在此專利申請(qǐng)中的所有不同的參考文獻(xiàn)和公開(kāi)都在此合并到此專利申請(qǐng)中從而更全面描述此發(fā)明從屬的技術(shù)領(lǐng)域。

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明提供一優(yōu)化方法,使用保存在-150℃下的幼倉(cāng)鼠腎細(xì)胞BHK-21(克隆13)懸浮液大量培養(yǎng)所述細(xì)胞。本發(fā)明的目的是在生產(chǎn)口蹄病(Foot and Mouth Disease,FMD)和狂犬病抗原和疫苗的過(guò)程中使用大規(guī)模培養(yǎng)的細(xì)胞作為底物感染口蹄病病毒和狂犬病病毒。

背景技術(shù)：

按照目前全球人口不斷擴(kuò)大的速度，確保食品供應(yīng)的安全和可持續(xù)性是至關(guān)重要的。動(dòng)物保健行業(yè)是這個(gè)挑戰(zhàn)的關(guān)鍵角色，并致力于開(kāi)發(fā)先進(jìn)的解決方案以提供安全、可靠和可持續(xù)的糧食供應(yīng)。動(dòng)物健康產(chǎn)品有助于通過(guò)疾病預(yù)防、治療和控制方面改善和維護(hù)動(dòng)物的健康和福利。

動(dòng)物致病其中一個(gè)最重要的原因是受病毒感染。其中有些是傳染性非常高的疾病，并且對(duì)社會(huì)造成十分嚴(yán)重的經(jīng)濟(jì)損失及影響公眾的健康。

近年最新的病毒疫苗發(fā)展主要集中在兩個(gè)病毒：口蹄病和狂犬病。

口蹄病是一種急性的全身性病毒感染，主要影響供人食用的動(dòng)物，例如牛﹑綿羊﹑山羊﹑豬以及其它偶蹄類動(dòng)物。口蹄病的高度傳染性大大影響了畜牧業(yè)的生產(chǎn)力和經(jīng)濟(jì),因此即使其死亡率極低,口蹄病仍是畜牧業(yè)中最嚴(yán)重的疾病之一。

口蹄病在全球多個(gè)地方流行。世界動(dòng)物衛(wèi)生組織(OIE)定期發(fā)布口蹄病的分布和爆發(fā)圖。由于OIE對(duì)肉類貿(mào)易市場(chǎng)的限制,OIE頒報(bào)的衛(wèi)生狀況對(duì)于受口蹄病影響的國(guó)家產(chǎn)生深遠(yuǎn)的經(jīng)濟(jì)影響。

狂犬病已被世界公認(rèn)為是最危險(xiǎn)和最令人恐懼的人畜共患疾病之一?？袢〔《疽话阃ㄟ^(guò)咬傷經(jīng)由動(dòng)物唾液傳播，并導(dǎo)致神經(jīng)系統(tǒng)的急性感染，在大多數(shù)情況下會(huì)引致急性腦炎甚至死亡。所有哺乳動(dòng)物都很容易受到狂犬病病毒感染。

經(jīng)過(guò)不斷的努力開(kāi)發(fā),現(xiàn)時(shí)已不需依賴大規(guī)模地增殖病原體來(lái)獲取重組亞基疫苗,目前的疫苗都是源自經(jīng)滅活的病毒，并透過(guò)濃縮和提純這些病毒以達(dá)至一定的抗原質(zhì)量,以產(chǎn)生具保護(hù)性的免疫反應(yīng)。制造這些疫苗的廠房需符合OIE的NBS生物安全等級(jí)4的要求。估計(jì)每年全球生產(chǎn)的口蹄病疫苗數(shù)量為25至30億劑。

以滅活口蹄病病毒制備的疫苗通常用于根除口蹄病和在緊急的情況下使用，疫苗效果大大依賴于疫苗制劑的抗原有效載荷和病毒的完整性。

由于口蹄病和狂犬病對(duì)經(jīng)濟(jì)方面造成的損失以及狂犬病對(duì)公眾健康的深遠(yuǎn)影響，因此有足夠數(shù)量的高品質(zhì)疫苗可應(yīng)用于國(guó)家疫苗接種計(jì)劃是非常重要的。

生產(chǎn)病毒抗原需要感染大規(guī)模的哺乳動(dòng)物細(xì)胞，所以有效率地?cái)U(kuò)大培養(yǎng)細(xì)胞的規(guī)模作為底物受病毒感染是必不可少的。

哺乳動(dòng)物細(xì)胞通常在大規(guī)模生產(chǎn)過(guò)程中作為生物底物以制備生物分子。例如病毒疫苗、重組蛋白和激素是許多制藥和生物技術(shù)公司的業(yè)務(wù)運(yùn)營(yíng)中的關(guān)鍵產(chǎn)品。

抗原產(chǎn)量高度依賴于適當(dāng)?shù)募?xì)胞密度以確保足夠的生長(zhǎng)動(dòng)力和代謝性質(zhì)。因此，必須有一個(gè)優(yōu)化的細(xì)胞生長(zhǎng)系統(tǒng)。這樣的系統(tǒng)著重于細(xì)胞的類型、細(xì)胞培養(yǎng)基的成分、細(xì)胞生長(zhǎng)條件及其大規(guī)模培養(yǎng)的方案。

