本技術(shù)涉及重組豬圓環(huán)病毒2型(PCV2)毒株的構(gòu)建方法及其鑒定，屬于農(nóng)業(yè)生物
技術(shù)領(lǐng)域：
，具體為重組豬圓環(huán)病毒2型毒株領(lǐng)域。
背景技術(shù)：
：豬圓環(huán)病毒2型(PCV2)是引起斷奶仔豬多系統(tǒng)衰竭綜合征(Postweaningmultisystemicwastingsyndrome，PMWS)的主要病原。PMWS在臨床上以斷奶仔豬呼吸急促、腹瀉、貧血、間質(zhì)性肺炎和進(jìn)行性消瘦以及明顯的淋巴結(jié)病變?yōu)橹饕卣?。PCV2主要侵害仔豬和育肥豬，與此病毒相關(guān)的疾病還有：新生仔豬的先天性震顫(CT)、新生仔豬腹瀉病、增生性壞死性肺炎(PNP)、育肥豬皮炎與腎炎綜合征(PDNS)、呼吸道疾病綜合征(PRDS)。此外，還可導(dǎo)致懷孕母豬繁殖障礙，嚴(yán)重影響母豬的生產(chǎn)性能。目前，此病已在世界范圍內(nèi)廣泛蔓延，給世界養(yǎng)豬業(yè)帶來(lái)了無(wú)法估量的經(jīng)濟(jì)損失。我國(guó)PCV2的感染形勢(shì)亦相當(dāng)嚴(yán)峻。因此，研制PCV2的診斷試劑和疫苗已成當(dāng)務(wù)之急。因而開(kāi)展PCV2感染性分子克隆的研究對(duì)該病毒致病機(jī)理以及增殖特性相關(guān)方面的研究具有重要的意義，以期為進(jìn)一步深入研究豬圓環(huán)病毒病疫苗，為深入研究PCV2與宿主相互作用的分子機(jī)制以及病毒的分子流行病學(xué)研究奠定了基礎(chǔ)。構(gòu)建PCV2感染性分子克隆目前主要有兩種方法。FenauxM，HalburPG，HaqshenasG，etal.ClonedgenomicDNAoftype2porcinecircovirusisinfectiouswheninjecteddirectlyintotheliverandlymphnodesofpigs：characterizationofclinicaldisease，virusdiribution，andpathologiclesions[J].JVirol，2002，76(2)：541-551.FenauxM，OpriessnigT，HalburPG，etal.ImmunogenicityandpathogenicityofchimericinfectiousDNAclonesofpathogenicporcinecircovirustype2(PCV2)andnonpathogenicPCV1inweanlingpigs[J].JVirol，2003，77(20)：11232-11243一種是將病毒基因組克隆到質(zhì)粒上，回收基因組全長(zhǎng)片段后利用T4DNA連接酶連接過(guò)夜進(jìn)行體外自身環(huán)化從而模擬天然病毒的基因結(jié)構(gòu)，轉(zhuǎn)染細(xì)胞獲得病毒。另一種是構(gòu)建包含首尾相連的雙拷貝病毒基因的重組質(zhì)粒，經(jīng)轉(zhuǎn)染細(xì)胞獲得感染性病毒。在第二種方法中又有兩種策略，一是先將病毒基因在體外串連成二聚體再克隆入載體。另一種是先將單拷貝病毒基因克隆入載體，再通過(guò)完全酶切得到片段，通過(guò)不完全酶切得到含單拷貝病毒基因的線性化的重組質(zhì)粒，然后將片段和線性化的載體連接得到感染性分子克隆。研究表明，上述兩種方法均能得到感染性病毒，但相比之下后者可操作性強(qiáng)、重復(fù)性好。PCV2串聯(lián)雙拷貝感染性克隆最初由國(guó)外學(xué)者Fenaux成功構(gòu)建。在Fenaux的這項(xiàng)研究中，巧妙地利用了PCV2基因組內(nèi)部單一存在且較為保守的酶切位點(diǎn)SacII，將兩個(gè)拷貝PCV2全基因組以首尾串聯(lián)的方式插入到pBluescriptSK載體的多克隆位點(diǎn)中，隨后將構(gòu)建好的雙拷貝克隆接種SPF豬，成功復(fù)制出PMWS的典型的臨床癥狀和病理變化，由此拉開(kāi)了PCV2感染性克隆的構(gòu)建工作的序幕。該實(shí)驗(yàn)是首次應(yīng)用含有PCV2全基因組的重組質(zhì)粒直接注射豬體并獲得PCV2病毒粒子。郗鑫等(2004)在構(gòu)建的單拷貝PCV2病毒基因組感染性克隆過(guò)程當(dāng)中，將克隆到的病毒基因組環(huán)化后，經(jīng)脂質(zhì)體介導(dǎo)體外轉(zhuǎn)染PK-15細(xì)胞，結(jié)果克隆到的3株病毒的基因組，在轉(zhuǎn)染PK-15細(xì)胞后沒(méi)有檢測(cè)到熒光，但將轉(zhuǎn)染細(xì)胞盲傳3代后，毒株的基因組轉(zhuǎn)染的細(xì)胞檢測(cè)到了熒光，而其中的2株仍然檢測(cè)不到熒光，究其原因，可能是PCR擴(kuò)增的保真度不夠，致使某些克隆子發(fā)生點(diǎn)突變，影響到了病毒基因組的轉(zhuǎn)錄和復(fù)制。另外，由于PCV2在細(xì)胞中的增殖滴度不高，基因組轉(zhuǎn)染效率較差，故造成實(shí)驗(yàn)成功率低。很多研究人員會(huì)在拯救病毒過(guò)程中用適量濃度的D-氨基葡萄糖對(duì)轉(zhuǎn)染后的細(xì)胞進(jìn)行處理 以提高病毒滴度，但由于D-氨基葡萄糖對(duì)細(xì)胞有毒性，往往會(huì)造成細(xì)胞發(fā)生退行性變化，嚴(yán)重影響了細(xì)胞的生長(zhǎng)狀態(tài)。