本發(fā)明涉及抗體工程領(lǐng)域，具體涉及針對蛋白E2-2的單克隆抗體。

背景技術(shù)：

E2-2是E蛋白家族的一員，又名TCF4(Transcription factor 4)，從屬于bHLH(basic helix-loop-helix)轉(zhuǎn)錄因子超家族[1]。

人E2-2基因有41個外顯子，在18號染色體18q21.2。作為單體E2-2沒有DNA結(jié)合活性，但是和其它蛋白形成同源二聚體或異源二聚體，可以結(jié)合DNA并發(fā)揮轉(zhuǎn)錄活性[2]。E2-2有多個可變剪接的轉(zhuǎn)錄本，對應(yīng)編碼不同的蛋白質(zhì)。Sepp等人研究人E2-2基因的可變剪接轉(zhuǎn)錄本調(diào)節(jié)E2-2基因結(jié)構(gòu)、表達(dá)和編碼潛力的作用。他們發(fā)現(xiàn)人E2-2在腦里表達(dá)的特別高，通過使用大量的5’端外顯子可以形成不同的蛋白亞型，有18種不同的N端。他們也觀察到內(nèi)部外顯子的可變剪接，可形成更多的轉(zhuǎn)錄本。功能分析顯示，不同的E2-2蛋白亞型有不同的亞細(xì)胞定位：含有核定位信號(Nuclear localization signal，NLS)的蛋白亞型定位在細(xì)胞核中，其它的在細(xì)胞質(zhì)中也能檢測到。沒有NLS的蛋白亞型可能通過結(jié)合一些含有NLS的bHLH蛋白進(jìn)入細(xì)胞核。沒有NLS的亞型還可能通過結(jié)合一些含有核輸出信號(Nuclear export signal，NES)的蛋白離開細(xì)胞核，被運輸?shù)郊?xì)胞質(zhì)中[3]。E2-2可以和鈣調(diào)蛋白結(jié)合，可能參與到Ca2⁺信號的調(diào)節(jié)。在體外和生理條件一致的Ca2⁺濃度下，E2-2和E2A蛋白堿性區(qū)域的N端序列能結(jié)合鈣調(diào)蛋白，其DNA結(jié)合的活性將被抑制[4]。增加胞內(nèi)Ca2+濃度或者過表達(dá)鈣調(diào)蛋白，都可以抑制E2-2的轉(zhuǎn)錄活性。Ca2+信號可能通過形成E蛋白-鈣調(diào)蛋白復(fù)合物阻止E蛋白結(jié)合目的DNA[5]。

E2-2主要表達(dá)在人漿細(xì)胞樣樹突狀細(xì)胞(pDCs)中，髓樣樹突狀細(xì)胞(DCs)和前體細(xì)胞均不表達(dá)。在人胸腺前體細(xì)胞中過表達(dá)E2-2可刺激pDCs的發(fā)育，通過RNA干擾抑制E2-2表達(dá)可有效抑制前體細(xì)胞向pDCs發(fā)育[6]。在CD34+造血祖細(xì)胞中過表達(dá)Id2或Id3可通過抑制E蛋白活性進(jìn)而抑制pDCs發(fā)育，不影響DCs發(fā)育[7]。E2-2和SpiB可以協(xié)同作用，在前體細(xì)胞中同時過表達(dá)二者可進(jìn)一步刺激pDCs發(fā)育[6]。研究認(rèn)為Pitt-Hopkins綜合征(PHS)和E2-2單等位基因突變有關(guān)[3]。檢測病人血液可以發(fā)現(xiàn)pDC數(shù)量減少，BDCA2基因表達(dá)下調(diào)，而且產(chǎn)生干擾素的能力被阻斷，PHS病人持續(xù)的呼吸道感染可能就是由pDC的缺陷引起的[1,8]。

