培養(yǎng)應(yīng)用。該藻株在自養(yǎng)條件可以高效生長，獲得富含油脂的生物質(zhì)；而且環(huán)境適應(yīng)能力強(qiáng)，在低溫下仍能保持較快的生長，油脂含量高，可用于生物柴油的生產(chǎn)。
本發(fā)明提供的產(chǎn)油單針藻SHJ-02，其分類命名為單針藻(Monoraphidium sp.) ，已于2015年4月24日保藏于中國微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中心，保藏編號為CGMCC No. 10763。
本發(fā)明提供的單針藻SHJ-02在顯微鏡下單個(gè)藻細(xì)胞呈梭形，長軸28-32μm，短軸4-6μm。
本發(fā)明提供的單針藻SHJ-02的18S rDNA基因測序分析結(jié)果見序列表。
本發(fā)明所述單針藻SHJ-02的培養(yǎng)方法，包括如下步驟：
（1）配制BG11淡水微藻培養(yǎng)基，分裝，滅菌；
（2）從固體平板上挑選單藻落接種到上述培養(yǎng)基中，培養(yǎng)至指數(shù)生長期；
（3）將步驟（2）培養(yǎng)的藻液轉(zhuǎn)接至裝有BG11培養(yǎng)基的管式光反應(yīng)器中，通氣培養(yǎng)，通氣量為0.5-3vvm（每分鐘通氣量/培養(yǎng)液體積），CO2含量為0.5%-3%（v/v），溫度為5-33℃。
本發(fā)明步驟（1）中，將配制好的BG11培養(yǎng)基分裝在50-250mL的錐形瓶中，每瓶裝液量為20-100mL，用透氣膜封口，包上牛皮紙進(jìn)行滅菌，在溫度121℃，壓力0.1MPa下滅菌20-30min。
本發(fā)明步驟（2）中，接種操作在無菌間進(jìn)行，接種后將培養(yǎng)液搖勻，用透氣膜包好，在5-33℃的恒溫光照反應(yīng)搖床中進(jìn)行，光照強(qiáng)度為1000-10000Lux，光暗反應(yīng)周期為24h，光暗時(shí)間比為14:10，搖床轉(zhuǎn)速為80-160rpm，培養(yǎng)至指數(shù)生長期。
本發(fā)明步驟（3）中，在管式光反應(yīng)器中，優(yōu)選溫度為10-25℃，通氣量為0.75-1.5vvm，CO2含量為1.5%-2.5%。在光照強(qiáng)度1000-10000Lux，光暗反應(yīng)周期為24h，光暗比為10:14-14:10，pH值為6-9，培養(yǎng)至進(jìn)入穩(wěn)定期，結(jié)束培養(yǎng)，收獲藻細(xì)胞。
本發(fā)明的單針藻SHJ-02在生產(chǎn)微藻油脂中的應(yīng)用。該單針藻藻株耐低溫能力強(qiáng)，在低溫5-15℃下仍能保持較快的生長，油脂含量高，所占細(xì)胞干重可達(dá)40%以上，能夠進(jìn)行生物柴油的生產(chǎn)。
與現(xiàn)有單針藻相比，本發(fā)明具有以下有益效果：
1、本發(fā)明篩選得到的單針藻，在自養(yǎng)條件可高效生長，耐低溫能力強(qiáng)，即使在5-15℃下，仍能保持較快的生長速率，胞體內(nèi)油脂含量高。
2、該藻株所得產(chǎn)品的經(jīng)濟(jì)性高，在普通培養(yǎng)條件下，溫度10-25℃下，經(jīng)過14-18天培養(yǎng)后，藻干重比（每升培養(yǎng)液中藻的干重）可達(dá)6.3g/L；藻體內(nèi)的油脂含量也相對較高，所占細(xì)胞干重最高可達(dá)55.6%，可作生物柴油的部分原料。
生物材料保藏說明
本發(fā)明提供的單針藻（Monoraphidium sp.）SHJ-02，保藏于中國微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中心；地址：北京市朝陽區(qū)北辰西路1號院3號中國科學(xué)院微生物研究所；保藏編號：CGMCC No. 10763；保藏日期：2015年4月24日。
具體實(shí)施方式
下面結(jié)合實(shí)施例對本發(fā)明作進(jìn)一步詳細(xì)說明，但不因此造成對本發(fā)明的限制。
實(shí)施例1 分離篩選獲得單針藻SHJ-02
（1）富集培養(yǎng)：2011年10月從黑龍江松花江采集水樣，紗布過濾，除去大的固形物；將80mL過濾后的水樣接種到200mL的BG11培養(yǎng)基中，富集培養(yǎng)，培養(yǎng)的光照強(qiáng)度為8000Lux，溫度為25℃，光暗周期為24h，光暗時(shí)間比為14:10，培養(yǎng)半個(gè)月后，培養(yǎng)基呈現(xiàn)明顯綠色，顯微鏡觀察到大量藻體存在。所述BG11培養(yǎng)基的配方見表1、表2。
表1 BG11培養(yǎng)基
*表2 表1中A5+Co solution的組成