國(guó)內(nèi)還有很多其他科研單位也陸續(xù)開(kāi)展了PCV2單拷貝感染性克隆的相關(guān)研究，但是都存在一個(gè)缺陷，即病毒拯救效率低下。Fenaux等早在2002年就進(jìn)行了PCV2感染性克隆的研究。而在國(guó)內(nèi)，雖然也有此方面的報(bào)道，但轉(zhuǎn)染后產(chǎn)生子代病毒的能力不是很好，一般都需要經(jīng)過(guò)數(shù)次盲傳后才能檢測(cè)到子代病毒粒子的產(chǎn)生。(蘆銀華，華修國(guó)，崔立，等.感染性豬圓環(huán)病毒2型基因組DNA的分子克隆[J].中國(guó)病毒學(xué)，2003，18(4)：371-375；郗鑫，陳煥春，陳華平等.豬II型圓環(huán)病毒全基因組的克隆及感染性鑒定[J].微生物學(xué)報(bào)，2004，44(2)：172-17)雖然國(guó)內(nèi)亦陸續(xù)有成功構(gòu)建PCV2雙拷貝感染性克隆的報(bào)道，但是從現(xiàn)有的相關(guān)研究數(shù)據(jù)來(lái)看，拯救病毒的遺傳穩(wěn)定性不是很好，很多拯救成功的PCV2一般都是盲傳到10代以?xún)?nèi)，并未見(jiàn)到更高代次(幾十代)的遺傳穩(wěn)定性的報(bào)道。此說(shuō)明，可能這些構(gòu)建成功的PCV2雙拷貝感染性克隆在PK-15細(xì)胞上遺傳穩(wěn)定性不好，不能在PK-15細(xì)胞上持續(xù)穩(wěn)定增殖?？v觀現(xiàn)有的PCV2全基因單拷貝以及雙拷貝感染性分子克隆構(gòu)建的各項(xiàng)研究，雖然有不少病毒拯救成功的案例，但是所拯救的病毒滴度或者比親本毒的滴度還要低或者二者相差不大，并未見(jiàn)拯救毒株滴度明顯高于親本毒的報(bào)道。中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院蘭州獸醫(yī)研究所利用PCR方法從河北保定株(HBBD0608)豬PCV2病料中獲得了PCV2全基因組序列，將其定向克隆入pEGFP-N1載體，成功構(gòu)建了PCV2全基因組串聯(lián)雙拷貝的重組質(zhì)粒pEGFP-N1-2PCV2，在PK-15細(xì)胞上連續(xù)盲傳了5代并進(jìn)行間接免疫熒光檢測(cè)，從第3代開(kāi)始才可以檢測(cè)到病毒抗原。雖然該研究構(gòu)建的也是雙拷貝感染性克隆，但是與其相比，我們的構(gòu)建策略做了較大調(diào)整，所達(dá)到的病毒拯救效果也得到大幅提升，我們?cè)O(shè)計(jì)了不同的引物，選擇了不同的酶切位點(diǎn)，選用了特殊的工具酶，采用了同步接毒 的細(xì)胞接毒方式，又開(kāi)創(chuàng)性地選用豬睪丸細(xì)胞(ST細(xì)胞)作為雙拷貝病毒的宿主細(xì)胞，讓其在ST細(xì)胞上進(jìn)行增殖，本發(fā)明構(gòu)建的雙拷貝重組質(zhì)粒經(jīng)轉(zhuǎn)染宿主細(xì)胞后從第1代就開(kāi)始檢測(cè)到特異性熒光，且將其連續(xù)傳了60代后依然能檢測(cè)到比較強(qiáng)烈的熒光。技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：本發(fā)明旨在克服PCV2病毒拯救效率低下，遺傳不穩(wěn)定性等缺點(diǎn)，提高病毒培養(yǎng)滴度，降低全病毒滅活疫苗成本，對(duì)防治PCV2引發(fā)的疾病有重要意義。本發(fā)明通過(guò)采用適當(dāng)?shù)幕蚬こ碳夹g(shù)方法，基于臨床分離得到的PCV2基因組DNA，設(shè)計(jì)特異性引物，經(jīng)PCR獲得全長(zhǎng)基因，將兩個(gè)拷貝的PCV2全長(zhǎng)基因以首尾相連的方式串聯(lián)連到pEGFP-N1載體上，形成PCV2雙拷貝全基因重組質(zhì)粒，轉(zhuǎn)染ST細(xì)胞連續(xù)盲傳60代，借助PCR檢測(cè)方法以及間接免疫熒光實(shí)驗(yàn)技術(shù)(IFA)對(duì)其在ST細(xì)胞上的感染性以及病毒增殖穩(wěn)定性進(jìn)行鑒定，為進(jìn)一步研究圓環(huán)病毒的致病機(jī)理打下基礎(chǔ)，同時(shí)也為PCV2滅活疫苗的研制奠定基礎(chǔ)。與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明的病毒拯救方法具有以下優(yōu)勢(shì)：經(jīng)過(guò)基因比對(duì)和序列分析，設(shè)計(jì)了特異性的引物，選擇了有效的酶切位點(diǎn)；使用高保真酶對(duì)兩個(gè)拷貝PCV2全基因組進(jìn)行擴(kuò)增，提高了擴(kuò)增效率及準(zhǔn)確度，在克隆過(guò)程中，利用高效連接酶Ligationhigh，亦有效提高了片段連接的效率，與普通的T4連接酶相比連接效率提高了50多倍；選用了帶有報(bào)告基因GFP的真核表達(dá)載體pEGFP-N1，從而簡(jiǎn)化了鑒定重組質(zhì)粒是否轉(zhuǎn)染成功的方法；采用了同步接毒的細(xì)胞接毒方式；更為重要的是，本發(fā)明開(kāi)創(chuàng)性地選用豬睪丸細(xì)胞(ST細(xì)胞)作為雙拷貝病毒的宿主細(xì)胞，讓感染性克隆在ST細(xì)胞上進(jìn)行增殖，并且實(shí)現(xiàn)了持續(xù)穩(wěn)定遺傳，且滴度最高可達(dá)107TCID50/0.1ml。