本發(fā)明涉及微藻藻渣的回收利用和微藻培養(yǎng)，具體的說是通過水熱處理將微藻藻渣中的氮源、碳源等營養(yǎng)物質(zhì)回收并通過適當(dāng)稀釋用于螺旋藻培養(yǎng)生產(chǎn)富含多糖的生物質(zhì)?？捎糜趶U棄物資源化利用、廢水處理、螺旋藻培養(yǎng)及其生物質(zhì)的生產(chǎn)以及以螺旋藻多糖為原料的食品、醫(yī)藥、能源等相關(guān)領(lǐng)域。

背景技術(shù)：

螺旋藻多糖是螺旋藻細(xì)胞內(nèi)的一種水溶性多糖，具有抗腫瘤、抗輻射、抗突變等生物活性，能提高機(jī)體細(xì)胞和體液的免疫功能，抵制癌細(xì)胞增殖，減輕輻射所引起的遺傳損傷等，在防癌、抗衰老、增強(qiáng)機(jī)體免疫力等方面具有廣闊的應(yīng)用前景。此外，螺旋藻多糖主要由葡萄糖殘基連接而成，經(jīng)過水解后可用于發(fā)酵法生產(chǎn)生物乙醇、生物丁醇、生物氫、甲烷等生物能源，因此在微藻生物能源領(lǐng)域具有潛在應(yīng)用價值。然而螺旋藻培養(yǎng)需要消耗大量營養(yǎng)鹽，而營養(yǎng)鹽的生產(chǎn)本身會消耗大量能量并釋放溫室氣體CO₂，造成環(huán)境污染。此外，大量的營養(yǎng)鹽需求(尤其是氮源)將使得微藻培養(yǎng)與農(nóng)業(yè)生產(chǎn)形成營養(yǎng)鹽競爭，不利于微藻培養(yǎng)的可持續(xù)性。

微藻經(jīng)過熱水提取水溶性活性物質(zhì)或經(jīng)過有機(jī)溶劑萃取提取油類物質(zhì)作為生物能源原料后的藻渣含有不溶性蛋白質(zhì)、多糖等有機(jī)物質(zhì)和鐵、鎂、硫、磷等營養(yǎng)元素，經(jīng)過進(jìn)一步水熱處理得到氨基酸、多肽、氨氮、碳水化合物和礦物元素等物質(zhì)可以作為微藻生長所需的氮源、碳源和微量元素來源。利用水熱處理液進(jìn)行微藻培養(yǎng)，不僅回收利用了碳氮磷及礦物質(zhì)等營養(yǎng)物質(zhì)，降低營養(yǎng)鹽的消耗成本，同時也能減少廢物排放量，降低因直接排放而導(dǎo)致水體富營養(yǎng)化的風(fēng)險，具有良好的經(jīng)濟(jì)和環(huán)境效益。

藻渣水熱處理的方法主要有酸熱液化(Hydrothermal acid liquefaction)、中性水熱液化(Hydrothermal liquefaction)和水熱碳化(Hydrothermal carbonization，HTC)。酸熱水解液化所需溫度為100～110℃，常壓下進(jìn)行回流即可，但需要加入鹽酸、硫酸或有機(jī)酸等，對設(shè)備耐腐蝕要求較高，不宜規(guī)模放大。水熱液化通常在250～400℃下進(jìn)行，溫度較高，壓力較大，對能量輸入和設(shè)備要求較高。水熱碳化通常在150～225℃下進(jìn)行，溫度和壓力均較適中，有利于工業(yè)放大。水熱碳化的固相殘?jiān)泻胸S富的油脂和水熱碳，可以作為生物柴油和生物碳的原料。水熱碳化處理液中含有少量氨氮和大量有機(jī)氮源如氨基酸等，同時含有糖類、有機(jī)酸等碳源，在氮限制下大量有機(jī)氮源可以減慢螺旋藻對氮的吸收速率而積累大量多糖。因此HTC處理液是理想的螺旋藻多糖生產(chǎn)的營養(yǎng)來源。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

