本發(fā)明屬于生物醫(yī)藥領(lǐng)域，具體涉及到一種含硒的與谷氨酰胺酶變構(gòu)位點相結(jié)合的抑制劑和/或谷氨酸脫氫酶抑制劑化合物，包括該新型硒類谷氨酰酶抑制劑對腫瘤(特別是泌尿系統(tǒng)癌)的高抑制活性用途。

背景技術(shù)：

腫瘤細胞基因突變，可造成葡萄糖有氧糖代謝途徑的明顯改變，即Warburg效應(yīng)：葡萄糖代謝增加200倍，但產(chǎn)物乳酸被排出體外，不能進入線粒體三羧酸循環(huán)，則谷氨酰胺成為腫瘤細胞線粒體產(chǎn)生能量所依賴的原料，而谷氨酰胺酶是谷氨酰胺進入線粒體三羧酸循環(huán)必不可少的酶。谷氨酰胺缺乏或谷氨酰胺酶的抑制均能抑制腫瘤細胞的生長。硒對抑制腫瘤的發(fā)展有積極的作用,并通過多種機制產(chǎn)生抗癌作用。依布硒啉(ebselen)是谷光甘肽過氧化物酶(GPx)最好的抑制劑，曾經(jīng)報道它也是谷氨酰胺酶抑制劑(IC₅₀9nM),但抑制細胞活性很弱(20μM)。

技術(shù)實現(xiàn)要素：

在懷疑依布硒啉(ebselen)并非通過特異性的結(jié)合來抑制谷氨酰胺酶的基礎(chǔ)上，而且我們通過分子互作研究表明，依布硒啉對谷氨酰胺酶并無很好的結(jié)合力，利用分子互作儀的檢測，10μM依布硒啉(ebselen)并不能直接與谷氨酰胺酶結(jié)合。因此根據(jù)谷氨酰胺酶的變構(gòu)位點的晶體結(jié)構(gòu)，我們設(shè)計合成了一系列的新的對稱和不對稱的ebselen衍生物,含6個原子或含硫醚的長鏈和各類取代苯環(huán)，可有效結(jié)合谷氨酰胺酶的變構(gòu)位點。實驗結(jié)果表明這些化合物可直接結(jié)合谷氨酰胺酶，并對腫瘤細胞(T24)的活性比依布硒啉(ebselen)增加了100倍。并且谷氨酰胺酶的變構(gòu)位點的抑制劑具有很好的選擇性，對腫瘤細胞的活性增加(<100nM)，對正常細胞沒有損傷(>10uM)。在免疫缺陷小鼠動物模型上也有顯著活性，并且沒有毒性。對于各類谷氨酰胺依賴的癌細胞(80-90％)，特別是泌尿系統(tǒng)腫瘤有很好的抑制活性。GAC四聚體和BPTES結(jié)合圖見附圖1.

同時根據(jù)谷氨酰胺酶和BPTES化合物的晶體結(jié)構(gòu)，我們對依布硒啉(ebselen)分子的苯環(huán)進行了修飾，增加或減少化合物的氧化還原活性、優(yōu)化化合物的藥學性質(zhì)、谷氨酰胺酶變構(gòu)位點的結(jié)合力、及化合物的抗腫瘤活性。谷氨酰酶代 謝谷氨酰胺(Gln)為腫瘤細胞快速合成蛋白質(zhì)/脂類/核酸提供重要原料,并維持氧化還原狀態(tài),通過線粒體的三羧酸循環(huán)為細胞提供能量ATP，使許多腫瘤細胞的生長依賴于谷氨酰胺；因此谷氨酰胺酶抑制劑預(yù)測可以抑制腫瘤生長，依布硒啉(ebselen)是谷光甘肽過氧化物酶(GPx)最好的抑制劑，曾有報道依布硒啉(ebselen)對其它多種酶也有抑制作用，因此懷疑依布硒啉(ebselen)是通過硒氧化還原反應(yīng)對多種酶進行抑制，故缺少專一性，細胞活性小。