本發(fā)明構(gòu)建的雙拷貝重組質(zhì)粒 經(jīng)轉(zhuǎn)染宿主細(xì)胞后從第1代就開(kāi)始檢測(cè)到特異性熒光，且將其連續(xù)傳了60代后依然能檢測(cè)到比較強(qiáng)烈的熒光。本發(fā)明是通過(guò)以下技術(shù)方案實(shí)現(xiàn)的：豬圓環(huán)病毒2型雙拷貝感染性克隆的病毒拯救方法包括以下四個(gè)步驟：步驟一：雙拷貝感染性克隆pEGFP-N1-BD的構(gòu)建：(1)PCV2DNA的提取a、從臨床PMWS癥狀豬群中分離得到PCV2毒株，對(duì)其進(jìn)行基因比對(duì)和序列分析；取含PCV2-GD毒株的細(xì)胞培養(yǎng)物200μL，加入20μLProteinaseK溶液，混勻；b、加入200μL緩沖液GB，充分顛倒混勻，70℃放置10分鐘，待溶液變清亮簡(jiǎn)短離心以去除管蓋內(nèi)壁的水珠，加入200pL無(wú)水乙醇，充分震蕩混勻15秒，簡(jiǎn)短離心去除管壁蓋內(nèi)壁的水珠；c、將上一步所得溶液加入到試劑盒配的吸附柱CB3中，12000rpm離心30秒，倒掉廢液，將吸附柱放回收集管中，向吸附柱CB3中加入500μL緩沖液GD(使用前加入適量無(wú)水乙醇)，12000rpm離心30秒，倒掉廢液，將吸附柱放回收集管中；d、向吸附柱CB3中加入600μL緩沖液PW(使用前加入適量無(wú)水乙醇)，12000rpm離心30秒，倒掉廢液，將吸附柱放回收集管中，該步驟重復(fù)兩次，然后將吸附柱CB3放回收集管中，12000rpm離心2分鐘，倒掉廢液，將吸附柱CB3置于室溫放置數(shù)分鐘，徹底晾干吸附柱中殘余的漂洗液，將吸附柱CB3轉(zhuǎn)入干凈的離心管中，向吸附膜中間部位懸空滴加60μL洗脫液TE，室溫放置2-5分鐘，12000rpm離心2分鐘，收集病毒基因組DNA，-20℃保存?zhèn)溆谩?2)設(shè)計(jì)引物和選擇酶切位點(diǎn)第一對(duì)引物：GDF1：cgctcgaggctggctgaacttttg，GDR1cgaccgcggaaatttctgacaaacg，上游引物GDF1下劃線部分是XhoI酶切位點(diǎn)，下游引物GDR1下劃線部分是SacII酶切位點(diǎn)；第二對(duì)引物：GDF2：catccgcgggctggctgaacca，GDR2caggatccaaatttctgacaaacgttacaggg，上游引物GDF2下劃線部分是SacII酶切位點(diǎn)，下游引物GDR2下劃線部分是BamHI酶切位點(diǎn)；(3)全基因擴(kuò)增以上述DNA為模板，利用設(shè)計(jì)的2對(duì)PCR引物GDF1/GDR1，GDF2/GDR2分別擴(kuò)增兩個(gè)拷貝的PCV2-GD全基因組片段(即片段B、D)；擴(kuò)增條件為：95℃預(yù)變性4min，94℃變性1min，54℃退火1min30s，72℃延伸3min，30個(gè)循環(huán)，72℃延伸10min；PCR反應(yīng)體系如下：高保真酶PrimerSTAR1μL，10×Buffer5μL，dNTPMix8μL，PCV2-GDDNA1μL，GDF1/GDF22.5μL，GDR1/GDR22.5μL，ddH2O30μL，總共計(jì)50μL；PCR結(jié)束后取5μLPCR產(chǎn)物在10g/L的瓊脂糖凝膠上電泳檢測(cè)，結(jié)果如圖1所示；(4)雙拷貝全基因感染性分子克隆的構(gòu)建將純化后的B片段與pEGFP-N1質(zhì)粒用XhoI酶、SacII酶進(jìn)行同步雙酶切，切膠回收后再將二者按一定比例相連，連接采用10μL體系：B片段4μL，雙酶切的載體pEGFP-N11μL，連接酶LigationHigh(含Buffer)5μL，隨后轉(zhuǎn)化到DH5α感受態(tài)細(xì)胞，涂卡那抗性板，篩選并提取陽(yáng)性重組質(zhì)粒pEGFP-N1-B，再用SacII酶、BamHI酶將D片段和重組質(zhì)粒pEGFP-N1-B進(jìn)行同步雙酶切，切膠回收后再將二者高效連接酶LigationHigh按一定比例相連：D片段4μL，雙酶切 的載體pEGFP-N1-B1μL，連接酶LigationHigh(含Buffer)5μL，轉(zhuǎn)化到DH5α感受態(tài)細(xì)胞，涂卡那抗性板，篩選并提取質(zhì)粒pEGFP-N1-BD，經(jīng)菌液PCR、雙酶切鑒定以及序列測(cè)定，最終成功構(gòu)建雙拷貝重組質(zhì)粒pEGFP-N1-BD；(5)重組質(zhì)粒雙酶切鑒定pEGFP-N1-BD的雙酶切體系如下：BamHI2μL，XhoI2μLBuffer(10×K)2μL，ddH2O9μL，pEGFP-N1-BD15μL，共計(jì)30μL；將上述組分充分混勻，置于37℃水浴鍋內(nèi)，酶切過(guò)夜，用1％瓊脂糖凝膠對(duì)PCR產(chǎn)物進(jìn)行電泳檢測(cè)，結(jié)果如圖2所示；(6)測(cè)序鑒定將酶切鑒定后的質(zhì)粒進(jìn)行測(cè)序；(7)陽(yáng)性重組質(zhì)粒大量提取將已構(gòu)建好的雙拷貝重組質(zhì)粒pEGFP-N1-BD提取后測(cè)定濃度和純度，于-20℃保存?zhèn)溆?