幼倉(cāng)鼠腎(Baby Hamster Kidney,BHK或BHK-21)細(xì)胞系于1961年3月建系(McPherson,et al.Polyoma transformation of hamster cell clones an investigation of genetic factors affecting cell competence.Virology:14,359-370,1961)。自發(fā)現(xiàn)以來(lái)，這是目前最常用作研究和繁殖多種病毒的細(xì)胞系。

雖然BHK-21細(xì)胞系(克隆13)屬于貼壁依賴型細(xì)胞系，但是該細(xì)胞系會(huì)適應(yīng)口蹄病病毒感染而非附著性生長(zhǎng)以維護(hù)細(xì)胞系(Capstick,et al.Growth of a cloned strain of hamster kidney cells in suspended culture and their susceptibility to the virus of foot-and-mouth disease.Nature:195:1163.1962)。這特征對(duì)于大規(guī)模生產(chǎn)病毒至關(guān)重要。

在培養(yǎng)哺乳動(dòng)物細(xì)胞的領(lǐng)域，其突破性發(fā)展來(lái)自改善細(xì)胞生長(zhǎng)的方法。目前有兩種大規(guī)模細(xì)胞生長(zhǎng)的系統(tǒng)正被不斷地改進(jìn)：微載體單層細(xì)胞培養(yǎng)和非附著性懸浮細(xì)胞培養(yǎng)。

現(xiàn)時(shí)細(xì)胞生長(zhǎng)系統(tǒng)通常使用微載體單層細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)。由于大多數(shù)哺乳動(dòng)物細(xì)胞不能懸浮培養(yǎng)，因此在一般情況下，先進(jìn)的細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)領(lǐng)域均使用該系統(tǒng)。

本發(fā)明開(kāi)發(fā)了使用含有動(dòng)物血清的培養(yǎng)基在懸浮液中大規(guī)模培養(yǎng)BHK-21細(xì)胞的方法。與微載體系統(tǒng)比較，懸浮細(xì)胞培養(yǎng)具有可以培養(yǎng)更高細(xì)胞濃度的優(yōu)勢(shì)。

最近的一項(xiàng)專利申請(qǐng)表明，BHK-21細(xì)胞在適當(dāng)?shù)募?xì)胞濃度可懸浮生長(zhǎng)(CN102154197)。

BHK-21細(xì)胞已經(jīng)被應(yīng)用于生產(chǎn)各種類型的病毒。例如,專利CN102793917描述了使用BHK-21細(xì)胞懸浮液生產(chǎn)豬乙型腦炎病毒。

目前，雖然有其他例子使用BHK-21細(xì)胞生產(chǎn)不同的病毒,但并沒(méi)有記載大規(guī)模培養(yǎng)BHK-21細(xì)胞(克隆13)的詳細(xì)程序。至于該細(xì)胞的工業(yè)用途,已發(fā)表的專利CN102108342僅提及按比例擴(kuò)大生產(chǎn)的可能性,但沒(méi)有具體描述所涉及的過(guò)程。

眾所周知,按比例擴(kuò)大細(xì)胞的培養(yǎng)規(guī)模并不容易。大規(guī)模培養(yǎng)與在實(shí)驗(yàn)室規(guī)模培養(yǎng)細(xì)胞的生物特性是不一樣的，并且在不同的細(xì)胞系之間是有變化的。由于擴(kuò)大生產(chǎn)規(guī)模的復(fù)雜性，因此需要在小規(guī)模的過(guò)程全面調(diào)整擴(kuò)大生產(chǎn)的設(shè)計(jì)過(guò)程。

現(xiàn)時(shí)開(kāi)發(fā)用于生產(chǎn)醫(yī)藥和生物技術(shù)產(chǎn)品的制造過(guò)程，必需嚴(yán)格遵循GMP標(biāo)準(zhǔn)。符合這些要求，可以確保所生產(chǎn)的產(chǎn)品均符合高標(biāo)準(zhǔn)的質(zhì)量和可靠性。

本發(fā)明首次開(kāi)發(fā)一個(gè)符合GMP標(biāo)準(zhǔn)并獲得工業(yè)產(chǎn)量的BHK-21細(xì)胞(克隆13)的程序。因此,需要在不同擴(kuò)大階段精確組合使用不同大小的生物反應(yīng)器。據(jù)估計(jì)，本發(fā)明至少可制備5700升的BHK細(xì)胞培養(yǎng)物。這個(gè)估計(jì)不限制本發(fā)明使用更多的生物反應(yīng)器以獲得更大產(chǎn)量的細(xì)胞培養(yǎng)物。

本發(fā)明的大規(guī)模生產(chǎn)程序，可應(yīng)用于其他與工業(yè)有關(guān)并可適應(yīng)于懸浮液中生長(zhǎng)的細(xì)胞系。

因此，本發(fā)明提供了詳細(xì)的程序，以解決在感染病毒過(guò)程使用大規(guī)模的細(xì)胞懸浮液的需求，從而生產(chǎn)在動(dòng)物和人類的疫苗中使用的各種病毒抗原。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

在一個(gè)實(shí)施例中，本發(fā)明提供一個(gè)大規(guī)模培養(yǎng)BHK-21細(xì)胞(克隆13)的詳細(xì)程序。所述方法從凍存在離心管的懸浮細(xì)胞開(kāi)始擴(kuò)大細(xì)胞產(chǎn)量。