本發(fā)明旨在提供一種回收利用微藻藻渣中的氮源、碳源和其他營養(yǎng)元素生產(chǎn)富含多糖螺旋藻的方法。為了實(shí)現(xiàn)上述目的，本發(fā)明采用的技術(shù)方案為：

利用水熱碳化回收微藻藻渣中的營養(yǎng)物質(zhì)至水熱碳化液，藻渣中75％以上的氮被回收；利用水熱碳化液回收的氮源、碳源和其他營養(yǎng)元素，完全替代常規(guī)的營養(yǎng)鹽(如硝酸鈉、尿素等)生產(chǎn)富含多糖的螺旋藻，其生物質(zhì)中多糖含量達(dá)到65％以上，比常規(guī)的培養(yǎng)基提高15％～56％，多糖產(chǎn)率比常規(guī)的培養(yǎng)基提高23％到3.5倍；同時利用螺旋藻生產(chǎn)多糖的過程可以清除水熱碳化液中80％以上的無機(jī)氮和45％以上的有機(jī)氮?？砂慈缦虏襟E具體操作：

1)藻渣的水熱碳化

將微藻藻渣與水充分混合攪拌浸潤后，調(diào)節(jié)固液質(zhì)量比1:8～1:30置于不銹鋼高壓反應(yīng)釜中，密封，通入氮?dú)獯祾?min以保持惰性氛圍；以1～3℃/min的速度加熱反應(yīng)釜從室溫至195℃～210℃，恒溫2h～4h；用冷卻循環(huán)水以2～6℃/min的速度冷卻反應(yīng)釜至室溫，打開放氣閥釋放殘余氣體，將反應(yīng)液與固相殘?jiān)蛛x，用0.01-2倍反應(yīng)液體積的水清洗固相殘?jiān)?，并收集合并固液分離后的反應(yīng)液和清洗液，得到水熱碳化液；

步驟1)所述的微藻藻渣可以為冷凍干燥、噴霧干燥或太陽下自然曬干的干燥固體，也可以為濕藻渣漿；微藻藻渣來自于下述方法中的一種或二種以上混合：1)微藻經(jīng)過水浸提后固液分離得到的固體藻渣；2)微藻經(jīng)過有機(jī)溶劑萃取后固液分離得到的固體藻渣；3)微藻先經(jīng)過水浸提后固液分離得到的固體A、固體A再經(jīng)過有機(jī)溶劑萃取后固液分離得到的固體藻渣；4)微藻先經(jīng)過有機(jī)溶劑萃取和固液分離得到的固體A，固體A再經(jīng)過水浸提后固液分離得到的固體藻渣；所述有機(jī)溶劑為氯仿、正己烷、甲醇和乙醇中的一種或二種以上；所述微藻為螺旋藻、集胞藻、聚球藻、湛江等鞭金藻、亞心形四爿藻、微擬球藻、三角褐指藻、萊茵衣藻、小球藻、雨生紅球藻、柵藻、綠球藻中的一種或二種以上；

步驟1)所述與微藻藻渣混合的水和清洗反應(yīng)固相殘?jiān)乃梢詾樽詠硭?、地下水、純凈水或蒸餾水，也可以為微藻培養(yǎng)收獲后的廢水、水提分離純化水溶性活性物質(zhì)和生物能源原料后的殘余廢水中的一種或二種以上的混合。

步驟1)所述的反應(yīng)液與固相殘?jiān)蛛x的方法為重力過濾、膜過濾、離心中的一種或二種以上的組合。

2)水熱碳化液作為營養(yǎng)液培養(yǎng)螺旋藻

將螺旋藻藻種液經(jīng)離心或過濾洗滌后得到的藻泥接入無機(jī)鹽培養(yǎng)基中，并調(diào)整初始接種密度OD₅₆₀為0.3～0.5；或原螺旋藻藻種液經(jīng)無機(jī)鹽培養(yǎng)基直接稀釋至初始接種密度OD₅₆₀為0.3～0.5；向接種后的藻液中添加水熱碳化液，使藻液培養(yǎng)基中的初始總氮濃度控制在10～30mg/L；溫度20～35℃，pH值8～12，自然條件下光照或人工光暗比12h:12h～24h:0h光照，培養(yǎng)液受光面光照強(qiáng)度30～3000μmol/(m²·s)，培養(yǎng)至對數(shù)生長后期或穩(wěn)定期收獲螺旋藻細(xì)胞。