，具體提取步驟如下：a、平衡柱子：向吸附柱CP6中加入2.5ml平衡液BL，8000rpm離心2分鐘，倒掉收集管中的廢液，將吸附柱重新放回收集管中，取100ml過(guò)夜培養(yǎng)的已鑒定為陽(yáng)性的菌液加入離心管，室溫8000rpm離心3分鐘收集細(xì)菌，盡量吸除上清，用干凈的吸水紙吸去管壁上的水滴；b、向留有菌體沉淀的離心管中加入8ml溶液P1(已加入適量RNaseA)，漩渦震蕩以徹底懸浮細(xì)菌細(xì)胞沉淀，向離心管中加入8ml溶液P2，立即溫和地上下翻轉(zhuǎn)混勻，室溫放置5分鐘，向離心管中加入8ml溶液P4，立即溫和地上下翻轉(zhuǎn)混勻，待溶液出現(xiàn)白色分散絮狀沉淀后室溫放置10分鐘左右，8000rpm離心10分鐘，使白色沉淀離至管底，將全部溶液小心倒入過(guò)濾器CS1中，慢慢推動(dòng)推柄，濾液收集在干凈的50ml干凈的離心管中；c、向?yàn)V液中加入0.3倍濾液體積的異丙醇，上下顛倒混勻后轉(zhuǎn)移到吸附柱CP6中，室溫8000rpm離心2分鐘，倒掉收集管中的廢液，將吸附柱CP6重新放回收集管中，向吸附柱中加入10ml漂洗液PW(已提前加入適量無(wú)水乙醇)，8000rpm離心2分鐘，該步驟重復(fù)2次，向吸附柱中加入3ml無(wú)水乙醇，室溫8000rpm離心2分鐘，倒掉廢液；d、將吸附柱重新放回收集管中，8000rpm離心5分鐘，除去吸附柱中的殘留漂洗液，吸附柱CP6置于一個(gè)干凈的50ml收集管中，向吸附膜的中間部位滴加2ml洗脫液TB，室溫放置5分鐘，然后室溫8000rpm離心2分鐘，將50ml離心管中的洗脫液全部轉(zhuǎn)移到一個(gè)干凈的1.5ml離心管中，-20℃保存?zhèn)溆?。步驟二：PCV2感染性克隆在ST細(xì)胞上的轉(zhuǎn)染、傳代以及體外感染性鑒定(1)重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)染ST細(xì)胞復(fù)蘇并傳代培養(yǎng)ST細(xì)胞，選用進(jìn)入對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的無(wú)PCV1污染的ST細(xì)胞用胰酶按常規(guī)方法消化，以1×106個(gè)細(xì)胞/mL接種6孔板，每孔2mL，37℃5％CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，待細(xì)胞鋪滿約90％時(shí)，通過(guò)脂質(zhì)體Lipofectamine2000介導(dǎo)轉(zhuǎn)染無(wú)PCV2污染的ST細(xì)胞，具體轉(zhuǎn)染步驟如下：每孔吸取150μLOPTI-MEM與10μL脂質(zhì)體Lipofectamine2000充分混勻后，再吸取150μLOPTI-MEM+3ug雙拷貝重組質(zhì)粒+3μLreagentplus；將上述兩種溶液混合，室溫下放置5min；與此同時(shí)，將6孔板中的細(xì)胞用無(wú)血清MEM輕輕洗滌兩遍后，每孔加入2ml無(wú)血清培養(yǎng)基，隨后將質(zhì)粒/脂質(zhì)體復(fù)合物逐滴加入孔中，搖動(dòng)培養(yǎng)板，輕輕混勻，在37℃、5％的CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)5小時(shí)，同時(shí)設(shè)平行轉(zhuǎn)染空載體pEGFP-N1作為陰性對(duì)照，6小時(shí)后，更換10％血清的MEM，在37℃、5％的CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，期間每隔12小時(shí)置于熒光顯微鏡下觀察轉(zhuǎn)染是否成功，培養(yǎng)72小時(shí)后凍存收獲細(xì)胞培養(yǎng)物，按照普通病毒培養(yǎng)的方法對(duì) 其進(jìn)行盲傳；(2)在ST細(xì)胞上的傳代構(gòu)建好的重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)染ST細(xì)胞72小時(shí)后，將病毒液反復(fù)凍融3次，離心取上清，將正常ST細(xì)胞按1∶4比例傳代后，用T25細(xì)胞培養(yǎng)瓶進(jìn)行培養(yǎng)，每瓶9ml細(xì)胞懸液，再吸取1ml轉(zhuǎn)染后培養(yǎng)72h收獲的細(xì)胞培養(yǎng)物上清輕輕搖晃均勻，置于37℃、5％的CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，24h后棄掉細(xì)胞瓶中液體，用滅菌的PBS輕輕洗滌細(xì)胞表面2遍，換用2％胎牛血清的MEM營(yíng)養(yǎng)液10ml，繼續(xù)培養(yǎng)48h后病毒液反復(fù)凍融3次，離心取上清，將按此方法繼續(xù)盲傳；(3)在ST細(xì)胞上的感染性鑒定再借助間接免疫熒光的方法對(duì)病毒在ST細(xì)胞上能否穩(wěn)定增殖進(jìn)行檢測(cè)，具體操作步驟如下：將收獲的病毒液按10％的比例同步接種于消化好的ST細(xì)胞懸液，再接種于96孔細(xì)胞培養(yǎng)板，100μL/孔，24h后棄掉板內(nèi)液體，37℃，5％CO2培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)48小時(shí)，甩棄板內(nèi)液體，用PBS洗滌三遍，倒扣拍干孔內(nèi)液體后再進(jìn)行下面步驟：a、固定：每孔加入100μL無(wú)水乙醇，先在室溫放置15min，再4℃放置1h，棄掉孔內(nèi)無(wú)水乙醇，拍干。