（2）純藻株的獲得：將富集培養(yǎng)的水樣稀釋至10-5倍，在無菌條件下，涂布到BG11固體平板上培養(yǎng)，培養(yǎng)的光照強(qiáng)度為8000Lux，溫度為25℃，培養(yǎng)約13天后平板上出現(xiàn)綠色的單藻落，挑取單藻落在搖瓶上培養(yǎng)，培養(yǎng)10天后，顯微鏡觀察確定是否為純藻種，若不是純種，重復(fù)上述步驟，直到確定為純培養(yǎng)藻株為止。經(jīng)過反復(fù)培養(yǎng)，獲得單藻落。
（3）目的藻株的獲得：將獲得的單藻落接種到50mL搖瓶中進(jìn)行繼續(xù)培養(yǎng)，培養(yǎng)光照強(qiáng)度為8000Lux，溫度為25℃，光暗周期為24小時(shí)，光暗時(shí)間比為14:10，每天搖動(dòng)至少3次，至對數(shù)生長期，以5%的接種量接種到管式光照反應(yīng)器中，培養(yǎng)光照強(qiáng)度為8000Lux，通入CO2 3%（v/v），連續(xù)光照，控制培養(yǎng)溫度從25℃逐級降低至5℃，每次降溫2℃，反復(fù)馴化培養(yǎng)3次。馴化完后，取部分液體在BG11平板上進(jìn)行劃線，從而獲得目標(biāo)藻株SHJ-02。
實(shí)施例2 藻株的鑒定
將獲得SHJ-02藻細(xì)胞的DNA的提取采用CTAB法，并采用18S rDNA基因克隆，將得到的3個(gè)陽性克隆送至上海生工公司測序。18S rDNA基因測序分析結(jié)果見序列表。將18S rDNA序列登錄到Genbank數(shù)據(jù)庫進(jìn)行Blast比對，結(jié)果顯示與Monoraphidium sp.有最大的相似性，其BLASTn值為2619，Max index值為99%，可以確定SHJ-02為單針藻（Monoraphidium sp.）。
實(shí)施例3 單針藻SHJ-02的培養(yǎng)應(yīng)用
（1）根據(jù)表1、表2配制BG11淡水微藻培養(yǎng)基，分裝在250mL的錐形瓶中，每瓶裝液量為50mL，用透氣膜封口，包上牛皮紙進(jìn)行滅菌，在溫度121℃，壓力0.1MPa下滅菌20-30min。
（2）從固體平板上挑選單藻落SHJ-02接種到上述培養(yǎng)基中，在5-33℃的恒溫光照反應(yīng)搖床中進(jìn)行，光照強(qiáng)度為8000Lux，光暗反應(yīng)周期為24h，光暗時(shí)間比為14:10，搖床轉(zhuǎn)速為100rpm，培養(yǎng)至指數(shù)生長期。
（3）將步驟（2）培養(yǎng)的藻液轉(zhuǎn)接至裝有BG11培養(yǎng)基的管式光反應(yīng)器中，通氣培養(yǎng)，通氣量為1.0vvm，CO2含量為2%（v/v），溫度為5-30℃，光照強(qiáng)度8000Lux，光暗反應(yīng)周期為24h，光暗比為10:14-14:10，pH值為7，培養(yǎng)至進(jìn)入穩(wěn)定期，結(jié)束培養(yǎng)，收獲藻細(xì)胞。
將收獲的藻細(xì)胞冷凍干燥后檢測微藻生物量和油脂含量。在-60℃條件下真空冷凍干燥至恒重后測量藻粉干重，計(jì)算生物質(zhì)產(chǎn)量。采用正己烷：乙酸乙酯法測得總脂含量，具體為：稱量干燥的藻粉，重量計(jì)為m，放入瓷研缽中，加入適量石英砂和液氮，待液氮揮發(fā)后，研磨破壁；加入10mL乙酸乙酯:正己烷=1:1的混合有機(jī)溶劑，超聲清洗儀處理20min，50-60℃恒溫水浴中提取45min；離心15min，收集上清液至離心管中，重復(fù)提取兩次，合并提取液；向提取液中加入等體積的蒸餾水，震蕩混勻后離心4分鐘，收集上層有機(jī)相至已烘干并準(zhǔn)確稱量凈重（計(jì)為W1）的試管中；70-80℃水浴蒸發(fā)試管中的溶劑1.5h（至看不到液體狀溶劑），70-80℃烘箱烘干至恒重，計(jì)為W2。計(jì)算藻細(xì)胞的總脂含量C（%）：C=100×（W2-W1）/m。不同培養(yǎng)溫度下，微藻生物量和油脂含量的培養(yǎng)結(jié)果如表3所示。
表3 不同溫度下微藻生物量和油脂含量
由表3可見，本發(fā)明獲得的單針藻SHJ-02在低溫條件下也具有良好的活性，油脂含量可達(dá)55.6%。
實(shí)施例4 單針藻SHJ-02的應(yīng)用
將對數(shù)生長期的單針藻SHJ-02的藻液接種在BG11培養(yǎng)基中進(jìn)行培養(yǎng)，BG11培養(yǎng)基的配方見表1和表2，在管式光生物反應(yīng)器中培養(yǎng)，溫度為10℃，通氣量為0.75-1.5vvm，CO2含量為1.5%-2.5%，光照強(qiáng)度5000-8000Lux，光暗反應(yīng)周期為24h，光暗比為10:14-14:10，pH值為6-9，培養(yǎng)至進(jìn)入穩(wěn)定期，結(jié)束培養(yǎng)，收獲藻細(xì)胞。將收獲的藻細(xì)胞冷凍干燥后檢測微藻生物量和油脂含量。不同培養(yǎng)條件下，微藻生物量和油脂含量的培養(yǎng)結(jié)果如表4所示。