另外，母細(xì)胞性漿細(xì)胞樣樹突狀細(xì)胞淋巴瘤(BPDCN)是一種罕見的起源于漿細(xì)胞樣樹突狀前體細(xì)胞的惡性腫瘤。BPDCN細(xì)胞表達(dá)pDCs特異性分子BDCA2、CD123、CD4、TCL1、Bcl11A、CD2AP和Spi-B[9-11]。因為BPDCN細(xì)胞表達(dá)髓系分子CD56，BPDCN曾被認(rèn)為是母細(xì)胞性NK細(xì)胞淋巴瘤，直到pDCs發(fā)現(xiàn)以后，根據(jù)BPDCN的分子標(biāo)志和部分功能，將其歸為母細(xì)胞性漿細(xì)胞樣樹突狀細(xì)胞淋巴瘤[9]。有文章報道，Spi-B可以作為BPDCN的診斷標(biāo)志物[12]。

在中樞神經(jīng)系統(tǒng)里，E2-2主要表達(dá)在前腦、間腦和小腦中。E2-2對神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞分化，尤其是少突膠質(zhì)細(xì)胞前體的成熟，非常重要[13]。在出生后的脊髓中，E2-2僅表達(dá)在少突膠質(zhì)細(xì)胞中，隨著髓鞘形成逐漸減少。E2-2可以和一系列bHLH轉(zhuǎn)錄因子形成異二聚體參與神經(jīng)系統(tǒng)發(fā)育的調(diào)節(jié)，例如ATOH1(Atonal homolog 1，別名MATH1)，在分化中的神經(jīng)上皮里表達(dá)[14]；ASCL1(Achaete-scute complex homolog 1，小鼠中別名MASH-1，人里別名HASH-1)，對中樞神經(jīng)系統(tǒng)特別是前腦神經(jīng)元回路的形成是必須的[15]；Id1對正確進(jìn)行神經(jīng)元發(fā)生是必須的[16]；Olig2調(diào)節(jié)腹側(cè)神經(jīng)外胚層前體細(xì)胞命運，對少突膠質(zhì)細(xì)胞和運動神經(jīng)元的發(fā)育是必須的[13]；NEUROD2(別名NDRF)，對神經(jīng)元分化和生存非常重要[17]。通過參與到這樣一個交錯聯(lián)合的調(diào)節(jié)網(wǎng)絡(luò)，E2-2對中樞神經(jīng)系統(tǒng)的發(fā)育進(jìn)行調(diào)節(jié)。E2-2突變將導(dǎo)致神經(jīng)發(fā)育失調(diào)相關(guān)的多種疾病[18]。

Pitt-Hopkins綜合征是一種罕見的神經(jīng)發(fā)育失調(diào)的疾病，病人的學(xué)習(xí)和記憶能力有嚴(yán)重缺陷，語言學(xué)習(xí)能力幾乎完全缺失，表現(xiàn)為智力殘疾，非典型性自閉和過度換氣，被稱為“孤兒病”。研究認(rèn)為PHS和E2-2單等位基因突變有關(guān)，PHS病人僅有正常量一半的E2-2，這說明PHS對E2-2劑量很敏感。引起PHS的E2-2基因突變是非常多樣的，有整個基因的刪除，部分基因的刪除，讀碼框移碼(包括終止密碼子提前出現(xiàn))，無義突變，剪接位點突變和錯義突變。目前為止，幾乎所有的病例都有自己獨特的E2-2基因突變，只有極少數(shù)病例的E2-2基因突變相同。錯義突變一般出現(xiàn)在結(jié)合DNA調(diào)節(jié)元件的bHLH結(jié)構(gòu)域，它是一個突變熱點，約15％的PHS病例是這種情況。約40％的PHS病例是點突變導(dǎo)致的終止密碼子提前出現(xiàn)[19-21]。

遺傳流行病學(xué)研究顯示，精神分裂癥是遺傳的可能性高達(dá)80％[22]?；蚪M關(guān)聯(lián)分析發(fā)現(xiàn)，E2-2附近兩個遺傳位點的變異可能有患精神分裂癥的風(fēng)險。檢查精神病人血液中的E2-2水平，是顯著減少的。剖析14個精神分裂癥病人組的小腦皮質(zhì)區(qū)，發(fā)現(xiàn)和6個對照組相比，E2-2表達(dá)是上調(diào)的。但是也有研究事后剖析比較三個腦部區(qū)域，發(fā)現(xiàn)E2-2的mRNA水平和精神分裂癥沒有關(guān)聯(lián)[23]。Navarrete等人檢測了106個精神分裂癥病人組和96個對照組的淋巴細(xì)胞，發(fā)現(xiàn)病人組的E2-2mRNA水平比對照組低約20％[24]。