步驟2)所述無機(jī)鹽培養(yǎng)基中每升水體含：NaHCO₃ 3～20g，NaNO₃ 0～18mg，KCl 0～1g，MgSO₄·7H₂O 0～0.1g，CaCl₂·2H₂O 0～0.1g，H₃PO₄(85％w/w)0～0.1g，F(xiàn)eSO₄·7H₂O 0～0.05g，H₃BO₃ 0～3mg，MnCl₂·4H₂O 0～2mg， Na₂MoO₄·2H₂O 0～0.5mg，ZnSO₄·7H₂O 0～0.3mg，CuSO₄·5H₂O 0～0.3mg。

步驟2)所述螺旋藻藻種液為采用上述無機(jī)鹽培養(yǎng)基或Zarrouk培養(yǎng)基培養(yǎng)得到的螺旋藻液，也可以是經(jīng)過步驟2)所述的培養(yǎng)至對數(shù)生長后期或穩(wěn)定期收獲的螺旋藻液，螺旋藻液中的螺旋藻其蛋白質(zhì)含量占干重的20％～70％，碳水化合物含量占干重的5％～70％，其余成分主要為脂質(zhì)、核酸和灰分。

步驟2)所述無機(jī)鹽培養(yǎng)基的水體來源為天然鹽堿水、地下水、自來水或經(jīng)步驟2)所述的藻細(xì)胞收獲后的廢水中的一種或二種以上的混合。

本發(fā)明與現(xiàn)有技術(shù)相比具有如下優(yōu)點(diǎn)：

1.提高氮源利用率，節(jié)約螺旋藻培養(yǎng)成本：利用水熱碳化回收微藻藻渣中的營養(yǎng)物質(zhì)，氮回收率達(dá)到75％以上；以水熱碳化液作為螺旋藻培養(yǎng)的氮源、碳源和其他營養(yǎng)元素，可以完全替代常規(guī)的營養(yǎng)鹽供給(如硝酸鈉、尿素等)，降低營養(yǎng)鹽消耗成本，提高單位營養(yǎng)鹽投入的產(chǎn)品產(chǎn)出；同時將藻渣進(jìn)行廢物資源化循環(huán)利用，有利于提高元素的利用效率，實(shí)現(xiàn)“原子經(jīng)濟(jì)”。

2.螺旋藻多糖產(chǎn)率和含量明顯提高：利用添加了適當(dāng)稀釋的水熱碳化液的培養(yǎng)基培養(yǎng)螺旋藻，生物質(zhì)中多糖含量比常規(guī)的培養(yǎng)基(如添加硝酸鈉)提高15％～56％，多糖產(chǎn)率提高23％到3.5倍。

3.螺旋藻生產(chǎn)的可持續(xù)性好：利用天然鹽堿水培養(yǎng)并循環(huán)利用采收廢水，可以節(jié)約淡水資源，減少污水排放，降低因直接排放而導(dǎo)致水體富營養(yǎng)化的風(fēng)險，同時可以在不適合糧食種植和人類居住的堿湖附近進(jìn)行培養(yǎng)，不占用耕地，具有良好的經(jīng)濟(jì)和環(huán)境效益。

4.實(shí)現(xiàn)含氮廢水的高效處理：本發(fā)明涉及的螺旋藻培養(yǎng)過程可以清除培養(yǎng)水體中80％的氨氮和硝態(tài)氮以及超過45％的有機(jī)氮，在廢水處理領(lǐng)域具有廣泛的應(yīng)用前景。

總之，本發(fā)明實(shí)現(xiàn)了廢物的資源化利用，減少了營養(yǎng)鹽消耗，在提升螺旋藻多糖產(chǎn)率和品質(zhì)的同時節(jié)約了生產(chǎn)成本，同時有利于簡化下游加工操作，促進(jìn)螺旋藻的產(chǎn)業(yè)化生產(chǎn)，可廣泛應(yīng)用于以螺旋藻多糖為原料的食品、醫(yī)藥、能源等相關(guān)領(lǐng)域。

