本發(fā)明涉及生物檢測領(lǐng)域。具體地說，本發(fā)明涉及畢赤酵母(PichiaPastoris)細胞DNA的檢測引物及方法。
背景技術(shù)：
：在現(xiàn)代，生物重組制品已廣泛應(yīng)用于醫(yī)藥健康領(lǐng)域，發(fā)揮著越來越重要的作用。這些生物制品包括重組蛋白藥物、基因重組疫苗、生物抗原抗體以及各種細胞因子等。重組生物制品的應(yīng)用與人類健康事業(yè)息息相關(guān)，國際上對其的質(zhì)量控制和安全性檢測都具有極其嚴格的要求。重組生物蛋白絕大多數(shù)由大規(guī)模的基因改造工程宿主細胞生產(chǎn)，細胞中復(fù)雜的非目標產(chǎn)物是終產(chǎn)物中主要的雜質(zhì)來源，直接影響生物制品的安全性。其中殘余的生物遺傳物質(zhì)DNA是一個非常重要的污染，因此，對它的檢測是重要的質(zhì)量控制環(huán)節(jié)。在重組生物蛋白制品中，殘余DNA多來源于培養(yǎng)的宿主細胞。這些宿主細胞多為原核細胞、外源哺乳動物細胞以及腫瘤來源細胞。理論上，存在于生物制品中的微量DNA雜質(zhì)，都有可能傳遞與腫瘤或病毒相關(guān)的基因，并導(dǎo)致癌變或其它病理變化。當一定量的殘留DNA與制品一同進入人體后，含有致癌基因的DNA片段就可能誘發(fā)腫瘤的產(chǎn)生；如果生物制品中含有某些可以整合病毒的DNA，則這種DNA通過表達后具備感染性，從而導(dǎo)致一系列的不良后果。在生產(chǎn)重組生物蛋白的宿主細胞中，畢赤酵母(PichiaPastoris)是重要的一類，其甲醇營養(yǎng)型酵母，能夠利用甲醇作為唯一碳源和能源。巴斯德畢赤酵母的生物學(xué)特點之一是，甲醇代謝所需的醇氧化酶被分選到過氧化物酶體中，形成區(qū)域化。以葡萄糖作碳源時，菌體中只有1個或很少幾個小的過氧化物酶體，而以甲醇作碳源時，過氧化物酶體幾乎占到整個細胞體積的80％，AOX增至細胞總蛋白的35％-40％。因此，當在AOX基因前利用同源重組方式插入外源蛋白基因時，可獲得大量表達。同時，根據(jù)甲醇酵母這種可以形成過氧化物酶體的特性，既可利用該系統(tǒng)表達一些毒性蛋白和易被降解的 酶類，也可用以研究細胞特異區(qū)域化的生物發(fā)生及其機制和功能，為高等動物類似的研究提供啟示。利用畢赤酵母表達外源性蛋白的優(yōu)點在于：(1)具有醇氧化酶AOX1基因啟動子，這是目前最強，調(diào)控機理最嚴格的啟動子之一；(2)表達效率高，其表達的外源蛋白可占總表達蛋白的90％以上，有利于目的蛋白的分離純化；(3)在簡單合成培養(yǎng)基中可實現(xiàn)高密度培養(yǎng)；(4)表達質(zhì)粒能在基因組的特定位點以單拷貝或多拷貝的形式穩(wěn)定整合；(5)由于該酵母可以以甲醇為唯一碳源和能源，而絕大多數(shù)微生物并不能以甲醇為碳源，可以減少污染。根據(jù)相關(guān)監(jiān)管機構(gòu)對來自畢赤酵母的生物制品，其宿主DNA的限量為10ng/劑。關(guān)于生物制品中宿主細胞殘余DNA的限量檢測，過去比較普遍的采用分子雜交的半定量方法。該方法基于傳統(tǒng)的分子基因雜交技術(shù)，需要的檢測條件相對簡單，檢測限在10pg左右基本能夠滿足一些疫苗和治療性生物制品的檢測需求。但由于該方法存在時間長、操作繁瑣、穩(wěn)定性、敏感性、特異性較差等缺點，已經(jīng)不能滿足日益嚴苛的檢測要求，在一些發(fā)達國家已經(jīng)淘汰。Taqman探針檢測屬于實時定量PCR技術(shù)，是一種快速的高通量檢測方法，它在PCR擴增過程中加入一個特異性的熒光探針，通過熒光信號的變化反映產(chǎn)物的增加情況，從而能夠定量分析樣本中的初始模板。