研究顯示，Pitt-Hopkins綜合征、精神分裂癥、有pDC浸潤的實體腫瘤、母細(xì)胞性漿樣樹突狀細(xì)胞淋巴瘤等疾病，都與pDCs相關(guān)，那么如果要鑒定這些疾病，就需要準(zhǔn)確快速鑒定pDCs。pDCs的特異性標(biāo)志物有CD123、BDCA2、Spi-B、E2-2等，CD123即可以識別pDCs，也識別血管內(nèi)皮細(xì)胞；BDCA2和Spi-B雖然有組織化學(xué)抗體，但是并沒有被廣泛應(yīng)用；而關(guān)于E2-2，目前還沒有針對其的單克隆抗體。E2-2是pDCs的轉(zhuǎn)錄因子，蛋白表達(dá)和篩選單克隆抗體非常有難度，我們根據(jù)E2-2蛋白的特點，純化了非全長E2-2的蛋白，利用免疫組化的方法篩選單克隆抗體。篩選得到E2-2單克隆抗體，不僅有利于基礎(chǔ)科學(xué)的研究，而且在pDCs相關(guān)疾病中的鑒定中發(fā)揮重要作用。

技術(shù)實現(xiàn)要素：

本發(fā)明涉及以下各項：

1.一種針對蛋白E2-2的單克隆抗體，所述抗體通過以下步驟制備：

1)重組表達(dá)E2-2或其片段；

2)用所述重組表達(dá)E2-2或其片段免疫小鼠；

3)將免疫后小鼠的脾細(xì)胞與鼠骨髓瘤細(xì)胞融合；

4)篩選上清特異識別蛋白E2-2或其片段的單克隆。

2.一種雜交瘤細(xì)胞，所述雜交瘤細(xì)胞分泌特異識別蛋白E2-2或其片段的單克隆抗體。

3.根據(jù)第1項所述的單克隆抗體或權(quán)利要求2所述的雜交瘤細(xì)胞，其中，所述單克隆抗體利用E2-2片段免疫、篩選得到，所述E2-2片段由SEQ ID NO：1所示核苷酸序列編碼。

4.一種抗人E2-2的單克隆抗體雜交瘤細(xì)胞株，所述雜交瘤細(xì)胞保藏在中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心，保藏號為CGMCC No.11494，名稱為E2-2 2G8。

5.一種針對蛋白E2-2的單克隆抗體，所述抗體由第4項所述的雜交瘤細(xì)胞分泌。

6.第1-5任一項所述的抗體或雜交瘤細(xì)胞在制備用于檢測蛋白E2-2的試劑盒中的用途。

7.第1-5任一項所述的抗體或雜交瘤細(xì)胞在制備用于診斷各種pDC相關(guān)的疾病的試劑盒中的用途。

8.根據(jù)第7項所述的用途，所述疾病包括Pitt-Hopkins綜合征、精神分裂癥、有pDC浸潤的實體腫瘤、母細(xì)胞性漿樣樹突狀細(xì)胞淋巴瘤、其它與pDC頻率變化相關(guān)的疾病。

具體地，本發(fā)明利用原核表達(dá)系統(tǒng)表達(dá)E2-2(TCF4)蛋白，免疫Balb/c小鼠，利用ELISA和免疫組化方法，篩選得到一株雜交瘤細(xì)胞株E2-2 2G8，能夠產(chǎn)生特異性結(jié)合人E2-2蛋白的單克隆抗體。在免疫酶學(xué)檢測(ELISA)、免疫印跡(Western)和免疫組化實驗中，E2-2 2G8抗體能夠特異性的結(jié)合E2-2。

本發(fā)明利用分子克隆方法，克隆得到表達(dá)部分基因的E2-2(TCF4)真核表達(dá)載體。利用真核表達(dá)系統(tǒng)表達(dá)了部分E2-2(TCF4)的蛋白。用60ugE2-2蛋白聯(lián)合CpG免疫Balb/c小鼠，獲得雜交瘤細(xì)胞。利用ELISA和免疫組化方法，篩選得到一株抗人E2-2的單克隆抗體雜交瘤細(xì)胞株，為E2-2 2G8，其亞型為IgG2a。該雜交瘤細(xì)胞已于2015年11月9日保藏在中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心，保藏號為CGMCC No.11494，名稱為E2-2 2G8。通過免疫組化證實其分泌的單克隆抗體E2-2 2G8識別組織中pDCs。