b、孵育一抗：用抗體稀釋液將抗PCV2Cap蛋白鼠源單抗PCV2-A(美國(guó)RTI公司產(chǎn)品)按1∶1000的比例稀釋?zhuān)浞只靹蚝竺靠准尤?00μL，37℃孵育1h。棄掉一抗，PBS震蕩洗滌3次，每次5分鐘，拍干。c、孵育二抗：用抗體稀釋液將FITC標(biāo)記的羊抗鼠IgG按1∶500的比例稀釋?zhuān)浞只靹蚝竺靠准尤?00μL，包裹上錫箔紙避光，37℃避光孵育1h。棄掉二抗，PBS震蕩洗滌3次，每次5分鐘，拍干。d、染核：將DAPI(4′，6-二脒基-2-苯基吲哚)用滅菌水稀釋到1ug/μL，充分混勻后 每孔加入100μL，室溫下作用5分鐘后棄之，PBS震蕩洗滌3次，每次5分鐘，拍干。e、封片：每孔加入碳緩甘油100μL，倒置熒光顯微鏡下觀察，觀察結(jié)果如圖3-11所示。間接免疫熒光試驗(yàn)檢測(cè)顯示均在細(xì)胞核中聚集大量的病毒抗原，而轉(zhuǎn)染空載體的ST細(xì)胞未見(jiàn)特異性熒光。抽檢不同盲傳代次細(xì)胞培養(yǎng)物均能檢測(cè)到特異性熒光，而且結(jié)果表明，隨著代次增高陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)量也逐漸增多，提示病毒能在ST細(xì)胞上進(jìn)行增殖并復(fù)制出子代病毒，表明用本研究中的方法構(gòu)建的雙拷貝PCV2基因組重組質(zhì)粒經(jīng)轉(zhuǎn)染ST細(xì)胞后具有感染性，為基因工程苗的進(jìn)一步研發(fā)奠定了基礎(chǔ)。由上可以推理，可能是雙拷貝感染性克隆的構(gòu)建遵循了PCV2病毒滾環(huán)復(fù)制的規(guī)律，因而病毒得以拯救成功。間接免疫熒光實(shí)驗(yàn)的最后階段加完熒光抗體洗滌之后用DAPI進(jìn)行細(xì)胞染核，結(jié)果可以發(fā)現(xiàn)PCV2抗原在細(xì)胞核出現(xiàn)大量聚集，為特異性熒光，說(shuō)明病毒拯救成功。步驟三：拯救毒株各代次盲傳病毒液PCR檢測(cè)收獲每一代病毒液保存于-20℃，抽取部分代次病毒液提取DNA進(jìn)行PCR檢測(cè)，檢測(cè)結(jié)果如圖12所示。結(jié)果表明：拯救的病毒在本研究使用的ST細(xì)胞上具有良好的適應(yīng)性，能夠穩(wěn)定遺傳，并且隨著代次的增加檢測(cè)到特異性核酸亮度也不斷增大，暗示了拯救病毒的增殖能力也在不斷提高。步驟四：拯救毒株毒價(jià)的初步測(cè)定抽取盲傳收獲的病毒液部分代次F5，F(xiàn)10，F(xiàn)15，F(xiàn)20，F(xiàn)25，F(xiàn)40，F(xiàn)60做間接免疫熒光實(shí)驗(yàn)，計(jì)算陽(yáng)性細(xì)胞孔數(shù)，用Reed-Muench法計(jì)算半數(shù)細(xì)胞培養(yǎng)感染量：a、將長(zhǎng)成單層的ST細(xì)胞用0.25％的胰酶消化，分裝到96孔細(xì)胞培養(yǎng)板，用維 持液將待測(cè)病毒液以10倍倍比稀釋后同步接種ST細(xì)胞，每個(gè)稀釋度接種8孔細(xì)胞，每孔100μL，并留兩列ST細(xì)胞做空白對(duì)照，37℃5％CO2中培養(yǎng)24h；b、棄去96孔細(xì)胞培養(yǎng)板內(nèi)的液體，用MEM細(xì)胞培養(yǎng)液輕輕洗滌細(xì)胞表面2次，加足維持液繼續(xù)培養(yǎng)48h，每孔加入100μL無(wú)水乙醇，先在室溫放置15min，再4℃放置1h，棄掉孔內(nèi)無(wú)水乙醇，拍干；c、用抗體稀釋液將抗PCV2Cap蛋白鼠源單抗PCV-A按1∶1000的比例稀釋?zhuān)浞只靹蚝竺靠准尤?00μL，37℃孵育1h；棄掉一抗，PBS震蕩洗滌3次，每次5分鐘，拍干，用抗體稀釋液將FITC標(biāo)記的羊抗鼠IgG按1∶500的比例稀釋?zhuān)浞只靹蚝竺靠准尤?00μL，包裹上錫箔紙避光，37℃避光孵育1h；棄掉二抗，PBS震蕩洗滌3次，每次5分鐘，拍干；d、將DAPI(4′，6-二脒基-2-苯基吲哚)用滅菌水稀釋到1ug/μL，充分混勻后每孔加入100μL，室溫下作用5分鐘后棄之，PBS震蕩洗滌3次，每次5分鐘，拍干；e、每孔加入碳緩甘油100μL，倒置熒光顯微鏡下觀察，以出現(xiàn)綠色熒光者為陽(yáng)性，表示病毒在此孔得到擴(kuò)增；記錄每列中出現(xiàn)綠色熒光的孔數(shù)，按Reed-Muench法計(jì)算病毒的半數(shù)感染量(TCID50)。抽取的各代次病毒毒價(jià)測(cè)得結(jié)果如下：病毒代次F5F10F15F20F25F40F60TCID50/0.1ml103.5104.5106.5107.0106.3105.0105.2結(jié)果表明：拯救的PCV2雙拷貝病毒在傳代過(guò)程中趨于穩(wěn)定，從第10代開(kāi)始病毒滴度明顯增高，且能穩(wěn)定傳到第60代滴度仍可維持在105.0TCID50/0.1ml以上，且最高值出現(xiàn)在F15到F25之間。附圖說(shuō)明圖1為PCV2-GD全基因組B、D的擴(kuò)增結(jié)果，其中M：DL2000分子質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)；NC：陰性對(duì)照；1：第一個(gè)拷貝全基因組(片段B)；2：第二個(gè)拷貝全基因組(片段D)。圖2為雙拷貝重組質(zhì)粒pEGFP-N1-BD的XhoI、BamHI雙酶切鑒定結(jié)果，其中M：DL5000分子質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)；1～2：重組質(zhì)粒pEGFP-N1-BD的XhoI、BamHI雙酶切。