本發(fā)明屬于生物技術(shù)領(lǐng)域，涉及兩株土壤有益菌及其酶，菌株為施氏假單胞菌（Pseudomonas stutzeri JF-1）和解淀粉芽孢桿菌(Bacillus amyloliquefaciens JF-2)。

背景技術(shù)：

狹義的生物肥料，是通過微生物生命活動，使農(nóng)作物得到特定的肥料效應的制品，也被稱之為接種劑或菌肥，它本身不含營養(yǎng)元素，不能代替化肥。廣義地生物肥料稱之為生物有機肥，是既含有作物所需的營養(yǎng)元素，又含有微生物的制品，是生物、有機、無機的結(jié)合體它可以代替化肥，提供農(nóng)作物生長發(fā)育所需的各類營養(yǎng)元素。

目前，國內(nèi)液體肥生產(chǎn)，實際上是微生物菌劑的水溶肥。而普遍采用固體堆肥發(fā)酵罐方法生產(chǎn)生物有機肥，是在人工控制下，在一定的溫度、濕度、碳氮比和通風條件下，利用自然界廣泛分布的細菌、放線菌、真菌等微生物的發(fā)酵作用，人為地促進可生物降解的有機物向穩(wěn)定的腐殖質(zhì)生化轉(zhuǎn)化的微生物學過程，即人們常說的有機肥腐熟過程?，F(xiàn)代化堆肥發(fā)酵罐工藝基本都是好氧堆肥，這是因為好氧堆肥具有溫度高、基質(zhì)分解比較徹底、堆制周期短、異味小、可以大規(guī)模采用機械處理等優(yōu)點。我國已獲得國家批準登記的微生物肥料有100余種，全國微生物肥料企業(yè)總數(shù)約950個，年產(chǎn)量1000萬噸，年產(chǎn)值已達150億元。但由于科研投入嚴重不足，技術(shù)力量相對滯后于市場需求，導致若干類微生物肥料產(chǎn)品發(fā)酵生產(chǎn)過程的質(zhì)量監(jiān)控指標設置不盡合理，對產(chǎn)品穩(wěn)定性和大田應用效果無法把控。農(nóng)業(yè)“回歸有機肥”，仍然任重而道遠。雖然我國針對生物肥料（微生物肥料）的研發(fā)、產(chǎn)品質(zhì)量、推廣應用等方面非常重視，監(jiān)管方面實行生產(chǎn)許可制度并由農(nóng)業(yè)部審核并發(fā)放。但隨著生物肥料的發(fā)展，不少地方在生產(chǎn)生物肥料時出現(xiàn)了無生產(chǎn)許可證、生產(chǎn)工藝落后、用未通過鑒定的菌種進行生產(chǎn)、有效菌含量低、雜菌超標等現(xiàn)象。還有些廠家在生物肥料中加入不適量的化肥或其它添加劑，使肥料中化肥的氮、磷、鉀含量過高導致有效菌死亡，而失去生物肥的作用。

技術(shù)實現(xiàn)要素：

本發(fā)明通過土壤-植物-大氣系統(tǒng)研究有益微生物，從根際土壤中分離出三株以上有益微生物菌劑，目的是將在土壤內(nèi)自然生成促進植物生長的微生物生長環(huán)境和抑制或減少有害病原菌對植物的侵害有決定性意義的的三株菌，在自制反應釜設備在適宜環(huán)境溫度和供氧的條件下，通過適宜的營養(yǎng)元素和C:N基質(zhì)（馬糞或牛糞）培養(yǎng)，生成液體生物肥。