近年來，由于Taqman探針技術(shù)在特異性、靈敏性、準確性方面的獨特優(yōu)勢，其在檢測基因突變、基因定量等疾病相關(guān)檢測領(lǐng)域得到廣泛的承認及應(yīng)用。然而，該方法仍然存在樣本需要預(yù)處理、各實驗室引物探針設(shè)計不同、沒有統(tǒng)一標準物質(zhì)等等問題，對以上問題仍需要進一步研究、解決。綜上所述，本領(lǐng)域急需檢測生物制品中畢赤酵母DNA的方法，該方法應(yīng)具備靈敏性、操作簡便、標準統(tǒng)一等優(yōu)點并且能區(qū)分畢赤酵母DNA與其它真核宿主細胞DNA，從而能用于生物制品質(zhì)量控制。技術(shù)實現(xiàn)要素：本發(fā)明的目的是提供一種高靈敏度，并能區(qū)分畢赤酵母DNA與其它真核宿主細胞DNA的檢測畢赤酵母細胞基因組DNA的引物對，以及包含所述引物對的檢測試劑或PCR試劑盒。本發(fā)明的另一目的是提供一種利用本發(fā)明提供的引物對或檢測試劑檢測畢赤酵母細胞基因組DNA的方法或PCR方法。在第一方面，本發(fā)明提供一種檢測畢赤酵母細胞基因組DNA的引物對，所述引物對包括正向引物和反向引物，其中所述正向引物結(jié)合于畢赤酵母細胞基因組DNA上SEQIDNO:1所示序列的第84-103位；其中的反向引物結(jié)合于SEQIDNO:1所示序列的第151-170位，并且所述引物對所擴增獲得的擴增產(chǎn)物的長度為80-90bp。在優(yōu)選的實施方式中，所述正向引物和反向引物的長度為18-22bp；優(yōu)選20bp。在優(yōu)選的實施方式中，所述正向引物和反向引物的Tm溫度為59-61℃，并且正向引物的Tm與反向引物的Tm的差值的絕對值≤2℃。在具體的實施方式中，所述引物對中，所述正向引物如SEQIDNO:2所示，所述反向引物如SEQIDNO:3所示，或者，所述正向引物如SEQIDNO:6所示，所述反向引物如SEQIDNO:7所示，或者，所述正向引物如SEQIDNO:10所示，所述反向引物如SEQIDNO:11所示，或者，所述正向引物如SEQIDNO:12所示，所述反向引物如SEQIDNO:13所示；優(yōu)選地，所述正向引物如SEQIDNO:2所示，所述反向引物如SEQIDNO:3所示。在第二方面，本發(fā)明提供一種檢測試劑，所述檢測試劑包含本發(fā)明第一方面所述的引物對。在具體的實施方式中，所述引物對中，所述正向引物如SEQIDNO:2所示，所述反向引物如SEQIDNO:3所示，或者，所述正向引物如SEQIDNO:6所示，所述反向引物如SEQIDNO:7所示，或者，所述正向引物如SEQIDNO:10所示，所述反向引物如SEQIDNO:11所示，或者，所述正向引物如SEQIDNO:12所示，所述反向引物如SEQIDNO:13所示；優(yōu)選地，所述正向引物如SEQIDNO:2所示，所述反向引物如SEQIDNO:3所示。在具體的實施方式中，所述檢測試劑還包含探針。在優(yōu)選的實施方式中，所述探針如SEQIDNO:8或SEQIDNO:4所示。在優(yōu)選的實施方式中，所述檢測試劑的檢測靈敏度為1fg/μl。在具體的實施方式中，所述檢測試劑包含的引物對中，所述正向引物如SEQIDNO:2所示，所述反向引物如SEQIDNO:3所示；而所述檢測試劑包含的探針如SEQIDNO:4所示。在第三方面，本發(fā)明提供一種檢測畢赤酵母細胞基因組DNA的方法，所述 方法包括：利用本發(fā)明第一方面所述的引物對或本發(fā)明第二方面所述的檢測試劑，對待測樣品進行PCR，并檢測PCR擴增產(chǎn)物。在第四方面，本發(fā)明提供一種PCR試劑盒，所述試劑盒中包括容器以及位于所述容器中的本發(fā)明第一方面所述的引物對。在優(yōu)選的實施方式中，所述正向引物和反向引物的長度為18-22bp；優(yōu)選20bp。