在一個(gè)實(shí)施例中，本發(fā)明提供了一個(gè)可獲得足夠BHK細(xì)胞產(chǎn)量的方法，以提供生產(chǎn)口蹄疫和狂犬病疫苗的制造過(guò)程中所需要的細(xì)胞。所述方法可確保生產(chǎn)高濃度的細(xì)胞及提供可靠和可重復(fù)性的結(jié)果。

在一個(gè)實(shí)施例中，本發(fā)明提供的方法有一個(gè)執(zhí)行細(xì)胞沉淀的步驟，可以在擴(kuò)充生物反應(yīng)器的工序添加新的細(xì)胞培養(yǎng)基以增加細(xì)胞的生長(zhǎng)速率。

在一個(gè)實(shí)施例中，本發(fā)明提供了一個(gè)從凍存管的種子庫(kù)開(kāi)始擴(kuò)大懸液培養(yǎng)BHK-21細(xì)胞至工業(yè)規(guī)模并乎合GMP標(biāo)準(zhǔn)的方法。

在一個(gè)實(shí)施例中，本發(fā)明涉及擴(kuò)大規(guī)模培養(yǎng)BHK-21(克隆13)細(xì)胞及感染口蹄病病毒和狂犬病病毒，以作為生產(chǎn)病毒抗原過(guò)程的一部分。

在本申請(qǐng)中所描述的方法，詳細(xì)展示了該培養(yǎng)過(guò)程在大規(guī)模生產(chǎn)時(shí)，可以高度可重復(fù)、更高精度和可靠地獲得高產(chǎn)量的BHK-21(克隆13)細(xì)胞。因此，記錄擴(kuò)大生產(chǎn)過(guò)程中所測(cè)量的細(xì)胞濃度和pH值，可確保該過(guò)程的可靠性(圖3A及圖3B)。

本發(fā)明包括一個(gè)擴(kuò)大生產(chǎn)規(guī)模的配置，可確保該培養(yǎng)過(guò)程結(jié)束時(shí)有高濃度的細(xì)胞。高濃度的細(xì)胞可確保病毒的產(chǎn)量。此外，擴(kuò)大規(guī)模的策略在設(shè)計(jì)上可確保連續(xù)轉(zhuǎn)移細(xì)胞培養(yǎng)物至病毒感染區(qū)域，以生產(chǎn)抗原。

本發(fā)明的生產(chǎn)過(guò)程是根據(jù)GMP標(biāo)準(zhǔn)開(kāi)發(fā)的，以確保細(xì)胞的質(zhì)量和純度以及細(xì)胞培養(yǎng)過(guò)程的可重復(fù)性。在多數(shù)情況下，符合GMP標(biāo)準(zhǔn)是從所述生產(chǎn)過(guò)程導(dǎo)出產(chǎn)物的必要條件。

在一個(gè)實(shí)施例中，本發(fā)明的方法在轉(zhuǎn)移細(xì)胞至下一個(gè)生物反應(yīng)器前進(jìn)行沉淀的步驟。上述步驟可增加細(xì)胞的濃度、棄去耗盡營(yíng)養(yǎng)的培養(yǎng)基和增加下一步驟需要添加新的培養(yǎng)基的體積。添加新的培養(yǎng)基可促使細(xì)胞生長(zhǎng)得更快。

在一個(gè)實(shí)施例中，本發(fā)明擴(kuò)大生產(chǎn)規(guī)模的步驟所使用培養(yǎng)物體積和生物反應(yīng)器體積的比例為1:2。

本發(fā)明擴(kuò)大生產(chǎn)規(guī)模的步驟所使用的BHK種子細(xì)胞是屬于Biogénesis Bagó的財(cái)產(chǎn)，此外可以從主種子庫(kù)或任何工作種子庫(kù)獲得。

在一個(gè)實(shí)施例中，本發(fā)明擴(kuò)大生產(chǎn)的步驟使用配有葉輪機(jī)械攪拌的生物反應(yīng)器。所述生物反應(yīng)器配有一個(gè)或多個(gè)葉輪，而后者的優(yōu)點(diǎn)是增加細(xì)胞培養(yǎng)物的供氧量。該生物反應(yīng)器以批式過(guò)程運(yùn)作，不需連續(xù)添加培養(yǎng)基。

在一個(gè)實(shí)施例中，本發(fā)明涉及一種用于大規(guī)模培養(yǎng)BHK-21細(xì)胞的方法，包括:

a)解凍細(xì)胞的步驟；

b)在實(shí)驗(yàn)室規(guī)模大量培養(yǎng)的步驟；

c)在工業(yè)規(guī)模大量培養(yǎng)的步驟；以及

d)連續(xù)轉(zhuǎn)移細(xì)胞培養(yǎng)物至感染區(qū)域的步驟。

在一個(gè)實(shí)施例中，其中所述解凍步驟在室溫或在溫度最高至37℃下進(jìn)行。

在一個(gè)實(shí)施例中，其中所述在實(shí)驗(yàn)室規(guī)模大量培養(yǎng)的步驟使用2L滾瓶﹑2L燒瓶或5L至50L生物反應(yīng)器。

在一個(gè)實(shí)施例中，所述在工業(yè)規(guī)模大量培養(yǎng)的步驟使用50L至10,000L的生物反應(yīng)器。

在另一個(gè)實(shí)施例中，其中所述轉(zhuǎn)移細(xì)胞培養(yǎng)物至感染區(qū)域的步驟由一個(gè)或多個(gè)生物反應(yīng)器并聯(lián)使用，而其中所述在工業(yè)規(guī)模大量培養(yǎng)使用至少三個(gè)生物反應(yīng)器。