本發(fā)明發(fā)現(xiàn)了具有靶向性的高效低毒治療癌癥新藥化合物，許多腫瘤細胞的生長依賴于谷氨酰胺在線粒體中的代謝，因此谷氨酰胺酶抑制劑預(yù)測可以抑制腫瘤生長，對正常細胞毒性會比較小；同時根據(jù)谷氨酰胺酶和BPTES化合物的晶體結(jié)構(gòu)，我們對依布硒啉(ebselen)分子進行了修飾，增加6個碳的長鏈(或含硫醚長鏈)以便與谷氨酰胺酶變構(gòu)位點結(jié)合、同時對苯環(huán)增加吸電子基團或給電子基團以增加或減少化合物的氧化還原活性、優(yōu)化化合物的藥學性質(zhì)、谷氨酰胺酶結(jié)合力、及化合物的抗腫瘤活性。設(shè)計合成的化合物具有靶向性，抑制線粒體功能，阻斷腫瘤能量代謝，活性比依布硒啉(ebselen)增加了100倍，對谷氨酰胺依賴的腫瘤抑制能力非常強，可用于泌尿系統(tǒng)腫瘤的治療或手術(shù)后的預(yù)防。

該發(fā)明具體包括如下內(nèi)容：

一種含硒的與谷氨酰胺酶變構(gòu)位點相結(jié)合的抑制劑和/或谷氨酸脫氫酶抑制劑化合物，其特征在于：該化合物的結(jié)構(gòu)式為

或者：

或者：

或者：

其中R₁、R₂、R₃、R₄、R₅、R₆、R₇、R₈、R₉、R₁₀分別代表一個獨立的取代基包含1～20個選自C、H、N、O、S、P、Si和鹵素原子的原子。

優(yōu)選地，所述的含硒的與谷氨酰胺酶變構(gòu)位點相結(jié)合的抑制劑和/或谷氨酸脫氫酶抑制劑化合物中所述的R₁、R₂、R₃、R₄不同時為H原子，所述的R₅、R₆、R₇、R₈不同時為H原子。

優(yōu)選地，所述的含硒的與谷氨酰胺酶變構(gòu)位點相結(jié)合的抑制劑和/或谷氨酸脫氫酶抑制劑化合物中所述的R₁、R₂、R₃、R₄、R₅、R₆、R₇、R₈為分別代表的獨立的取代基包括芳香類雜環(huán)，取代烷基，酰胺，醚，脂類，鹵素，硅烷類，硫醚，胺類，磷酸基團，亞砜類，磺?；?/p>

優(yōu)選地，所述的含硒的與谷氨酰胺酶變構(gòu)位點相結(jié)合的抑制劑和/或谷氨酸脫氫酶抑制劑化合物，其特征在于：所述的R₉為H原子，所述的R₁₀為取代基包含1～20個選自C、H、N、O、S、P、Si和鹵素原子的原子。

優(yōu)選地，所述的含硒的與谷氨酰胺酶變構(gòu)位點相結(jié)合的抑制劑和/或谷氨酸脫氫酶抑制劑化合物，其特征在于：所述的化合物結(jié)構(gòu)式為：所述的R₉為H原子，所述的R₁₀包括芳香類雜環(huán)，取代烷基，酰胺，醚，脂類，鹵素，硅烷類，硫醚，胺類，磷酸基團，亞砜類，磺酰基及其相關(guān)衍生物。

優(yōu)選地，所述的含硒的與谷氨酰胺酶變構(gòu)位點相結(jié)合的抑制劑和/或谷氨酸脫氫酶抑制劑化合物包括：

所述的R取代基包括芳香類雜環(huán)，取代烷基，酰胺，醚，脂類，鹵素，硅烷 類，硫醚，胺類，磷酸基團，亞砜類，磺?；?/p>

本發(fā)明還包括一種藥物組合物，包括上述的任一化合物及其藥物活性上可接受的鹽的化合物的藥物組合物。

本發(fā)明包括上述任一所述的化合物的藥物組合物在對谷氨酰胺代謝有依賴性的癌癥治療中的用途，所述的癌癥包括肺癌、膀胱癌、前列腺癌以及皮膚癌。

本發(fā)明提供了一類具有靶向性的高效低毒治療癌癥新藥藥物，根據(jù)谷氨酰胺酶和BPTES化合物的晶體結(jié)構(gòu)，對依布硒啉(ebselen)分子進行了修飾，增加6個碳的長鏈以便與谷氨酰胺酶變構(gòu)位點結(jié)合、同時對苯環(huán)增加吸電子基團或給電子基團以增加或減少化合物的氧化還原活性、優(yōu)化化合物的藥學性質(zhì)、谷氨酰胺酶結(jié)合力、及化合物的抗腫瘤活性。設(shè)計合成的化合物具有靶向性，抑制線粒體功能，阻斷腫瘤能量代謝，活性比依布硒啉(ebselen)增加了100倍，對谷氨酰胺依賴的腫瘤抑制能力非常強，可用于泌尿系統(tǒng)腫瘤以及肺癌、皮膚癌的治療或手術(shù)后的預(yù)防。