在優(yōu)選的實施方式中，所述正向引物和反向引物的Tm溫度為59-61℃，并且正向引物的Tm與反向引物的Tm的差值的絕對值≤2℃。在優(yōu)選的實施方式中，所述引物對中，所述正向引物如SEQIDNO:2所示，所述反向引物如SEQIDNO:3所示，或者，所述正向引物如SEQIDNO:6所示，所述反向引物如SEQIDNO:7所示，或者，所述正向引物如SEQIDNO:10所示，所述反向引物如SEQIDNO:11所示，或者，所述正向引物如SEQIDNO:12所示，所述反向引物如SEQIDNO:13所示；優(yōu)選地，所述正向引物如SEQIDNO:2所示，所述反向引物如SEQIDNO:3所示。在優(yōu)選的實施方式中，所述試劑盒中還裝有探針。在優(yōu)選的實施方式中，所述探針如SEQIDNO:8或SEQIDNO:4所示。在優(yōu)選的實施方式中，所述引物對中的正向引物如SEQIDNO:2所示，反向引物如SEQIDNO:3所示；而所述探針如SEQIDNO:4所示。在優(yōu)選的實施方式中，所述試劑盒中還裝有標準品對照。在第五方面，本發(fā)明提供一種PCR方法，包括步驟：在一PCR檢測體系中，利用本發(fā)明第一方面所述的引物對擴增目標產(chǎn)物。在優(yōu)選的實施方式中，所述正向引物和反向引物的長度為18-22bp；優(yōu)選20bp。在優(yōu)選的實施方式中，所述正向引物和反向引物的Tm溫度為59-61℃，并且正向引物的Tm與反向引物的Tm的差值的絕對值≤2℃。在優(yōu)選的實施方式中，所述引物對中，所述正向引物如SEQIDNO:2所示，所述反向引物如SEQIDNO:3所示，或者，所述正向引物如SEQIDNO:6所示，所述反向引物如SEQIDNO:7所示，或者，所述正向引物如SEQIDNO:10所示，所述反向引物如SEQIDNO:11所示，或者，所述正向引物如SEQIDNO:12所示，所述反向引物如SEQIDNO:13所示；優(yōu)選地，所述正向引物如SEQIDNO:2所示， 所述反向引物如SEQIDNO:3所示。在優(yōu)選的實施方式中，所述PCR檢測體系還包括探針。在優(yōu)選的實施方式中，所述探針如SEQIDNO:8或SEQIDNO:4所示。在優(yōu)選的實施方式中，所述引物對中的正向引物如SEQIDNO:2所示，反向引物如SEQIDNO:3所示；而所述探針如SEQIDNO:4所示。在第六方面，本發(fā)明提供本發(fā)明第一方面所述的引物對或第二方面所述的檢測試劑的用途，用于檢測待測對象中是否存在畢赤酵母細胞DNA。在優(yōu)選的實施方式中，所述待測對象是重組蛋白制品。應(yīng)理解，在本發(fā)明范圍內(nèi)中，本發(fā)明的上述各技術(shù)特征和在下文(如實施例)中具體描述的各技術(shù)特征之間都可以互相組合，從而構(gòu)成新的或優(yōu)選的技術(shù)方案。限于篇幅，在此不再一一累述。附圖說明圖1顯示了本發(fā)明引物對與SEQIDNO:1所示畢赤酵母基因組DNA片段的結(jié)合位點。圖2顯示了參考品的擴增曲線，其中利用的引物對為126-84(圖1中的引物對9)，擴增曲線顯示出明顯的指數(shù)增長期。圖3顯示了參考品的擴增曲線，其中利用的引物對為126-94(圖1中的引物對10)，擴增曲線顯示出明顯的指數(shù)增長期。圖4顯示了參考品的擴增曲線，其中利用的引物對為126-101(其中，所述正向引物如SEQIDNO:10所示，所述反向引物如SEQIDNO:11所示)。圖5顯示了參考品的擴增曲線，其中利用的引物對為126-106(其中，所述正向引物如SEQIDNO:12所示，所述反向引物如SEQIDNO:13所示)。圖6顯示了參考品的擴增曲線，其中利用的引物對為126-87。