在一個(gè)實(shí)施例中，所述在工業(yè)規(guī)模大量培養(yǎng)的步驟包括在轉(zhuǎn)移至下一個(gè)反應(yīng)器前有細(xì)胞濃縮和沉淀的步驟。

在一個(gè)實(shí)施例中，所述連續(xù)轉(zhuǎn)移細(xì)胞培養(yǎng)物使用至少1000L的生物反應(yīng)器。

在一個(gè)實(shí)施例中，細(xì)胞生長(zhǎng)周期的濃度開(kāi)始是1.2×10⁶個(gè)細(xì)胞/毫升至最終濃度是2.41×10⁶個(gè)細(xì)胞/毫升。

在另一個(gè)實(shí)施例中，其中整個(gè)大規(guī)模培養(yǎng)BHK-21細(xì)胞過(guò)程的pH值保持在6.8至7.4。

在一個(gè)實(shí)施例中，本發(fā)明涉及一種用于工業(yè)規(guī)模大量培養(yǎng)BHK-21細(xì)胞的系統(tǒng)，其特征在于：

a)第一個(gè)生物反應(yīng)器的體積為50至80L并連接至第二個(gè)生物反應(yīng)器；

b)第二個(gè)生物反應(yīng)器的體積為200至500L并連接至第三個(gè)生物反應(yīng)器；

c)第三個(gè)生物反應(yīng)器的體積為600至1000L并連接至第四個(gè)生物反應(yīng)器；

d)第四個(gè)生物反應(yīng)器的體積為1100至2000L并連接至第五個(gè)生物反應(yīng)器；以及

e)第五個(gè)生物反應(yīng)器的體積為2100至10000L,所述第五個(gè)生物反應(yīng)器連接至感染

區(qū)域。

在一個(gè)實(shí)施例中，各個(gè)工業(yè)規(guī)模大量培養(yǎng)BHK-21細(xì)胞的生物反應(yīng)器具有輸送管道，所述輸送管道供給37℃的水、8℃的冷水、2-4℃的超冷水、自來(lái)水、無(wú)菌壓縮空氣、工業(yè)壓縮空氣、過(guò)濾蒸汽和天然氣。其中所述各個(gè)生物反應(yīng)器具有供給第三種生長(zhǎng)培養(yǎng)基的輸送管道。此外，所述各個(gè)生物反應(yīng)器具有連接到其他生物反應(yīng)器用以轉(zhuǎn)移細(xì)胞培養(yǎng)物的輸送管道。在另一個(gè)實(shí)施例中，所述各個(gè)生物反應(yīng)器具有監(jiān)控探頭和綜合控制系統(tǒng)用以控制溫度、攪拌、溶解氧、溶存二氧化碳、pH值和細(xì)胞密度

本發(fā)明分為以下四個(gè)階段:

第一階段:解凍BHK-21細(xì)胞

第二階段:在實(shí)驗(yàn)室規(guī)模大量培養(yǎng)BHK-21細(xì)胞

第三階段:在工業(yè)規(guī)模大量培養(yǎng)BHK-21細(xì)胞

第四階段:轉(zhuǎn)移細(xì)胞培養(yǎng)物至病毒感染區(qū)域

第一階段:解凍BHK-21細(xì)胞

本步驟逐步解凍從種子庫(kù)獲得的BHK-21細(xì)胞。首先，從冰箱取出冷凍瓶并放置在室溫下，直至完全解凍。迅速進(jìn)行細(xì)胞解凍以確保細(xì)胞的生存力是很重要的。在一個(gè)實(shí)施例中，可能增加在37℃培養(yǎng)的工序以加速解凍過(guò)程。這一步可以使解凍過(guò)程在幾分鐘內(nèi)完成。

第二階段:在實(shí)驗(yàn)室規(guī)模大量培養(yǎng)BHK-21細(xì)胞

本步驟使用2L滾瓶使BHK-21細(xì)胞均質(zhì)化及將其轉(zhuǎn)移到工業(yè)規(guī)模區(qū)域。解凍的細(xì)胞均質(zhì)化后，可以使用滾瓶、燒瓶或小型的生物反應(yīng)器在實(shí)驗(yàn)室開(kāi)始擴(kuò)大培養(yǎng)規(guī)模，以增加細(xì)胞的產(chǎn)量并轉(zhuǎn)移至工業(yè)規(guī)模區(qū)域。

在一個(gè)實(shí)施例中，細(xì)胞生長(zhǎng)從初始密度1.2×10⁶細(xì)胞/毫升至最終密度2.41×10⁶細(xì)胞/毫升中進(jìn)行培養(yǎng)(倍增時(shí)間約24小時(shí))。在一般情況下，最終的細(xì)胞數(shù)量為初始的兩倍。為了確定需要添加培養(yǎng)基的體積，細(xì)胞數(shù)量必須在培養(yǎng)步驟開(kāi)始前和結(jié)束后進(jìn)行計(jì)算。為了達(dá)到1.2×10⁶細(xì)胞/毫升的密度，需要添加相同體積的培養(yǎng)基。