圖3為IFA的陰性對(duì)照，圖4為轉(zhuǎn)染后的IFA檢測(cè)結(jié)果，圖5-11分別為拯救病毒盲傳F5、F10、F15、F20、F25、F40、F60代次的IFA檢測(cè)結(jié)果。圖12為拯救病毒不同代次病毒液抽檢PCR電泳圖，其中，1～10為F1、F5、F10、F15、F20、F25、F30、F35、F40、F60，11～12為正常未接毒的ST細(xì)胞；M為DNAMarker13為PCV2陽(yáng)性對(duì)照。具體實(shí)施方式下面結(jié)合實(shí)施例對(duì)本發(fā)明作進(jìn)一步說(shuō)明。實(shí)施例：按以下步驟對(duì)豬圓環(huán)病毒2型雙拷貝感染性克隆進(jìn)行病毒拯救：步驟一：雙拷貝感染性克隆pEGFP-N1-BD的構(gòu)建：(1)PCV2DNA的提取a、從臨床PMWS癥狀豬群中分離得到PCV2毒株，對(duì)其進(jìn)行基因比對(duì)和序列分析；取含PCV2-GD毒株的細(xì)胞培養(yǎng)物200μL，加入20μLProteinaseK溶液，混勻；b、加入200μL緩沖液GB，充分顛倒混勻，70℃放置10分鐘，待溶液變清亮簡(jiǎn)短離心以去除管蓋內(nèi)壁的水珠，加入200μL無(wú)水乙醇，充分震蕩混勻15秒，簡(jiǎn) 短離心去除管壁蓋內(nèi)壁的水珠；c、將上一步所得溶液加入到試劑盒配的吸附柱CB3中，12000rpm離心30秒，倒掉廢液，將吸附柱放回收集管中，向吸附柱CB3中加入500μL緩沖液GD(使用前加入適量無(wú)水乙醇)，12000rpm離心30秒，倒掉廢液，將吸附柱放回收集管中；d、向吸附柱CB3中加入600μL緩沖液PW(使用前加入適量無(wú)水乙醇)，12000rpm離心30秒，倒掉廢液，將吸附柱放回收集管中，該步驟重復(fù)兩次，然后將吸附柱CB3放回收集管中，12000rpm離心2分鐘，倒掉廢液，將吸附柱CB3置于室溫放置數(shù)分鐘，徹底晾干吸附柱中殘余的漂洗液，將吸附柱CB3轉(zhuǎn)入干凈的離心管中，向吸附膜中間部位懸空滴加60μL洗脫液TE，室溫放置2-5分鐘，12000rpm離心2分鐘，收集病毒基因組DNA，-20℃保存?zhèn)溆谩?2)設(shè)計(jì)引物和選擇酶切位點(diǎn)第一對(duì)引物：GDF1：cgctcgaggctggctgaacttttg，GDR1cgaccgcggaaatttctgacaaacg，上游引物GDF1下劃線部分是XhoI酶切位點(diǎn)，下游引物GDR1下劃線部分是SacII酶切位點(diǎn)；第二對(duì)引物：GDF2：catccgcgggctggctgaacca，GDR2caggatccaaatttctgacaaacgttacaggg，上游引物GDF2下劃線部分是SacII酶切位點(diǎn)，下游引物GDR2下劃線部分是BamHI酶切位點(diǎn)；(3)全基因擴(kuò)增以上述DNA為模板，利用設(shè)計(jì)的2對(duì)PCR引物GDF1/GDR1，GDF2/GDR2分別擴(kuò)增兩個(gè)拷貝的PCV2-GD全基因組片段(即片段B、D)；擴(kuò)增條件為：95℃預(yù)變性4min，94℃變性1min，54℃退火1min30s，72℃延伸3min，30個(gè)循環(huán)，72℃延伸10min；PCR反應(yīng)體系如下：高保真酶PrimerSTAR1μL， 10×Buffer5μL，dNTPMix8μL，PCV2-GDDNA1μL，GDF1/GDF22.5μL，GDR1/GDR22.5μL，ddH2O30μL，總共計(jì)50μL；PCR結(jié)束后取5μLPCR產(chǎn)物在10g/L的瓊脂糖凝膠上電泳檢測(cè)，結(jié)果如圖1所示；(4)雙拷貝全基因感染性分子克隆的構(gòu)建將純化后的B片段與pEGFP-N1質(zhì)粒用XhoI酶、SacII酶進(jìn)行同步雙酶切，切膠回收后再將二者按一定比例相連，連接采用10μL體系：B片段4μL，雙酶切的載體pEGFP-N11μL，連接酶LigationHigh(含Buffer)5μL，隨后轉(zhuǎn)化到DH5α感受態(tài)細(xì)胞，涂卡那抗性板，篩選并提取陽(yáng)性重組質(zhì)粒pEGFP-N1-B，再用SacII酶、BamHI酶將D片段和重組質(zhì)粒pEGFP-N1-B進(jìn)行同步雙酶切，切膠回收后再將二者高效連接酶LigationHigh按一定比例相連：D片段4μL，雙酶切的載體pEGFP-N1-B1μL，連接酶LigationHigh(含Buffer)5μL，轉(zhuǎn)化到DH5α感受態(tài)細(xì)胞，涂卡那抗性板，篩選并提取質(zhì)粒pEGFP-N1-BD，經(jīng)菌液PCR、雙酶切鑒定以及序列測(cè)定，最終成功構(gòu)建雙拷貝重組質(zhì)粒pEGFP-N1-BD；(5)重組質(zhì)粒雙酶切鑒定pEGFP-N1-BD的雙酶切體系如下：BamHI2μL，XhoI2μLBuffer(10×K)2μL，ddH2O9μL，pEGFP-N1-BD15μL，共計(jì)30μL；將上述組分充分混勻，置于37℃水浴鍋內(nèi)，酶切過(guò)夜，用1％瓊脂糖凝膠對(duì)PCR產(chǎn)物進(jìn)行電泳檢測(cè)，結(jié)果如圖2所示；(6)測(cè)序鑒定將酶切鑒定后的質(zhì)粒進(jìn)行測(cè)序；(7)陽(yáng)性重組質(zhì)粒大量提取將已構(gòu)建好的雙拷貝重組質(zhì)粒pEGFP-N1-BD提取后測(cè)定濃度和純度，于 -20℃保存?zhèn)溆?