圖7顯示了參考品的標準曲線，其中利用的引物對為126-87。圖8顯示了參考品的擴增曲線，其中利用的引物對為126-103。圖9顯示了參考品的標準曲線，其中利用的引物對為126-103。圖10顯示了以水作為對照的擴增曲線，其中利用的引物對為126-87。圖11顯示了以水作為對照的標準曲線，其中利用的引物對為126-87。圖12顯示了CHODNA干擾實驗的擴增曲線，其中利用的引物對為126-87。圖13顯示了CHODNA干擾實驗的標準曲線，其中利用的引物對為126-87。圖14顯示了VeroDNA干擾實驗的擴增曲線，其中利用的引物對為126-87。圖15顯示了VeroDNA干擾實驗的標準曲線，其中利用的引物對為126-87。圖16顯示了人DNA干擾實驗的擴增曲線，其中利用的引物對為126-87。圖17顯示了人DNA干擾實驗的標準曲線，其中利用的引物對為126-87。圖18顯示碎片化程度不同的DNA片段的電泳結(jié)果；其中，DNA分子量標準：由上至下依次為2000bp、1000bp、750bp、500bp、250bp、100bp；泳道1為未超聲樣本，泳道2為10s超聲樣本；泳道3為1min超聲樣本；泳道4為5min超聲樣本；泳道5為10min超聲樣本；泳道6為30min超聲樣本；泳道7為DNA標記。圖19顯示利用引物對126-87獲得的碎片化程度不同的DNA片段梯度稀釋的qPCR檢測結(jié)果。具體實施方式經(jīng)過深入而廣泛的研究，本發(fā)明人出乎意料地發(fā)現(xiàn)針對畢赤酵母細胞基因組DNA的SEQIDNO:1所示序列設(shè)計的引物，不僅能夠高度靈敏地檢測畢赤酵母細胞基因組DNA，還能區(qū)分其它真核細胞，例如CHO細胞、Vero細胞，特別是人的干擾性DNA；從而獲得兼具靈敏度和特異性的檢測畢赤酵母細胞基因組DNA的引物對以及檢測方法。本發(fā)明方法操作簡便快捷、特異性和靈敏性高。在此基礎(chǔ)上完成了本發(fā)明。本發(fā)明的引物對本文所用的術(shù)語“引物”具有本領(lǐng)域技術(shù)人員常規(guī)理解的意義。本發(fā)明的畢赤酵母細胞基因組DNA特異性引物不是針對外源基因本身或病毒載體本身設(shè)計，而是針對畢赤酵母細胞基因組DNA的SEQIDNO:1所示序列(ACTTATTGAAGCAAAAAGAGAACAGCTTCGTCTACTAATAAAAAGAGATTGCAGCACCTGAGTTTCGCGTATGGTCTCCCACTACACTACTCGGTCAGGCTCTTAGCAGCTTAACTACGGTTGATCGGACGGGAAACGGTGCTTTCTGCTAGATATGGCCGCAACCGAAAGAAAAGATCTGCAGTGGGTCATATGGTATGAATTATTTTGTTCAAGGACTTGACAATTAACCATGACTTTTGACTCTATAGGAAAGTAGTCTTTTAAGAACCGTAAAAGCTTAGTTCTTGACATTTCAG CATTGGTATGTCATTGCTTTAATGATAAGTTTTCAAGAGAGTAGAATCATCACATAAGTGAACATCTATGTAATCTTTGTCATTTCAAAATTAATAAGTTAAAGAGTACCATCTACTCGAAACTAAATTATGGAATACTGCAATTTTACTAGTATCTATAACAGGTTTTCCA)設(shè)計的。換言之，本發(fā)明的引物可以特異性結(jié)合于畢赤酵母細胞基因組DNA上的SEQIDNO:1所示序列。鑒于本發(fā)明的教導(dǎo)和本領(lǐng)域的公知常識，本領(lǐng)域技術(shù)人員應(yīng)該理解，針對SEQIDNO:1所示序列可以設(shè)計多種引物對。因此，本發(fā)明的引物對不限于實施例中具體得到的引物對。