如果細(xì)胞數(shù)量在24小時(shí)后不大于1.5×10⁶細(xì)胞/毫升，必須丟棄該批次。

第三階段:在工業(yè)規(guī)模大量培養(yǎng)BHK-21細(xì)胞

本步驟把細(xì)胞培養(yǎng)物從80L小型生物反應(yīng)器傳代至其他大于5000L的容器(5000L或更大)。

在一個(gè)實(shí)施例中，該過(guò)程有一個(gè)沉淀步驟，用以在轉(zhuǎn)移培養(yǎng)物到下一個(gè)生物反應(yīng)器之前，增加細(xì)胞的濃度。先讓細(xì)胞沉降至底部，然后棄去存在于上清液的介質(zhì)，所述介質(zhì)缺乏營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)并殘留影響細(xì)胞生長(zhǎng)的代謝物。

第四階段:轉(zhuǎn)移細(xì)胞至病毒感染區(qū)域

本步驟包括維持生物反應(yīng)器中大體積的BHK-21細(xì)胞培養(yǎng)物并轉(zhuǎn)移至口蹄疫病毒或狂犬病病毒的感染區(qū)域。

由于生產(chǎn)病毒抗原需要大量的細(xì)胞，所以必須有一個(gè)連續(xù)生產(chǎn)細(xì)胞培養(yǎng)物的系統(tǒng)以滿足這需求。本發(fā)明詳細(xì)說(shuō)明培養(yǎng)活細(xì)胞時(shí)每個(gè)批次的一致性并每日轉(zhuǎn)移培養(yǎng)物到病毒感染區(qū)域所應(yīng)用的程序。

供應(yīng)系統(tǒng)是基于一組由5000L的生物反應(yīng)器組成并可以轉(zhuǎn)移部分細(xì)胞培養(yǎng)物至感染區(qū)域。轉(zhuǎn)移后，已經(jīng)被轉(zhuǎn)移的體積會(huì)添加新鮮的培養(yǎng)基，以便開(kāi)始細(xì)胞生長(zhǎng)的新周期。在一般情況下，由于BHK-21細(xì)胞會(huì)在24小時(shí)內(nèi)倍增，每日需要添加的體積，是培養(yǎng)物總體積的一半并需要24小時(shí)以達(dá)至添加時(shí)間。因此，以新的生產(chǎn)批次更換舊的批次(最多可從工作種子傳代30代)，可以確?？乖a(chǎn)量全年穩(wěn)定。

在一個(gè)實(shí)施例中，待培養(yǎng)細(xì)胞的體積，取決于感染區(qū)域的需求，其所需體積為每日1000L至15000L。

在一個(gè)實(shí)施例中，可以完全使用胎牛血清、成年牛血清或兩者的組合以大規(guī)模培養(yǎng)BHK-21細(xì)胞。

在一個(gè)實(shí)施例中，可以使用一個(gè)或多個(gè)生物反應(yīng)器并聯(lián)的設(shè)計(jì)進(jìn)行擴(kuò)大培養(yǎng)規(guī)模的步驟。

在另一個(gè)實(shí)施例中，可以為其他可能會(huì)感染BHK細(xì)胞的病毒進(jìn)行擴(kuò)大培養(yǎng)規(guī)模的步驟。

在一個(gè)實(shí)施例中，可以按其他培養(yǎng)物體積和生物反應(yīng)器體積的比例，進(jìn)行擴(kuò)大培養(yǎng)規(guī)模的步驟。例如：1：3、1：4、1：5、1：6、1：7、1：8、1：9及1:10。

通過(guò)引用以下的實(shí)驗(yàn)細(xì)節(jié)，可以更好地理解本發(fā)明。然而，本領(lǐng)域技術(shù)人員應(yīng)理解所提供的實(shí)施例僅作為說(shuō)明作用，而非限制本發(fā)明的范圍。本發(fā)明的范圍將由隨后的權(quán)利要求所界定。

在本申請(qǐng)中的，引用了不同的參考文獻(xiàn)或出版物。這些參考或出版物的全文和公開(kāi)批露都結(jié)合到本申請(qǐng)中,從而更全面地描述本發(fā)明的情況。應(yīng)當(dāng)指出的是，過(guò)渡語(yǔ)“包含”與‘包括’﹑‘含有’或‘以…為特征’是同義的，是包括性或開(kāi)放式的，當(dāng)中并不排除有另外未列舉的元素或方法步驟。

附圖說(shuō)明

圖1所示的是在實(shí)驗(yàn)室擴(kuò)大生產(chǎn)規(guī)模的實(shí)施例。過(guò)程始于解凍保存BHK-21細(xì)胞的凍存管。在擴(kuò)大生產(chǎn)的過(guò)程中，使用了2L和5L的滾瓶。在無(wú)菌條件下，每24小時(shí)進(jìn)行一次傳代。

圖2A所示的是一個(gè)在實(shí)驗(yàn)室擴(kuò)大生產(chǎn)規(guī)模的進(jìn)度表的實(shí)施例。每24小時(shí)以分批操作的模式進(jìn)行一次傳代。當(dāng)達(dá)至適當(dāng)?shù)募?xì)胞密度時(shí)轉(zhuǎn)移培養(yǎng)物至另一個(gè)燒瓶。除了在50L生物反應(yīng)器使用了第二種生長(zhǎng)培養(yǎng)基，整個(gè)過(guò)程均使用第一種生長(zhǎng)培養(yǎng)基。(接種體積：Inoculum Volume,IV；培養(yǎng)基體積：Medium Volume,MV)