其中本發(fā)明人采用了E2-2的片段進(jìn)行單克隆抗體的篩選，該片段的編碼序列如SEQ ID NO：1所示。

CTAGAAATGGAGGACAGGCCTCATCGTCTCCTAATTATGAAGGACCCTTACACTCTTTGCAAAGCCGAATTGAAGATCGTTTAGAAAGACTGGATGATGCTATTCATGTTCTCCGGAACCATGCAGTGGGCCCATCCACAGCTATGCCTGGTGGTCATGGGGACATGCATGGAATCATTGGACCTTCTCATAATGGAGCCATGGGTGGTCTGGGCTCAGGGTATGGAACCGGCCTTCTTTCAGCCAACAGACATTCACTCATGGTGGGGACCCATCGTGAAGATGGCGTGGCCCTGAGAGGCAGCCATTCTCTTCTGCCAAACCAGGTTCCGGTTCCACAGCTTCCTGTCCAGTCTGCGACTTCCCCTGACCTGAACCCACCCCAGGACCCTTACAGAGGCATGCCACCAGGACTACAGGGGCAGAGTGTCTCCTCTGGCAGCTCTGAGATCAAATCCGATGACGAGGGTGATGAGAACCTGCAAGACACGAAATCTTCGGAGGACAAGAAATTAGATGACGACAAGAAGGATATCAAATCAATTACTAGGTCAAGATCTAGCAATAATGACGATGAGGACCTGACACCAGAGCAGAAGGCAGAGCGTGAGAAGGAGCGGAGGATGGCCAACAATGCCCGAGAGCGTCTGCGGGTCCGTGACATCAACGAGGCTTTCAAAGAGCTCGGCCGCATGGTGCAGCTCCACCTCAAGAGTGACAAGCCCCAGACCAAGCTCCTGATCCTCCACCAGGCGGTGGCCGTCATCCTCAGTCTGGAGCAGCAAGTCCGAGAAAGGAATCTGAATCCGAAAGCTGCGTGTCTGAAAAGAAGGGAGGAAGAGAAGGTGTCCTCAGAGCCTCCCCCTCTCTCCTTGGCCGGCCCACACCCTGGAATGGGAGACGCATCGAATCACATGGGACAGATGTAA

利用免疫印跡(Western)方法，證實E2-2 2G8可以特異性結(jié)合pDCs細(xì)胞系Gen2.2中的E2-2蛋白。

附圖說明

圖1 E2-2基因表達(dá)質(zhì)粒

圖2 E2-2蛋白濃縮的鑒定

上樣順序：

0.蛋白marker

1.BSA 2ug

2.BSA 4ug

3.E2-2half 2ug

4.E2-2half 4ug

圖3單克隆抗體E2-2 2G8識別E2-2蛋白

A.Marker

B.E2-2 2G8和內(nèi)參Tubulin

圖4 E2-2 2G8識別扁桃體中的pDC細(xì)胞

圖5 E2-2 2G8識別銀屑病組織中的pDC細(xì)胞(IF)

圖6 E2-2 2G8識別疾病組織中的pDC細(xì)胞

具體實施方式

實施例1質(zhì)粒構(gòu)建與蛋白表達(dá)

質(zhì)粒構(gòu)建與誘導(dǎo)表達(dá)

從人腦cDNA文庫(Invitrogen)中pCR得到E2-2全長基因，引物序列是5’-GAGTGTCTCCTCTGGCAGC-3’和5’-CCATGTGATTCGATGCGTC-3’，利用XbaI和XhoI內(nèi)切酶(NEB公司)得到E2-2一段基因(NM_001083962.1片段1700-2628)，克隆至pET28a(invitrogen)中，即pET28a-E2-2half(如圖1所示)。。

將構(gòu)建的質(zhì)粒轉(zhuǎn)入BL21感受態(tài)，涂布平板，挑菌在100ml培養(yǎng)基中搖菌過夜后，接入1L的培養(yǎng)基中(1：100)搖菌3h至OD在0.6左右，降溫至16度，加IPTG(1mM)誘導(dǎo)16h收菌。