在具體的實施方式中，本發(fā)明的正向引物結(jié)合于畢赤酵母細胞基因組DNA上SEQIDNO:1所示序列的第84-103位；其中的反向引物結(jié)合于SEQIDNO:1所示序列的第151-170位，并且所述引物對所擴增獲得的擴增產(chǎn)物的長度為80-90bp。在優(yōu)選的實施方式中，所述正向引物和反向引物的長度為18-22bp；優(yōu)選20bp。在優(yōu)選的實施方式中，所述正向引物和反向引物的Tm溫度為59-61℃，并且正向引物的Tm與反向引物的Tm的差值的絕對值≤2℃。在具體的實施方式中，本發(fā)明的引物對為126-101(其中，所述正向引物如SEQIDNO:10所示，所述反向引物如SEQIDNO:11所示)，或126-106(其中，所述正向引物如SEQIDNO:12所示，所述反向引物如SEQIDNO:13所示)，目標序列為GAATAAAAAAAGATTGCAGCACCTGAGTTTCGCGTATGGTCTCCCACTACACTACTCGGTCAGGCTCTTAGCAGCTTAACTACGGTTGATCGGACGGGAAACGGTGCTTTCTGCTAGATATGGCCGCAACCGGAAGCTTT(SEQIDNO:14)。在優(yōu)選的實施方式中，本發(fā)明的引物對為126-87(其中，所述正向引物如SEQIDNO:2所示，所述反向引物如SEQIDNO:3所示)，或126-103(其中，所述正向引物如SEQIDNO:6所示，所述反向引物如SEQIDNO:7所示)；在更優(yōu)選的實施方式中，本發(fā)明的引物對是126-87。探針本文所用的術(shù)語“探針”具有本領(lǐng)域技術(shù)人員常規(guī)理解的意義，即，一小段單鏈DNA或者RNA片段，用于檢測與其互補的核酸序列。鑒于本發(fā)明的教導(dǎo)和本領(lǐng)域的公知常識，本領(lǐng)域技術(shù)人員應(yīng)該理解，在知曉引物對的前提下，本領(lǐng)域技術(shù)人員可以根據(jù)正向引物和反向引物結(jié)合位點之間的模板序列自主設(shè)計探針，并檢測該探針與引物對的技術(shù)效果。在具體的實施方式中，本領(lǐng)域普通技術(shù)人員可根據(jù)需要具體設(shè)計探針，所述探針可以處于液相中，也可以固定于固相上；可以在擴增前結(jié)合，也可以在擴增后結(jié)合。因此，本發(fā)明的探針并不限于實施例中具體公開的探針。本發(fā)明的引物對也不限于與實施例中具體公開的探針配對使用。在具體的實施方式中，本發(fā)明的探針為TPi-1(AGCAGCTTAACTACGGTTGATCGGAC；SEQIDNO:8)或TPi-2(TAACTACGGTTGATCGGACGGGAAA；SEQIDNO:4)。本發(fā)明的檢測試劑本發(fā)明還提供一種檢測畢赤酵母細胞基因組DNA的檢測試劑，所述檢測試劑包含本發(fā)明的引物對以及探針等實施PCR所需的其它成分，例如Taq酶、dNTP、Mg2+等等。在具體的實施方式中，本發(fā)明的檢測試劑包含的引物對為126-87或126-103，優(yōu)選地，所述引物對是126-87；包含的探針為TPi-1或TPi-2，優(yōu)選TPi-2。在具體的實施方式中，本發(fā)明檢測試劑的檢測靈敏度達到1fg/μL。在本發(fā)明的引物對或檢測試劑的基礎(chǔ)上，本發(fā)明進一步提供一種檢測畢赤酵母細胞基因組DNA的方法，所述方法包括：利用本發(fā)明的引物對或檢測試劑，對待測樣品進行PCR，并檢測PCR擴增產(chǎn)物。在本發(fā)明的引物對的基礎(chǔ)上，本發(fā)明還提供一種PCR試劑盒，所述試劑盒中包括容器以及位于所述容器中的上述本發(fā)明引物對。