圖2B所示的是一個(gè)在工業(yè)規(guī)模擴(kuò)大生產(chǎn)的進(jìn)度表的實(shí)施例。每24小時(shí)在每一個(gè)生物反應(yīng)器進(jìn)行至少兩次傳代。轉(zhuǎn)移培養(yǎng)物前執(zhí)行16至20小時(shí)沉淀BHK-21細(xì)胞的步驟。(接種體積：Inoculum Volume,IV；培養(yǎng)基體積：Medium Volume,MV；轉(zhuǎn)移體積：Transfer Volume,TV)

圖3A所示的是在大規(guī)模生產(chǎn)BHK懸浮細(xì)胞的過(guò)程中監(jiān)測(cè)細(xì)胞密度和細(xì)胞培養(yǎng)物的體積。

圖3B所示的是在整個(gè)擴(kuò)大生產(chǎn)的過(guò)程中監(jiān)測(cè)細(xì)胞生長(zhǎng)體積和pH值。

具體實(shí)施方式

實(shí)施例1

大規(guī)模培養(yǎng)BHK-21細(xì)胞(克隆13)的步驟以制備口蹄病病毒

本實(shí)施例詳細(xì)描述獲得大量BHK-21細(xì)胞(克隆13)的步驟，以制備口蹄病病毒。

培養(yǎng)基：

第一種生長(zhǎng)培養(yǎng)基：

體積：1升

成分：GMEM(Glasgow Minimal Essential Medium)生長(zhǎng)培養(yǎng)基15.9克，碳酸氫鈉3.5克，慶大霉素0.1克，苯酚紅溶液0.1％，胎牛血清12％，注射用水(WFI)q.s.f 1L。

第二種生長(zhǎng)培養(yǎng)基：

體積：1升

成分：購(gòu)自Hyclone或Gibco的GMEM生長(zhǎng)培養(yǎng)基15.9克，碳酸氫鈉3.5克，慶大霉素0.1克，苯酚紅溶液0.1％，成年牛血清12％，注射用水(WFI)q.s.f 1L。

第三種生長(zhǎng)培養(yǎng)基：

體積：1升

成分：購(gòu)自Hyclone或Gibco的GMEM生長(zhǎng)培養(yǎng)基14.31克，碳酸氫鈉3.5克，慶大霉素0.05克，硫酸粘桿菌素0.004克，成年牛血清(聚乙二醇8％)10％，盤尼西林6％w/v，注射用水(WFI)q.s.f 1L。

胰蛋白酶溶液0.1％：

體積：1升

成分：氯化鈉8克，氯化鉀0.2克，胰蛋白酶1克，葡萄糖1克，乙二胺四乙酸二鈉0.2克，磷酸氫二鈉(無(wú)水)1.2克和磷酸二氫鉀，注射用水(WFI)q.s.f 1L。

第一階段：解凍BHK-21細(xì)胞

1)取出保存在-70℃含有3.5亳升BHK細(xì)胞的5亳升離心管，放置在室溫下，直到部分解凍。

2)在無(wú)菌條件下，小心重懸細(xì)胞并避免發(fā)泡。

3)將3.5毫升解凍的細(xì)胞轉(zhuǎn)移至含有300毫升第一種生長(zhǎng)培養(yǎng)基并預(yù)熱在37℃的2L滾瓶。

4)關(guān)閉容器的蓋子并用封口膜密封，以減少氣體交換。這樣可以盡量避免培養(yǎng)基的堿化。

5)在37℃轉(zhuǎn)動(dòng)滾瓶48小時(shí)以培養(yǎng)細(xì)胞。

6)棄去培養(yǎng)基，加入300毫升新鮮的第一種生長(zhǎng)培養(yǎng)基并在37℃轉(zhuǎn)動(dòng)滾瓶48小時(shí)以培養(yǎng)細(xì)胞。此時(shí)，應(yīng)該會(huì)注意到貼附在滾瓶?jī)?nèi)壁的細(xì)胞。在整個(gè)過(guò)程中，需要控制培養(yǎng)基的pH值以防止其酸化。

第二階段：在實(shí)驗(yàn)室規(guī)模大量培養(yǎng)BHK-21細(xì)胞

7)棄去全都培養(yǎng)基，加入在37℃預(yù)熱的50毫升無(wú)菌0.1％胰蛋白酶溶液，并確保溶液完全浸潤(rùn)貼附在滾瓶?jī)?nèi)壁的細(xì)胞以促進(jìn)細(xì)胞脫壁。

8)棄去胰蛋白酶溶液，加入在37℃預(yù)熱的300毫升新鮮的第一種生長(zhǎng)培養(yǎng)基使細(xì)胞重新懸浮。

9)轉(zhuǎn)移細(xì)胞懸液至一個(gè)2L燒瓶。

10)使用臺(tái)盼藍(lán)區(qū)分活細(xì)胞及死細(xì)胞并以紐鮑爾室(Neubauer chamber)計(jì)算細(xì)胞數(shù)量。

11)使用第一種生長(zhǎng)培養(yǎng)基稀釋獲得的細(xì)胞懸液至濃度1.2x 10⁶細(xì)胞/毫升。

12)將培養(yǎng)物置于37℃以磁力攪拌器以100-200RPM轉(zhuǎn)速混勻24小時(shí)。預(yù)期細(xì)胞濃度會(huì)倍增，而最終的數(shù)量為2.4×10⁶細(xì)胞/毫升。