蛋白的純化

離心收集誘導(dǎo)好的菌，加入蛋白酶抑制(sigma)，利用超聲波破碎，離心收集上清，利用HIS標(biāo)簽鎳柱純化。

對于帶His標(biāo)簽的蛋白用鎳柱進(jìn)行純化，方法如下：(1)組裝鎳柱：在純化柱中加入2毫升的純化介質(zhì)瓊脂糖(GE)。取100uM的硫酸鎳10毫升加入介質(zhì)上層，使液體自然留下。(2)用20毫升的結(jié)合緩沖液(20mM Na2HPO4/0.5M NaCl)沖洗鎳柱，平衡柱子。(3)將收集上清用結(jié)合緩沖液等體積稀釋，加入鎳柱上，收集流出液體。流出液體可再次加到鎳柱上，進(jìn)行蛋白的再次結(jié)合。(4)用100毫升清洗緩沖液(20mM Na2HPO4/0.5MNaCl/10mM咪唑/PH7.4)沖洗鎳柱，洗掉非特異性結(jié)合蛋白。(5)用10毫升洗脫緩沖液(500mM NaCl/20mM Tris堿/1M咪唑PH 7.9)洗脫蛋白，收集洗脫的流出液，即目的蛋白，作為免疫原的E2-2蛋白。(6)蛋白電泳，考馬斯亮藍(lán)染色(如圖2所示)檢測純化的蛋白濃度。

實施例2單克隆抗體制備與鑒定

小鼠免疫流程

E2-2的免疫原準(zhǔn)備好之后，免疫用來制備單克隆抗體的小鼠。過程如下：(1)準(zhǔn)備6～7周的BABL/c小鼠(維通利華)三只。(2)取60ugE2-2蛋白與20mg CpG1826(invitrogen)混合，體積調(diào)至500uL生理鹽水中混勻，腹腔注射至小鼠體內(nèi)。(3)每四周免疫一次，完成三次免疫。(4)在第三次免疫后一周采血，用E2-2蛋白進(jìn)行包被96孔板，ELISA的方法檢測血清中的E2-2抗體的滴度。(5)用E2-2蛋白進(jìn)行第四次加強(qiáng)免疫，3天后進(jìn)行雜交瘤細(xì)胞融合。

雜交瘤細(xì)胞融合與篩選

雜交瘤細(xì)胞的融合方法：(1)將加強(qiáng)免疫后的小鼠，摘眼球采血，在室溫放置30分鐘后，然后放在4℃靜置過夜。待第二天低速離心，取小鼠的血清分裝凍存。(2)在10cm的培養(yǎng)皿中，加入10毫升RPMI 1640培養(yǎng)基。取小鼠脾臟用剪刀剪成細(xì)小碎片，然后用無菌蓋玻片的磨砂面進(jìn)行充分研磨，得到細(xì)胞懸液。用吸管進(jìn)行反復(fù)吹打，盡量使之成為單細(xì)胞懸液。用0.45um的濾膜進(jìn)行過濾至50毫升離心管中。(3)離心后，棄掉上清液，輕彈細(xì)胞沉淀使疏松，加入2毫升紅細(xì)胞裂解液處理。2分鐘后加入50毫升RPMI1640培養(yǎng)基，快速離心。用PBS洗兩遍后進(jìn)行細(xì)胞計數(shù)，約3×10⁸個脾細(xì)胞。(4)取4個T75的sp20細(xì)胞，細(xì)胞計數(shù)得到sp20細(xì)胞約3×10⁸個。PBS洗三遍，200g/分鐘室溫離心10分鐘。(5)將sp20細(xì)胞和脾細(xì)胞按1:1～1:3的比例進(jìn)行混合。1500轉(zhuǎn)/分鐘，室溫離心10分鐘。棄掉上清，輕彈細(xì)胞沉淀使疏松。(6)準(zhǔn)備37℃水浴，將細(xì)胞置于水浴中，邊晃動50毫升離心管，邊逐滴加入預(yù)熱的2毫升PEG 2000。(7)加入預(yù)熱的40毫升RPMI 1640培養(yǎng)基重懸細(xì)胞。上下顛倒使細(xì)胞混勻。1500轉(zhuǎn)/分鐘，室溫離心10分鐘。(8)去掉上清，置細(xì)胞于37℃水浴中，加入含HAT的完全培養(yǎng)基10毫升/板，上下顛倒混勻。每孔加入2滴液體約100微升。(9)培養(yǎng)約一周左右，待每個克隆增殖到10個細(xì)胞左右，進(jìn)行ELISA檢測。