在具體的實施方式中，本發(fā)明的PCR試劑盒還裝有用于實施PCR的其它所需成分，例如探針，以及使用該試劑盒作PCR檢測的使用說明書。在優(yōu)選的實施方式中，所述試劑盒中還裝有標準品對照。在本發(fā)明的引物對的基礎(chǔ)上，本發(fā)明提供利用本發(fā)明的引物對擴增目標產(chǎn)物的PCR方法。本發(fā)明的優(yōu)點包括:1.本發(fā)明的引物對或檢測試劑能夠高度靈敏地檢測畢赤酵母細胞基因組DNA；2.本發(fā)明的引物對或檢測試劑能夠區(qū)分真核宿主細胞，例如CHO細胞、Vero細胞，特別是人類干擾性DNA；3.本發(fā)明的檢測方法操作簡便快捷、特異性和靈敏性高。下面結(jié)合具體實施例，進一步闡述本發(fā)明。應(yīng)理解，這些實施例僅用于說明本發(fā)明而不用于限制本發(fā)明的范圍。下列實施例中未注明具體條件的實驗方法，通常按照常規(guī)條件，例如Sambrook等人，分子克隆：實驗室手冊(ColdSpringHarborLaboratoryPress，2001)中所述的條件，或按照制造廠商所建議的條件。除非另外說明，否則百分比和份數(shù)按重量計算。材料與方法1.DNA檢測體系：2xTaqmanmix：含有Taq酶、dNTP、Mg2+、本發(fā)明引物及探針等成分。摻加標準品，陰性質(zhì)控，DNA稀釋液2.檢測儀器：ABI7500。3.檢測過程準備工作：將購買自中國科學(xué)院上海生命科學(xué)研究院的畢赤酵母用takara基因提取試劑盒提取，制成畢赤酵母基因組DNA(10ng/μL)做為參考品。用超純水將畢赤酵母基因組DNA參考品梯度稀釋成以下5個濃度梯度，分別為10pg/μL、1pg/μL、100fg/μL、10fg/μL、1fg/μL。NTC為無樣本陰性質(zhì)控(超純水)。檢測體系：20μLTaqmanmix+10μL樣品＝30μL檢測程序：實時熒光定量PCR反應(yīng)程序優(yōu)選為：95℃預(yù)變性10min；95℃15s，60℃1min，40個循環(huán)。實施例1.本發(fā)明引物對的設(shè)計及其靈敏度檢驗發(fā)明人根據(jù)SEQIDNO:1所示序列，設(shè)計了以下引物對和探針：正向引物pi-126-87F：ACACTACTCGGTCAGGCTCT(SEQIDNO:2)；反向引物pi-126-87R：TTTCGGTTGCGGCCATATCT(SEQIDNO:3)；探針TPi-2：TAACTACGGTTGATCGGACGGGAAA(SEQIDNO:4)；擴增片段：ACACTACTCGGTCAGGCTCTTAGCAGCTTAACTACGGTTGATCGGACGGGAAACGGTGCTTTCTGCTAGATATGGCCGCAACCGAAA(SEQIDNO:5)。發(fā)明人通過qPCR實驗檢驗了上述引物對的性能，其中，qPCR體系為：18.2μLmix+0.6μL正向引物+0.6μL反向引物+0.6μL探針+10μLPichiaDNA。DNA標準曲線為：10pg/μL、1pg/μL、100fg/μL、10fg/μL、1fg/μL、NTC。實驗結(jié)果如圖6和圖7所示。其中圖6是參考品擴增曲線，擴增曲線顯示出明顯的指數(shù)增長期。圖7是參考品標準曲線。由圖7可知，當參考品濃度為10pg/μL、1pg/μL、100fg/μL、10fg/μL、1fg/μL時，繪制得到的標準曲線斜率為-3.69，相關(guān)系數(shù)(R2)＝0.998，擴增效率為86.6％。標準曲線線性良好，檢測靈敏度可達到1fg/μl。實施例2.