，具體提取步驟如下：a、平衡柱子：向吸附柱CP6中加入2.5ml平衡液BL，8000rpm離心2分鐘，倒掉收集管中的廢液，將吸附柱重新放回收集管中，取100ml過(guò)夜培養(yǎng)的已鑒定為陽(yáng)性的菌液加入離心管，室溫8000rpm離心3分鐘收集細(xì)菌，盡量吸除上清，用干凈的吸水紙吸去管壁上的水滴；b、向留有菌體沉淀的離心管中加入8ml溶液P1(已加入適量RNaseA)，漩渦震蕩以徹底懸浮細(xì)菌細(xì)胞沉淀，向離心管中加入8ml溶液P2，立即溫和地上下翻轉(zhuǎn)混勻，室溫放置5分鐘，向離心管中加入8ml溶液P4，立即溫和地上下翻轉(zhuǎn)混勻，待溶液出現(xiàn)白色分散絮狀沉淀后室溫放置10分鐘左右，8000rpm離心10分鐘，使白色沉淀離至管底，將全部溶液小心倒入過(guò)濾器CS1中，慢慢推動(dòng)推柄，濾液收集在干凈的50ml干凈的離心管中；c、向?yàn)V液中加入0.3倍濾液體積的異丙醇，上下顛倒混勻后轉(zhuǎn)移到吸附柱CP6中，室溫8000rpm離心2分鐘，倒掉收集管中的廢液，將吸附柱CP6重新放回收集管中，向吸附柱中加入10ml漂洗液PW(已提前加入適量無(wú)水乙醇)，8000rpm離心2分鐘，該步驟重復(fù)2次，向吸附柱中加入3ml無(wú)水乙醇，室溫8000rpm離心2分鐘，倒掉廢液；d、將吸附柱重新放回收集管中，8000rpm離心5分鐘，除去吸附柱中的殘留漂洗液，吸附柱CP6置于一個(gè)干凈的50ml收集管中，向吸附膜的中間部位滴加2ml洗脫液TB，室溫放置5分鐘，然后室溫8000rpm離心2分鐘，將50ml離心管中的洗脫液全部轉(zhuǎn)移到一個(gè)干凈的1.5ml離心管中，-20℃保存?zhèn)溆?。步驟二：PCV2感染性克隆在ST細(xì)胞上的轉(zhuǎn)染、傳代以及體外感染性鑒定(1)重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)染ST細(xì)胞復(fù)蘇并傳代培養(yǎng)ST細(xì)胞，選用進(jìn)入對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的無(wú)PCV1污染的ST細(xì)胞 用胰酶按常規(guī)方法消化，以1×106個(gè)細(xì)胞/mL接種6孔板，每孔2mL，37℃5％CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，待細(xì)胞鋪滿約90％時(shí)，通過(guò)脂質(zhì)體Lipofectamine2000介導(dǎo)轉(zhuǎn)染無(wú)PCV2污染的ST細(xì)胞，具體轉(zhuǎn)染步驟如下：每孔吸取150μLOPTI-MEM與10μL脂質(zhì)體Lipofectamine2000充分混勻后，再吸取150μLOPTI-MEM+3ug雙拷貝重組質(zhì)粒+3μLreagentplus；將上述兩種溶液混合，室溫下放置5min；與此同時(shí)，將6孔板中的細(xì)胞用無(wú)血清MEM輕輕洗滌兩遍后，每孔加入2ml無(wú)血清培養(yǎng)基，隨后將質(zhì)粒/脂質(zhì)體復(fù)合物逐滴加入孔中，搖動(dòng)培養(yǎng)板，輕輕混勻，在37℃、5％的CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)5小時(shí)，同時(shí)設(shè)平行轉(zhuǎn)染空載體pEGFP-N1作為陰性對(duì)照，6小時(shí)后，更換10％血清的MEM，在37℃、5％的CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，期間每隔12小時(shí)置于熒光顯微鏡下觀察轉(zhuǎn)染是否成功，培養(yǎng)72小時(shí)后凍存收獲細(xì)胞培養(yǎng)物，按照普通病毒培養(yǎng)的方法對(duì)其進(jìn)行盲傳；(2)在ST細(xì)胞上的傳代構(gòu)建好的重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)染ST細(xì)胞72小時(shí)后，將病毒液反復(fù)凍融3次，離心取上清，將正常ST細(xì)胞按1∶4比例傳代后，用T25細(xì)胞培養(yǎng)瓶進(jìn)行培養(yǎng)，每瓶9ml細(xì)胞懸液，再吸取1ml轉(zhuǎn)染后培養(yǎng)72h收獲的細(xì)胞培養(yǎng)物上清輕輕搖晃均勻，置于37℃、5％的CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，24h后棄掉細(xì)胞瓶中液體，用滅菌的PBS輕輕洗滌細(xì)胞表面2遍，換用2％胎牛血清的MEM營(yíng)養(yǎng)液10ml，繼續(xù)培養(yǎng)48h后病毒液反復(fù)凍融3次，離心取上清，將按此方法繼續(xù)盲傳；(3)在ST細(xì)胞上的感染性鑒定再借助間接免疫熒光的方法對(duì)病毒在ST細(xì)胞上能否穩(wěn)定增殖進(jìn)行檢測(cè)，具體操作步驟如下：將收獲的病毒液按10％的比例同步接種于消化好的ST細(xì)胞懸液，再接種于96孔細(xì)胞培養(yǎng)板，100μL/孔，24h后棄掉板內(nèi)液體，37℃，5％CO2 培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)48小時(shí)，甩棄板內(nèi)液體，用PBS洗滌三遍，倒扣拍干孔內(nèi)液體后再進(jìn)行下面步驟：a、固定：每孔加入100μL無(wú)水乙醇，先在室溫放置15min，再4℃放置1h，棄掉孔內(nèi)無(wú)水乙醇，拍干。