ELISA方法檢測

ELISA方法檢測上清中的E2-2抗體，(1)用實施例1中制備的E2-2蛋白包被96孔ELISA板，蛋白用PBS稀釋至終濃度5μg/mL，每孔加入100μL，4℃包被過夜。(2)用洗液(PBS/0.05tween20/PH7.5，sigma)清洗一次，每孔加入200μL封閉液(PBS/0.5％BSA/PH7.5)，室溫封閉2h。(3)用洗液清洗三次，加入100μL免疫E2-2蛋白的小鼠血清(需要按照10倍稀釋，即10000,50000，100000,500000,1000000)和100μL相應(yīng)的待測樣品(即細(xì)胞培養(yǎng)上清)，搖床混勻，100轉(zhuǎn)/min室溫作用2h。(4)用洗液清洗三次，每孔加入100μL生物素標(biāo)記的檢測山羊抗小鼠IgG的抗體(中杉金橋)，室溫作用1h。(5)用洗液清洗三次，每孔加入100μL streptavidin標(biāo)記的辣根過氧化物酶試劑(中杉金橋)，室溫作用1h。(6)用洗液清洗三次，每孔加入100μL TMB底物，搖床混勻，100轉(zhuǎn)/min室溫作用10min。待最高濃度的標(biāo)準(zhǔn)蛋白孔呈現(xiàn)深藍(lán)色，每孔加入50μL終止液(2M硫酸)。(7)分光光度計記錄450.1nm波長下的光吸收值，即OD值，選擇高于小鼠多抗值用于免疫組化檢測(小鼠多抗來源于免疫E2-2蛋白的小鼠血清)。

通過ELISA方法，我們篩選得到E2-2抗體1G4、1G6、2G8、4B5和10F7克隆，OD值明顯高于小鼠多抗。為了進(jìn)一步驗證抗體，進(jìn)行了免疫組化實驗。

SDS-PAGE和免疫印跡實驗

(1)蛋白樣品加入5×SDS buffer，100℃煮樣5min，進(jìn)行SDS-PAGE電泳。

(2)如無需做western實驗，電泳完成后蛋白膠直接用考馬斯亮藍(lán)染色，脫色后觀察實驗結(jié)果(圖2實驗)，如需進(jìn)行western實驗，則進(jìn)入步驟(3)。