本發(fā)明引物對的設(shè)計及其靈敏度檢驗發(fā)明人根據(jù)SEQIDNO:1所示序列，設(shè)計了以下引物對和探針：正向引物pi-126-103F：GTTTCGCGTATGGTCTCCCA(SEQIDNO:6)；反向引物pi-126-103R：TTCGGTTGCGGCCATATCTA(SEQIDNO:7)；探針TPi-1：AGCAGCTTAACTACGGTTGATCGGAC(SEQIDNO:8)；擴增片段：GTTTCGCGTATGGTCTCCCACTACACTACTCGGTCAGGCTCTTAGCAGCTTAACTACGGTTGATCGGACGGGAAACGGTGCTTTCTGCTAGATATGGCCGCAACCGAA(SEQIDNO:9)。發(fā)明人通過qPCR實驗檢驗了上述引物對的性能，其中，qPCR體系為：18.2μLmix+0.6μL正向引物+0.6μL反向引物+0.6μL探針+10μLPichiaDNADNA標準曲線為：10pg/μL、1pg/μL、100fg/μL、10fg/μL、1fg/μL、NTC。實驗結(jié)果如圖8和圖9所示。其中圖8是參考品擴增曲線，擴增曲線顯示出明顯的指數(shù)增長期。圖9是參考品標準曲線。由圖9可知，當參考品濃度為10pg/μL、1pg/μL、100fg/μL、10fg/μL、1fg/μL時，繪制得到的標準曲線斜率為-3.59，相關(guān)系數(shù)(R2)＝0.996，擴增效率為89.9％。標準曲線線性良好，檢測靈敏度可達到1fg/μl。實施例3.本發(fā)明引物對的特異性檢驗抗干擾實驗：步驟：用DNA稀釋液將畢赤酵母DNA梯度稀釋成濃度為20pg/μL、2pg/μL、200fg/μL、20fg/μL、2fg/μL五個濃度梯度；將CHO/vero/人三種干擾DNA稀釋成濃度為2ng/μL。(CHODNA來源中國食品藥品檢定研究院；vero細胞來源中國食品藥品檢定研究院,用takara基因提取試劑盒提取；人非小細胞肺癌細胞HCC827來源中國科學(xué)院上海生命科學(xué)研究院,用takara基因提取試劑盒提取)qPCR體系：18.2μLmix+0.6μL正向引物+0.6μL反向引物+0.6μL探針+5μLH2O/CHO/Vero/人DNA+5μL畢赤酵母DNA實驗結(jié)果如下表所示：DNAR2slopeE畢赤酵母+H2O0.999-3.31100.5％畢赤酵母+CHO0.998-3.25103.1％畢赤酵母+Vero0.998-3.17106.8％畢赤酵母+人0.998-3.3897.6％實驗結(jié)果如圖10～圖17所示。從產(chǎn)生的曲線可以看出，CHO/人/畢赤酵母DNA污染對本發(fā)明的引物對(126-87)的檢測結(jié)果明顯沒有造成影響。該引物對具備優(yōu)異的特異性。實施例4.超聲破碎實驗DNA碎片化實驗步驟：1.取100ng/μL的畢赤酵母gDNA20μL放入干凈的PCR管，共準備6管。1管作為對照，余下5管分別在超聲清洗機(SPEC-DW-12028B型超聲清洗機1200W)中進行10s、1min、5min、10min、30min不同時長的超聲破碎，獲得一系列碎片化程度不同的DNA片段。2.取這一系列碎片化程度不同的DNA片段5μL，進行2％瓊脂糖凝膠電泳。3.將這一系列碎片化程度不同的DNA片段分別進行梯度稀釋，取10pg/μL、1pg/μL、100fg/μL、10fg/μL、1fg/μL，利用的引物對126-87進行qPCR檢測。結(jié)果如圖18-19所示，證明顯示DNA的破碎化不會對檢測結(jié)果造成負面影響。在本發(fā)明提及的所有文獻都在本申請中引用作為參考，就如同每一篇文獻被單獨引用作為參考那樣。此外應(yīng)理解，在閱讀了本發(fā)明的上述講授內(nèi)容之后，本領(lǐng)域技術(shù)人員可以對本發(fā)明作各種改動或修改，這些等價形式同樣落于本申請所附權(quán)利要求書所限定的范圍。當前第1頁1 2 3