附圖說明

圖1為以高蛋白質(zhì)低碳水化合物含量(蛋白質(zhì)含量42％、碳水化合物含量16％)的螺旋藻為藻種，利用水熱碳化液作為氮源和部分碳源在氮限制條件下培養(yǎng)螺旋藻所獲得的多糖含量和產(chǎn)量。

圖2為以低蛋白質(zhì)高碳水化合物含量(蛋白質(zhì)含量22％、碳水化合物含量53％)的螺旋藻為藻種，利用水熱碳化液作為氮源和部分碳源在氮限制條件下培養(yǎng)螺旋藻所獲得的多糖含量、產(chǎn)量和氮清除效率。

具體實(shí)施方式

下面通過具體實(shí)施例對本發(fā)明的方法和結(jié)果進(jìn)行說明。本發(fā)明將經(jīng)過水提或有機(jī)溶劑萃取后的微藻藻渣進(jìn)行水熱碳化，得到的水熱碳化液(HTC aqueous phase,HTCAP)經(jīng)過適當(dāng)稀釋得到一定總氮濃度的培養(yǎng)基，用于螺旋藻的培養(yǎng) 并生產(chǎn)富含多糖的生物質(zhì)。

實(shí)施例1

以高蛋白質(zhì)低碳水化合物含量(蛋白質(zhì)含量42％、碳水化合物含量16％)的螺旋藻為藻種，利用水熱碳化液作為氮源和部分碳源在氮限制條件下培養(yǎng)螺旋藻，生產(chǎn)富含多糖的生物質(zhì)。

1)在2L不銹鋼高壓反應(yīng)釜內(nèi)，加入1.8L去離子水，將在80℃熱水下提取4h后的高糖螺旋藻(碳水化合物含量44％)藻渣180g緩慢加入反應(yīng)器中，得到固液質(zhì)量比為1:10的均勻藻漿。密封反應(yīng)器，通入氮?dú)獯祾?min以保持惰性氛圍。以1.5℃/min的速度加熱反應(yīng)釜至200℃，恒溫3h。用冷卻循環(huán)水以3℃/min的速度冷卻反應(yīng)釜至室溫。打開放氣閥釋放殘余氣體，將反應(yīng)液用300目的尼龍纖維布過濾，并用300mL去離子水清洗反應(yīng)器和濾餅，收集濾液得到HTCAP，其總氮濃度達(dá)到5741mg/L，氮回收率為78％，-20℃凍存。

2)螺旋藻藻種細(xì)胞在營養(yǎng)豐富的培養(yǎng)基(Zarrouk)中培養(yǎng)，培養(yǎng)基用去離子水配制，每升水體含：NaHCO₃ 16.8g，K₂HPO₄ 0.5g，NaNO₃ 2.5g，K₂SO₄ 1g，NaCl 1g，MgSO₄·7H₂O 0.2g，CaCl₂·2H₂O 0.04g，F(xiàn)eSO₄·7H₂O 0.01g，H₃BO₃2.86mg，MnCl₂·4H₂O 1.86mg，ZnSO₄·7H₂O 0.22mg，Na₂MoO₄·2H₂O 0.39mg，CuSO₄·5H₂O 0.08mg。初始接種密度OD₅₆₀為0.3，培養(yǎng)溫度26～30℃，人工光暗比14h:10h，培養(yǎng)液受光面光照強(qiáng)度40μmol/(m²·s)，培養(yǎng)6天至對數(shù)生長期，用300目的尼龍纖維布過濾得到藻泥，用50mL無機(jī)鹽培養(yǎng)基(MSM，去離子水配制，每升水體含：NaHCO₃ 6g，KCl 0.5g，MgSO₄·7H₂O 0.03g，CaCl₂·2H₂O 0.04g，H₃PO₄(85％w/w)0.03g，F(xiàn)eSO₄·7H₂O 0.01g，H₃BO₃ 2.86mg，MnCl₂·4H₂O 1.86mg，ZnSO₄·7H₂O 0.22mg，Na₂MoO₄·2H₂O 0.39mg，CuSO₄·5H₂O 0.08mg)洗滌2次后重懸于MSM中，調(diào)整初始接種密度OD₅₆₀為0.3，向藻液中加入水熱碳化液，控制初始總氮濃度在15mg/L，并以相同總氮濃度的NaNO₃為對照；溫度25℃，pH值8～9，人工光暗比14h:10h，培養(yǎng)液受光面光照強(qiáng)度40μmol/(m²·s)，培養(yǎng)至第6天收獲。