13)轉(zhuǎn)移所有培養(yǎng)物至一個(gè)5L燒瓶，加入新鮮的第一種生長(zhǎng)培養(yǎng)基將體積調(diào)配至3L。

14)進(jìn)行步驟10的細(xì)胞計(jì)算，結(jié)果應(yīng)在0.7-1.3x 10⁶細(xì)胞/毫升之間。

15)將培養(yǎng)物置于37℃用磁力攪拌器以100-200RPM轉(zhuǎn)速混勻24小時(shí)。24小時(shí)后計(jì)算細(xì)胞的數(shù)量以確定結(jié)果大約為2.4×10⁶細(xì)胞/毫升。

16)將一半培養(yǎng)物轉(zhuǎn)移至另一個(gè)5L燒瓶，并加入相同體積的新鮮的第一種生長(zhǎng)培養(yǎng)基至每個(gè)瓶中(兩個(gè)瓶子)。

17)重復(fù)步驟15和16(四個(gè)瓶子)。

18)將培養(yǎng)物置于37℃以100-200RPM轉(zhuǎn)速混勻24小時(shí)。24小時(shí)后計(jì)算細(xì)胞的數(shù)量以確定結(jié)果大約為2.4×10⁶細(xì)胞/毫升。

19)匯集四個(gè)5L燒瓶的培養(yǎng)物(共12L)至一個(gè)50L小型生物反應(yīng)器。加入新鮮的第二種生長(zhǎng)培養(yǎng)基并積調(diào)配至22.5L。

20)將培養(yǎng)物置于小型生物反應(yīng)器在37℃下培養(yǎng)24小時(shí)，調(diào)節(jié)氧氣的含量以避免過(guò)多的發(fā)泡。24小時(shí)后計(jì)算細(xì)胞的數(shù)量以確定結(jié)果大約為2.4×10⁶細(xì)胞/毫升。

第三階段：在工業(yè)規(guī)模大量培養(yǎng)BHK-21細(xì)胞

21)將所有培養(yǎng)物(22.5L)轉(zhuǎn)移至一個(gè)80L工業(yè)生物反應(yīng)器。加入相同體積(22.5L)的新鮮的第三種生長(zhǎng)培養(yǎng)基。

22)將培養(yǎng)物置于37℃以100-200RPM轉(zhuǎn)速混勻24小時(shí)。24小時(shí)后計(jì)算細(xì)胞的數(shù)量以確定結(jié)果大約為2.4×10⁶細(xì)胞/毫升。

23)棄去大約15L培養(yǎng)基(保留15L)，然后加入30L新鮮的第三種生長(zhǎng)培養(yǎng)基。

24)將培養(yǎng)物置于小型生物反應(yīng)器在37℃下培養(yǎng)24小時(shí)，培養(yǎng)物以100-200RPM轉(zhuǎn)速在37℃下混勻24小時(shí)。24小時(shí)后計(jì)算細(xì)胞的數(shù)量以確定結(jié)果大約為2.4×10⁶細(xì)胞/毫升。

25)棄去一半培養(yǎng)基(30L)，然后加入30L新鮮的第三種生長(zhǎng)培養(yǎng)基。

26)將培養(yǎng)物置于37℃以100-200RPM轉(zhuǎn)速混勻24小時(shí)。24小時(shí)后計(jì)算細(xì)胞的數(shù)量以確定結(jié)果大約為2.4×10⁶細(xì)胞/毫升。

27)將所有培養(yǎng)物(60L)轉(zhuǎn)移至一個(gè)500L工業(yè)生物反應(yīng)器。加入50L的新鮮的第三種生長(zhǎng)培養(yǎng)基。最終體積為110L。

28)將培養(yǎng)物置于37℃以100-200RPM轉(zhuǎn)速混勻24小時(shí)。24小時(shí)后計(jì)算細(xì)胞的數(shù)量以確定結(jié)果大約為2.4×10⁶細(xì)胞/毫升。

29)棄去10L培養(yǎng)基，然后加入80L新鮮的第三種生長(zhǎng)培養(yǎng)基。最終體積為180L。

30)將培養(yǎng)物置于37℃以100-200RPM轉(zhuǎn)速混勻24小時(shí)。24小時(shí)后計(jì)算細(xì)胞的數(shù)量以確定結(jié)果大約為2.4×10⁶細(xì)胞/毫升。

31)棄去50L培養(yǎng)基，然后加入120L新鮮的第三種生長(zhǎng)培養(yǎng)基。最終體積為250L。

32)將培養(yǎng)物置于37℃以100-200RPM轉(zhuǎn)速混勻24小時(shí)。24小時(shí)后計(jì)算細(xì)胞的數(shù)量以確定結(jié)果大約為2.4×10⁶細(xì)胞/毫升。

33)棄去125L培養(yǎng)基，然后加入125L新鮮的第三種生長(zhǎng)培養(yǎng)基。最終體積為250L。

34)暫停攪拌并降溫至2至8℃。培養(yǎng)物沉淀16至20小時(shí)。

35)棄去培養(yǎng)物上清液，然后以30-40RPM轉(zhuǎn)速使細(xì)胞重新懸浮。

36)將所有已沉淀的培養(yǎng)物(50L)轉(zhuǎn)移至一個(gè)1000L工業(yè)生物反應(yīng)器。加入300L新鮮的第三種生長(zhǎng)培養(yǎng)基。