本發(fā)明的目的通過如下技術(shù)方案實現(xiàn)：

本發(fā)明提供兩株土壤有益菌，保藏編號為JF-1和JF-2，其基因序列如SEQ ID No.1和SEQ ID No.2所示。

本發(fā)明提供三株土壤有益菌用于制備液體生物肥的酵劑，其中的JF-1、JF-2、菌的活菌數(shù)均為10⁹～10¹⁰CFU/ml。

本發(fā)明的三株土壤有益菌劑加入以牛糞或馬糞的基質(zhì)后，通過自制反應釜設備在適宜環(huán)境溫度和供氧的條件下生成的液體生物肥中JF-1和JF-2的活菌數(shù)分別為10⁷～10⁸CFU/ml。

JF-1和JF-2的發(fā)酵培養(yǎng)基牛糞或馬糞由以下成分組成：

牛糞、馬糞營養(yǎng)元素含量（一般情況）

牛糞或馬糞的C:N 為30-50:1作為JF-1和JF-2的培養(yǎng)基是最適宜的。

本發(fā)明中JF-1和JF-2菌的發(fā)酵的環(huán)境條件為：自制反應釜內(nèi)筒培養(yǎng)基（牛糞或馬糞）體積0.5m³,外筒水體積1.5m³;發(fā)酵環(huán)境溫度為30-40℃;發(fā)酵時間為12-30h；初始pH值為6.5-7.5；初始接種量為1-3%，通氣量40.0L(L/min）。

優(yōu)化工藝：發(fā)酵環(huán)境溫度35℃；pH值為7.0；初始接種量為2%；通氣量40.0L(L/min）；發(fā)酵時間27h（穩(wěn)定期）。