說明書附圖

圖1、GAC四聚體和BPTES結(jié)合圖；

圖2、己烷-(3，3'-二甲基)硒啉(200nM,200nM,500nM)與固定在芯片上的KGA的結(jié)合效果示意圖；

圖3、依布硒啉(500nM,1000nM)與固定在芯片上的KGA結(jié)合效果示意圖；

圖4、化合物中間碳鏈長對細胞性的影響；

圖5、動物皮下瘤模型：化合物對A549腫瘤細胞抑制效果圖；

圖6、動物皮下瘤模型：化合物對T24腫瘤細胞抑制效果圖。

附圖標號說明：1、底物結(jié)合的活性位點；2、BPTES結(jié)合的變構(gòu)位點。

具體實施方式

下面結(jié)合實施例對本發(fā)明做進一步的詳細說明，以下實施例是對本發(fā)明的解釋而本發(fā)明并不局限于以下實施例。

實施例

一、對稱硒啉的合成

在50mL的燒瓶中加入1,6-己二胺或者其他相應(yīng)的二胺化合物，再加入二氯 甲烷和TEA，攪拌冰浴條件下加入溶于二氯甲烷的2-氯羰基3-甲基苯基亞硒酸鹽2-(chlorocarbonyl)3-methylphenyl hypochloroselenoite，或其它苯環(huán)取代的2-氯羰基苯基亞硒酸鹽。滴加完畢后撤去冰浴攪拌過夜。

后處理：抽濾得到白色固體，加水和甲醇攪拌1小時。抽濾，50℃烘箱烘干。

MS(ESI):529，100％:M+Na；LC:XDB-C18 4.6mm×5μm，甲醇：水＝60:40，V＝1mL/min，λ＝254nm；¹H NMR(500MHz,DMSO)δ7.80(dd,J＝7.7,0.8Hz,1H),7.63–7.57(m,1H),7.45–7.39(m,1H),3.71(t,J＝7.1Hz,2H),2.5(s,3H),1.70–1.57(m,2H),1.35(t,J＝6.8Hz,2H).

己烷-(2，2’-二氟代)硒啉

MS(ESI):537，100％:M+Na；LC:XDB-C18 4.6mm×5μm，甲醇：水＝60:40，V＝1mL/min，λ＝254nm；¹H NMR(500MHz,DMSO)δ7.80(dd,J＝7.7,0.8Hz,1H),7.63–7.57(m,1H),7.45–7.39(m,1H),3.71(t,J＝7.1Hz,2H),1.70–1.57(m,2H),1.35(t,J＝6.8Hz,2H).

二、不對稱硒啉的合成

在50mL的燒瓶中加入BOC保護的1,6-己二胺或者其他取代保護相應(yīng)的二胺化合物，再加入二氯甲烷和TEA，攪拌冰浴條件下加入溶于二氯甲烷的2-氯羰基苯基亞硒酸鹽或其它苯環(huán)取代的2-氯羰基苯基亞硒酸鹽。滴加完畢后撤去冰浴攪拌過夜。抽濾得到白色固體，純化。

己烷-(2’-氟代)硒啉

MS(ESI):519.3，100％:M+Na；LC:XDB-C18 4.6mm×5μm，甲醇：水＝60:40，V＝1mL/min，λ＝254nm；m.p.205.4～206.9℃；¹H NMR(500MHz,DMSO)δ8.04(d,J＝8.0Hz,1H),7.80(dd,J＝7.7,0.8Hz,2H),7.63–7.57(m,2H),7.45–7.39(m,2H),3.71(t,J＝7.1Hz,4H),1.70–1.57(m,4H),1.35(t,J＝6.8Hz,4H).