37)將培養(yǎng)物置于37℃以100-200RPM轉(zhuǎn)速混勻24小時(shí)。24小時(shí)后計(jì)算細(xì)胞的數(shù)量以確定結(jié)果大約為2.4×10⁶細(xì)胞/毫升。

38)加入150L新鮮的第三種生長(zhǎng)培養(yǎng)基(共500L)，并置于37℃以100-200RPM轉(zhuǎn)速混勻24小時(shí)。24小時(shí)后計(jì)算細(xì)胞的數(shù)量以確定結(jié)果大約為2.4×10⁶細(xì)胞/毫升。

39)加入400L新鮮的第三種生長(zhǎng)培養(yǎng)基(共900L)，并置于37℃以100-200RPM轉(zhuǎn)速混勻24小時(shí)。24小時(shí)后計(jì)算細(xì)胞的數(shù)量以確定結(jié)果大約為2.4×10⁶細(xì)胞/毫升。

40)棄去400L培養(yǎng)基，然后加入400L新鮮的第三種生長(zhǎng)培養(yǎng)基。最終體積為900L。

41)將培養(yǎng)物置于37℃以100-200RPM轉(zhuǎn)速混勻24小時(shí)。24小時(shí)后計(jì)算細(xì)胞的數(shù)量以確定結(jié)果大約為2.4×10⁶細(xì)胞/毫升。

42)暫停攪拌并降溫至2至8℃。培養(yǎng)物沉淀16至20小時(shí)。

43)棄去培養(yǎng)物上清液，然后以30-40RPM轉(zhuǎn)速使細(xì)胞重新懸浮。

44)將所有已沉淀的培養(yǎng)物(200L)轉(zhuǎn)移至一個(gè)2000L工業(yè)生物反應(yīng)器。加入1200L新鮮的第三種生長(zhǎng)培養(yǎng)基。最終體積為1400L。

45)將培養(yǎng)物置于37℃以100-200RPM轉(zhuǎn)速混勻24小時(shí)。24小時(shí)后計(jì)算細(xì)胞的數(shù)量以確定結(jié)果大約為2.4×10⁶細(xì)胞/毫升。

46)棄去400L培養(yǎng)基，然后加入800L新鮮的第三種生長(zhǎng)培養(yǎng)基(共1800L)。

47)將培養(yǎng)物置于37℃以100-200RPM轉(zhuǎn)速混勻24小時(shí)。24小時(shí)后計(jì)算細(xì)胞的數(shù)量以確定結(jié)果大約為2.4×10⁶細(xì)胞/毫升。

48)暫停攪拌并降溫至2至8℃。培養(yǎng)物沉淀16至20小時(shí)。

49)棄去培養(yǎng)物上清液，然后以30-40RPM轉(zhuǎn)速使細(xì)胞重新懸浮。

50)將所有已沉淀的培養(yǎng)物(300L)轉(zhuǎn)移至一個(gè)5000L工業(yè)生物反應(yīng)器。

第四階段：轉(zhuǎn)移大量的BHK-21細(xì)胞至病毒感染區(qū)域

51)加入2700L新鮮的第三種生長(zhǎng)培養(yǎng)基(共3000L)，并置于37℃以100-200RPM轉(zhuǎn)速混勻24小時(shí)。24小時(shí)后計(jì)算細(xì)胞的數(shù)量以確定結(jié)果大約為2.4×10⁶細(xì)胞/毫升。

52)棄去800L培養(yǎng)基，然后加入1600L新鮮的第三種生長(zhǎng)培養(yǎng)基。最終體積為3800L。

53)將培養(yǎng)物置于37℃以100-200RPM轉(zhuǎn)速混勻24小時(shí)。24小時(shí)后計(jì)算細(xì)胞的數(shù)量以確定結(jié)果大約為2.4×10⁶細(xì)胞/毫升。

54)棄去1800L培養(yǎng)基，然后加入1800L新鮮的第三種生長(zhǎng)培養(yǎng)基。最終體積為3800L。

55)將培養(yǎng)物置于37℃以100-200RPM轉(zhuǎn)速混勻24小時(shí)。24小時(shí)后計(jì)算細(xì)胞的數(shù)量以確定結(jié)果大約為2.4×10⁶細(xì)胞/毫升。

56)轉(zhuǎn)移1900L培養(yǎng)物至口蹄病病毒的感染區(qū)域

57)加入1900L新鮮的第三種生長(zhǎng)培養(yǎng)基。

58)將培養(yǎng)物置于37℃以100-200RPM轉(zhuǎn)速混勻24小時(shí)。24小時(shí)后計(jì)算細(xì)胞的 數(shù)量以確定結(jié)果大約為2.4×10⁶細(xì)胞/毫升。

59)重復(fù)步驟56、57和58并從解凍后至少傳代一次或直至細(xì)胞傳代次數(shù)超過(guò)七十多批次。

60)最后的批次不要加入新鮮的第三種生長(zhǎng)培養(yǎng)基。在2-8℃培養(yǎng)剩下的1900L培養(yǎng)基。

60)轉(zhuǎn)移剩下的1900L培養(yǎng)物至感染區(qū)域。

61)結(jié)束后清洗反應(yīng)器以開(kāi)始新的一個(gè)批次。