表4不同培養(yǎng)條件下微藻生物量和油脂含量
由表4可見，本發(fā)明獲得的單針藻SHJ-02在低溫條件下，仍能保持良好的生長活性，且藻種胞內(nèi)油脂含量較高，油脂含量達(dá)40%以上。
比較例1
以CN104611228A所述的單針藻SS-B1為藻種，采用與實(shí)施例4相同的培養(yǎng)條件，其中，選取通氣量為1.0vvm，CO2含量為2.0%，光照強(qiáng)度8000lux，維持培養(yǎng)液pH=7。實(shí)驗(yàn)結(jié)果發(fā)現(xiàn)單針藻SS-B1的生物量為1.3g/L，油脂含量為27.1%。與相同培養(yǎng)條件下的SHJ-02相比，該藻株在低溫條件下生長不理想，油脂產(chǎn)量低。
SEQUENCE LISTING
<110> 中國石油化工股份有限公司
中國石油化工股份有限公司大連石油化工研究院
<120> 一株產(chǎn)油單針藻及其培養(yǎng)應(yīng)用
<130> 新專利申請
<170> PatentIn version 3.5
<211> 1418
<212> DNA
<213> Monoraphidium sp.
gtagtcatat gcttgtctca aagattaagc catgcatgtc taagtataaa ctgcttatac 60
tgtgaaactg cgaatggctc attaaatcag ttatagttta tttgatggta cctctacacg 120
gataaccgta gtaattctag agctaatacg tgcgtaaatc ccgacttctg gaagggacgt 180
atttattaga taaaaggccg accggggctt gccccgaccc gcggtgaatc atgataactt 240
cacgaatcgc atggccttgt gccggcgatg tttcattcaa atttctgccc tatcaacttt 300
cgatggtagg atagaggcct accatggtgg taacgggtga cggaggatta gggttcgatt 360
ccggagaggg agcctgagaa acggctacca catccaagga aggcagcagg cgcgcaaatt 420
acccaatcct gatacgggga ggtagtgaca ataaataaca ataccgggca tttaatgtct 480
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gtgccagcag ccgcggtaat tccagctcca atagcgtata tttaagttgt tgcagttaaa 600
aagctcgtag ttggatttcg ggtgggttcc agcggtccgc ctatggtgag tactgctgtg 660
gccctccttt ttgccgggga cggtctcctg ggcttcactg tccgggaatc ggagtcggcg 720
atgatacttt gagtaaatta gagtgttcaa agcaagccta cgctctgaat actttagcat 780
ggaatatcgc gataggactc tggcctatct cgttggtctg taggaccgga gtaatgatta 840
agagggacag tcgggggcat tcgtatttca ttgtcagagg tgaaattctt ggatttatga 900
aagacgaact actgcgaaag catttgccaa ggatgttttc attaatcaag aacgaaagtt 960
gggggctcga agacgattag ataccgtcgt agtctcaacc ataaacgatg ccgactaggg 1020
attggaggat gttcttttga tgacttctcc agcaccttat gagaaatcaa agtttttggg 1080
ttccgggggg agtatggtcg caaggctgaa acttaaagga attgacggaa gggcaccacc 1140
aggcgtggag cctgcggctt aatttgactc aacacgggaa aacttaccag gtccagacat 1200
agtgaggatt gacagattga gagctctttc ttgattctat gggtggtggt gcatggccgt 1260
tcttagttgg tgggttgcct tgtcaggttg attccggtaa cgaacgagac ctcagcctgc 1320
taaatagtca cgttcgcttt ttgcggatgg ccgacttctt agagggacta ttggcgttta 1380
gtcaatggaa gtatgaggca ataacaggtc tgtgatgc 1418