苯基乙酰氨基,[1,3,4]-噻二唑-戊基硒啉

N-{5-[5-(3-Oxo-3H-benzo[d]isoselenazol-2-yl)-pentyl]-[1,3,4]thiadiaz ol-2-yl}-2-phenyl-acetamide

MS(ESI):487.3,100％:M+H；¹H NMR(400MHz,CDCl₃)δ7.99(d,J＝7.7Hz,1H),7.60–7.50(m,2H),7.40(dd,J＝13.7,7.4Hz,3H),7.29–7.23(m,4H),4.02(s,2H),3.82(t,J＝6.9Hz,2H),3.01(t,J＝7.3Hz,2H),1.89–1.81(m,2H),1.78–1.70(m,2H),1.50(dd,J＝14.8,7.6Hz,2H).

苯基乙酰氨基,[1,3,4]-噻二唑-戊基-[3’-甲基]-硒啉

MS(ESI):500.2,100％:M+H；¹H NMR(400MHz,CDCl₃)δ7.60–7.50(m,2H),7.40(dd,J＝13.7,7.4Hz,3H),7.29–7.23(m,4H),4.02(s,2H),3.82(t,J＝6.9Hz,2H),3.01(t,J＝7.3Hz,2H),2.48(s,3H),1.89–1.81(m,2H),1.78–1.70(m,2H),1.50(dd,J＝14.8,7.6Hz,2H).

苯基乙酰氨基,[1,3,4]-噻二唑-戊基-[2’-氟代]-硒啉

MS(ESI):504,100％:M+H；¹H NMR(400MHz,CDCl₃)δ7.60–7.50(m,2H),7.40(dd,J＝13.7,7.4Hz,3H),7.29–7.23(m,4H),4.02(s,2H),3.82(t,J＝6.9Hz,2H),3.01(t,J＝7.3Hz,2H),1.89–1.81(m,2H),1.78–1.70(m,2H),1.50(dd,J＝14.8,7.6Hz,2H).

二硒啉丙基硫醚

MS(ESI):533.3，100％:M+Na；LC:XDB-C184.6mm×5μm，甲醇：水＝60:40，V＝1mL/min，λ＝254nm；m.p.205.4～206.9℃；¹H NMR(500MHz,DMSO)δ8.04(d,J＝8.0Hz,1H),7.80(dd,J＝7.7,0.8Hz,1H),7.63–7.57(m,1H),7.45–7.39(m,1H),3.71(t,J＝7.1Hz,2H),2.77(t,J＝6.8Hz,2H),1.70–1.57(m,2H).

(3)分子互作儀檢測化合物與谷氨酰胺酶的結(jié)合:KGA酶固定在ForteBio的芯片上，注射化合物溶液(0-1000nM)，觀察化合物與酶的結(jié)合，己烷-(3，3'-二甲基)硒啉有結(jié)合，但依布硒啉沒有結(jié)合(具體效果圖見圖2、圖3)。

(4)抑制腫瘤細胞生長：各類腫瘤細胞(1000個每孔)加化合物生長3天后，加細胞生長檢測試劑(WST8)，檢測細胞活性。

中間鏈長對細胞性的影響以6個碳為最佳(IC₅₀100-200nM)

新化合物活性與母核比較

部分新化合物對膀胱癌細胞株的抑制能力

(4)動物皮下瘤模型：A549腫瘤細胞(1,000,000)接種于裸鼠中，第24-27天腫瘤大小為10mmx10mm，然后每只每天腫瘤附近皮下注射200ul化合物(己烷-(3，3'-二甲基)硒啉)PBS溶液,藥量1.0mg/kg。7天后切除腫瘤(n＝3)。

動物皮下瘤模型：T24腫瘤細胞(1,000,000)接種于裸鼠中，第24-27天腫瘤大小為10mmx10mm，然后每只每天腫瘤附近皮下注射200ul化合物(己烷-(3，3'-二甲基)硒啉)PBS溶液,藥量1.0mg/kg。7天后切除腫瘤(n＝6)。

此外，需要說明的是，本說明書中所描述的具體實施例，其相關(guān)化合物的名稱等可以不同，凡依本發(fā)明專利構(gòu)思所述的原理所做的等效或簡單變化，均包括于本發(fā)明專利的保護范圍內(nèi)。本發(fā)明所屬技術(shù)領(lǐng)域的技術(shù)人員可以對所描述的具體實施例做各種各樣的修改或補充或采用類似的方式替代，只要不偏離本發(fā)明的結(jié)構(gòu)或者超越本權(quán)利要求書所定義的范圍，均應(yīng)屬于本發(fā)明的保護范圍。