有益效果

本發(fā)明生成的液體生物肥，施入土壤后促進固氮菌類生長成為較強的固氮體系；

本發(fā)明有利于釋放難溶礦質(zhì)中的營養(yǎng)元素菌類生長；

本發(fā)明有利于提高植物的抗逆性菌類生長；

本發(fā)明有利于降解污染物，減少毒性菌類生長；

本發(fā)明有利于促進腐質(zhì)酸的形成菌類生長；

本發(fā)明有利于產(chǎn)生植物激素菌類生長；

本發(fā)明有利于生防菌類生長。

本發(fā)明的三株土壤有益菌JF-1、JF-2、JF-3作為發(fā)酵劑，對牛糞或馬糞進行處理，增加植物對牛糞或馬糞中營養(yǎng)元素的有效吸收。

附圖說明

圖1是液體生物肥試驗田和對照田大白菜播種10天后的對照圖；圖的上方是液體生物肥試驗田，圖的下方是對照田

具體實施方式

通過以下實施例對本發(fā)明的生物液體肥料的制備工藝和應用進行詳述，所述說明是描述性的，并不限制本發(fā)明的保護范圍。

實施例1 兩種菌的高密度發(fā)酵及液體復合微生態(tài)制劑的制備

1、施氏假單胞菌高密度發(fā)酵液的制備：1）平板培養(yǎng)復壯：將施氏假單胞菌菌種接種于LB平板培養(yǎng)基上，于30℃培養(yǎng)18h，使施氏假單胞菌復壯，并形成單菌落，挑取單菌落于接種培養(yǎng)基上，30℃培養(yǎng)24h；2)一級種子的制備：將步驟1）培養(yǎng)的施氏假單胞菌菌種轉(zhuǎn)接茄子瓶LB斜面培養(yǎng)基上，30℃培養(yǎng)16h，使處于對數(shù)后期，得一級種子；3）二級種子的制備：將步驟2）制備的一級種子用無菌水制成菌懸液，接種到裝有60L LB種子培養(yǎng)基的100L種子罐中，溫度30℃，轉(zhuǎn)速250rpm，罐壓0.05MPA，通風比：1：0.6，培養(yǎng)146,得二級種子液。4）施氏假單胞菌發(fā)酵液的制備：將步驟3）制備的二級種子液按照5%的接種量接種到10m³發(fā)酵培養(yǎng)基的發(fā)酵罐中，溫度30℃，轉(zhuǎn)速200rpm，罐壓0.05Mpa，通風比：1：0.6，培養(yǎng)16h，活菌數(shù)為3.2×10⁹CFU/ml的施氏假單胞菌發(fā)酵液；所述的發(fā)酵培養(yǎng)基為：胰蛋白胨10g，酵母提取物5g、氯化鈉10g,去離子水1000ml,pH為7.0。2、解淀粉芽孢桿菌高密度發(fā)酵液的制備：1）平板培養(yǎng)復壯：將解淀粉芽孢桿菌菌種接種于BPY平板培養(yǎng)基上，于30℃培養(yǎng)24h，使解淀粉芽孢桿菌復壯，并形成單菌落，挑取單菌落于接種培養(yǎng)基上，30℃培養(yǎng)24h；2)一級種子的制備：將步驟1）培養(yǎng)的解淀粉芽孢桿菌菌種轉(zhuǎn)接茄子瓶BPY斜面培養(yǎng)基上，37℃培養(yǎng)24h，使處于對數(shù)后期，得一級種子；3）二級種子的制備：將步驟2）制備的一級種子用無菌水制成菌懸液，接種到裝有60L BPY種子培養(yǎng)基的100L種子罐中，溫度30℃，轉(zhuǎn)速300rpm，罐壓0.05MPA，通風比：1：1培養(yǎng)14h,得二級種子液。4）解淀粉芽孢桿菌發(fā)酵液的制備：將步驟3）制備的二級種子液按5%的接種量接種到600L發(fā)酵培養(yǎng)基的1m³發(fā)酵罐中，溫度30℃，轉(zhuǎn)速300rpm，罐壓0.05Mpa，通風比1：1，培養(yǎng)16h，得芽孢生成率90%以上，活菌數(shù)為5×10⁹cfu/ml的枯草芽孢桿菌發(fā)酵液；所述的發(fā)酵培養(yǎng)基為（質(zhì)量百分比）：蔗糖1.0%，蛋白胨1.0%、酵母浸粉 0.5%，硫酸銨0.2%，硫酸鎂0.04%；硫酸錳 0.08%、消泡劑0.06%，pH為6.8。3、生物液體肥料發(fā)酵劑的制備：將1和2制得到的發(fā)酵液按1：1的比例混合均勻后調(diào)節(jié)pH至7.0左右，進行灌裝，每瓶1000mL,加10%氯化鈉，制得菌數(shù)大概在4.0×10⁹CFU/ml的液體肥料發(fā)酵劑。

實施例2 生物液體肥料制備工藝

將實例1制得的發(fā)酵菌劑按照1%的接種量添加到牛糞或馬糞反應釜內(nèi)，初始pH7.0，發(fā)酵溫度控制在30～37℃，通氣量40.0L(L/min），發(fā)酵時間為12～30h，發(fā)酵結(jié)束后，JF-1和JF-2的活菌數(shù)在10⁷～10⁸CFU/ml。液體肥料顏色深棕色或醬油色，固形物含量約3～5%。液體肥料采用塑料制品包裝，包裝規(guī)格1000ml/瓶。

自制反應釜內(nèi)筒培養(yǎng)基（牛糞或馬糞）體積0.5m³,外筒水體積1.5m³，帶有溫度控制系統(tǒng)和壓縮空氣通氣裝置。

實施例4 生物液體肥料應用試驗

在通州國際種業(yè)園區(qū)和順義農(nóng)科所大孫各莊趙家峪基地設置土壤培肥試驗基地：糧田為夏玉米和冬小麥輪作，露地菜田為白菜和茄子輪作。作物品種：冬小麥農(nóng)大211、夏玉米京單28，大白菜為新3號、茄子為黑寶。兩地糧田、菜田試驗種植面積均為0.5畝。使用10天后，生物液體肥料試驗田與對照組相比，種植作物出芽率提高10%，達到90%出芽率；作物高度比對照組高3～5cm,達到8～10cm，作物生長整齊度顯著提高；莖葉當中葉綠素含量實驗組比對照組高10%。試驗田與對照田生長情況如圖1所示。