由圖1可以看出，利用稀釋后的HTCAP作為氮源和部分碳源，在氮限制的條件下進(jìn)行混合營養(yǎng)(mixotrophic)培養(yǎng)螺旋藻，6天內(nèi)多糖平均含量和產(chǎn)率分別達(dá)到73％和81mg/L/d，比常規(guī)用NaNO₃作為氮源進(jìn)行光合自養(yǎng)(photoautotrophic)培養(yǎng)分別提高15％和23％。

此實(shí)施例說明，利用HTC回收熱水提取后的螺旋藻藻渣中的氮源和碳源，在氮限制條件下利用HTCAP完全替代常規(guī)硝態(tài)氮源，以高蛋白質(zhì)低碳水化合物含量的螺旋藻為藻種進(jìn)行培養(yǎng)，其多糖含量和產(chǎn)率均明顯提高。

實(shí)施例2

以低蛋白質(zhì)高碳水化合物含量(蛋白質(zhì)含量22％、碳水化合物含量53％)的螺旋藻為藻種，利用水熱碳化液作為氮源和部分碳源在氮限制條件下培養(yǎng)螺旋藻，生產(chǎn)富含多糖的生物質(zhì)，同時清除培養(yǎng)基中的大部分氨氮和部分有機(jī)氮。

1)水熱碳化回收藻渣中的營養(yǎng)物質(zhì)過程與實(shí)施例1相同。

2)螺旋藻藻種螺旋藻藻種細(xì)胞在營養(yǎng)脅迫的無機(jī)鹽培養(yǎng)基(MSM)中培養(yǎng)，控制初始NaNO₃濃度為85mg/L，初始接種密度OD₅₆₀為0.3，培養(yǎng)溫度26～30℃，人工光暗比14h:10h，培養(yǎng)液受光面光照強(qiáng)度40μmol/(m²·s)，培養(yǎng)6天后藻細(xì)胞處于氮饑餓狀態(tài)，用300目的尼龍纖維布過濾得到藻泥，用50mL無機(jī)鹽培養(yǎng)基(MSM)洗滌2次后重懸于MSM中，調(diào)整初始接種密度OD₅₆₀為0.3，向藻液中加入水熱碳化液，控制初始總氮濃度在15mg/L，并以相同總氮濃度的NaNO₃為對照；溫度25℃，pH值8～9，人工光暗比14h:10h，培養(yǎng)液受光面光照強(qiáng)度40μmol/(m²·s)，培養(yǎng)至第3天收獲。

由圖2可以看出，利用稀釋后的HTCAP作為氮源和部分碳源，在氮限制的條件下進(jìn)行混合營養(yǎng)(mixotrophic)培養(yǎng)螺旋藻，3天內(nèi)多糖平均含量和產(chǎn)率分別達(dá)到65％和58mg/L/d，比常規(guī)用NaNO₃作為氮源進(jìn)行光合自養(yǎng)(photoautotrophic)培養(yǎng)分別提高56％和3.6倍。氨氮的清除率達(dá)到總氮(TN)的80.4％，有機(jī)氮的清除率達(dá)到47.0％。

此實(shí)施例說明，利用HTC回收熱水提取后的螺旋藻藻渣中的氮源和碳源，在氮限制條件下利用HTCAP完全替代常規(guī)硝態(tài)氮源，以低蛋白質(zhì)高碳水化合物含量的螺旋藻為藻種進(jìn)行培養(yǎng)，其多糖含量和產(chǎn)率均明顯提高的同時可以清除80％以上的氨氮和45％以上的有機(jī)氮，在廢水處理領(lǐng)域具有廣泛的應(yīng)用前景。