b、孵育一抗：用抗體稀釋液將抗PCV2Cap蛋白鼠源單抗PCV2-A按1∶1000的比例稀釋?zhuān)浞只靹蚝竺靠准尤?00μL，37℃孵育1h。棄掉一抗，PBS震蕩洗滌3次，每次5分鐘，拍干。c、孵育二抗：用抗體稀釋液將FITC標(biāo)記的羊抗鼠IgG按1∶500的比例稀釋?zhuān)浞只靹蚝竺靠准尤?00μL，包裹上錫箔紙避光，37℃避光孵育1h。棄掉二抗，PBS震蕩洗滌3次，每次5分鐘，拍干。d、染核：將DAPI(4′，6-二脒基-2-苯基吲哚)用滅菌水稀釋到1ug/μL，充分混勻后每孔加入100μL，室溫下作用5分鐘后棄之，PBS震蕩洗滌3次，每次5分鐘，拍干。e、封片：每孔加入碳緩甘油100μL，倒置熒光顯微鏡下觀察，觀察結(jié)果如圖3-11所示。間接免疫熒光試驗(yàn)檢測(cè)顯示均在細(xì)胞核中聚集大量的病毒抗原，而轉(zhuǎn)染空載體的ST細(xì)胞未見(jiàn)特異性熒光。抽檢不同盲傳代次細(xì)胞培養(yǎng)物均能檢測(cè)到特異性熒光，而且結(jié)果表明，隨著代次增高陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)量也逐漸增多，提示病毒能在ST細(xì)胞上進(jìn)行增殖并復(fù)制出子代病毒，表明用本研究中的方法構(gòu)建的雙拷貝PCV2基因組重組質(zhì)粒經(jīng)轉(zhuǎn)染ST細(xì)胞后具有感染性，為基因工程苗的進(jìn)一步研發(fā)奠定了基礎(chǔ)。由上可以推理，可能是雙拷貝感染性克隆的構(gòu)建遵循了PCV2病毒滾環(huán)復(fù)制的規(guī)律，因而病毒得以拯救成功。間接免疫熒光實(shí)驗(yàn)的最后階段加完熒光抗體洗滌之后用DAPI進(jìn)行細(xì)胞染核，結(jié)果可以發(fā)現(xiàn)PCV2抗原在細(xì)胞 核出現(xiàn)大量聚集，為特異性熒光，說(shuō)明病毒拯救成功。步驟三：拯救毒株各代次盲傳病毒液PCR檢測(cè)收獲每一代病毒液保存于-20℃，每隔4代抽取病毒液提取DNA進(jìn)行PCR檢測(cè)，檢測(cè)結(jié)果如圖12所示。結(jié)果表明：拯救的病毒在本研究使用的ST細(xì)胞上具有良好的適應(yīng)性，能夠穩(wěn)定遺傳，并且隨著代次的增加檢測(cè)到特異性核酸亮度也不斷增大，暗示了拯救病毒的增殖能力也在不斷提高。步驟四：拯救毒株毒價(jià)的初步測(cè)定抽取盲傳收獲的病毒液部分代次F5，F(xiàn)10，F(xiàn)15，F(xiàn)20，F(xiàn)25，F(xiàn)40，F(xiàn)60做間接免疫熒光實(shí)驗(yàn)，計(jì)算陽(yáng)性細(xì)胞孔數(shù)，用Reed-Muench法計(jì)算半數(shù)細(xì)胞培養(yǎng)感染量：a、將長(zhǎng)成單層的ST細(xì)胞用0.25％的胰酶消化，分裝到96孔細(xì)胞培養(yǎng)板，用維持液將待測(cè)病毒液以10倍倍比稀釋后同步接種ST細(xì)胞，每個(gè)稀釋度接種8孔細(xì)胞，每孔100μL，并留兩列ST細(xì)胞做空白對(duì)照，37℃5％CO2中培養(yǎng)24h；b、棄去96孔細(xì)胞培養(yǎng)板內(nèi)的液體，用DMEM細(xì)胞培養(yǎng)液輕輕洗滌細(xì)胞表面2次，加足維持液繼續(xù)培養(yǎng)48h，每孔加入100μL無(wú)水乙醇，先在室溫放置15min，再4℃放置1h，棄掉孔內(nèi)無(wú)水乙醇，拍干；c、用抗體稀釋液將抗PCV2Cap蛋白鼠源單抗PCV2-A按1∶1000的比例稀釋?zhuān)浞只靹蚝竺靠准尤?00μL，37℃孵育1h；棄掉一抗，PBS震蕩洗滌3次，每次5分鐘，拍干，用抗體稀釋液將FITC標(biāo)記的羊抗鼠IgG按1∶500的比例稀釋?zhuān)浞只靹蚝竺靠准尤?00μL，包裹上錫箔紙避光，37℃避光孵育1h；棄掉二抗，PBS震蕩洗滌3次，每次5分鐘，拍干；d、將DAPI(4′，6-二脒基-2-苯基吲哚)用滅菌水稀釋到1ug/μL，充分混勻后每孔加入100μL，室溫下作用5分鐘后棄之，PBS震蕩洗滌3次，每次5分鐘，拍干；e、每孔加入碳緩甘油100μL，倒置熒光顯微鏡下觀察，以出現(xiàn)綠色熒光者為陽(yáng)性，表示病毒在此孔得到擴(kuò)增；記錄每列中出現(xiàn)綠色熒光的孔數(shù)，按Reed-Muench法計(jì)算病毒的半數(shù)感染量(TCID50)。抽取的各代次病毒毒價(jià)測(cè)得結(jié)果如下病毒代次F5F10F15F20F25F40F60TCID50/0.1ml103.5104.5106.5107106.3105105.2結(jié)果表明：拯救的PCV2雙拷貝病毒在傳代過(guò)程中趨于穩(wěn)定，從第10代開(kāi)始病毒滴度明顯增高，一直持續(xù)穩(wěn)定到第20代，均可達(dá)107TCID50/0.1ml，雖然從第20代以后病毒滴度有所下降，但是都穩(wěn)定在105TCID50/0.1ml左右。當(dāng)前第1頁(yè)1 2 3