(3)轉(zhuǎn)膜：將樣品從膠上轉(zhuǎn)移到PVDF膜上，250mA恒流，2h。

(4)封閉：PVDF膜室溫下用Blocking buffer(PBS/0.5％BSA/PH7.5)封閉1h。

(5)一抗孵育：加入適量一抗抗體(E2-2 2G8：濃度為1-5ng/mL)，4℃孵育過夜。

(6)漂洗：用TBST清洗PVDF膜三次，每次10min。

(7)二抗孵育：加入對應(yīng)的二抗(辣根過氧化物酶標(biāo)記的山羊抗小鼠IgG的抗體，中杉金橋)，室溫孵育1h。

(8)漂洗：用TBST清洗PVDF膜三次，每次10min，最后用TBS清洗一次。

(9)洗片：PVDF膜用辣根過氧化物酶的底物(密理博公司)孵育3min，在暗室中經(jīng)壓片，顯影，定影，清洗，晾干等步驟得到實驗結(jié)果(圖3)。

免疫組化方法檢測

ELISA檢測OD值較高的克隆1G4、1G6、2G8、4B5和10F7，用免疫組織化學(xué)染色進(jìn)一步檢測。因為pDCs細(xì)胞高表達(dá)E2-2蛋白，所以選用扁桃體組織檢測E2-2。(1)脫蠟和水化：二甲苯Ⅰ、二甲苯Ⅱ、二甲苯Ⅲ、二甲苯Ⅳ中各浸泡5分鐘，無水乙醇Ⅰ、無水乙醇Ⅱ、95％乙醇、75％乙醇中各浸泡5分鐘。PBS洗2次各5分鐘。(2)抗原修復(fù)，蒸鍋加熱40min，室溫平衡60分鐘。PBS洗2次各5分鐘。(3)3％H2O2(80％甲醇稀釋)處理，室溫靜置10分鐘。PBS洗2次各5分鐘。(4)滴加10％正常山羊血清封閉液，室溫30分鐘，甩去多余液體。(5)滴加雜交瘤培養(yǎng)上清，4℃過夜。PBS洗3次每次5分鐘(如果4℃過夜后需在室溫復(fù)溫30分鐘)。(6)滴加二抗(中杉：P6001/6002)，37℃30分鐘。PBS洗3次各5分鐘。(7)DAB顯色1-10分鐘，在顯微鏡下掌握染色程度。自來水沖洗30秒，可以數(shù)1至30。(8)蘇木精復(fù)染30秒。自來水沖洗30秒，可以數(shù)1至30。(9)脫水、透明：75％乙醇、95％乙醇、無水乙醇Ⅱ、無水乙醇Ⅰ、二甲苯Ⅳ、二甲苯Ⅲ、二甲苯Ⅱ、二甲苯Ⅰ中各浸泡3分鐘。10)中性樹膠封片。

結(jié)果顯示，E2-2 2G8能夠識別人扁桃體組織中的E2-2蛋白，并與pDC細(xì)胞標(biāo)志物CD123共染，說明E2-2 2G8能夠識別人扁桃體組織中pDC細(xì)胞(結(jié)果見圖4)。

雜交瘤細(xì)胞擴(kuò)增和腹水制備

得到陽性克隆后，對細(xì)胞進(jìn)行亞克隆直到得到單克隆抗體。單克隆的雜交瘤細(xì)胞株即可進(jìn)行大規(guī)模培養(yǎng)或免疫小鼠取腹水制備抗體。腹水制備方法如下：(1)取6～8周的NOG(NOD/SCID/IL-2Rγnull)免疫缺陷型小鼠(Jackson Lab)，提前一周腹腔注射0.5毫升降脂烷。(2)篩選得到的陽性雜交瘤克隆，待克隆增殖到50％覆蓋率，轉(zhuǎn)移至24孔板中繼續(xù)培養(yǎng)，擴(kuò)大培養(yǎng)至T75培養(yǎng)瓶中。取適量的雜交瘤細(xì)胞進(jìn)行凍存。(3)從T75培養(yǎng)瓶中收獲雜交瘤細(xì)胞，1500轉(zhuǎn)/分鐘，室溫離心5分鐘。(4)棄掉上清，加入PBS重懸細(xì)胞，1500轉(zhuǎn)/分鐘，室溫離心5分鐘。PBS重復(fù)洗一次，然后用PBS將細(xì)胞重懸至4×106個/毫升。(5)將雜交瘤細(xì)胞腹腔注射至降脂烷處理一周后的小鼠體內(nèi)。(6)1～2周后，小鼠腹腔膨大，脫頸處死小鼠，用10毫升注射器抽取腹水，每只小鼠得到2～5毫升腹水。(7)低溫高速離心，取上清分裝至新的EP管中，-80℃凍存。

單克隆的抗體純化

用Protein G從腹水中純化抗體，操作步驟如下：(1)將protein G的預(yù)裝柱(GE)和純化所需的緩沖液平衡至室溫。(2)將抗體用結(jié)合緩沖液(20mM sodium phosophate buffer,pH 7.0)等體積稀釋。取1毫升腹水，加入1毫升結(jié)合緩沖液。(3)將protein G的預(yù)裝柱置于15毫升離心管中，使柱中的存儲緩沖液自然流出。加入5毫升結(jié)合緩沖液，平衡protein G的預(yù)裝柱。(4)將稀釋后的腹水加入柱上，收集流出液體。(5)加入15毫升結(jié)合緩沖液清洗柱子，收集前2毫升清洗液(0.1M glycine,pH 2.7-3.0)和最后2毫升清洗液。(6)取5個EP管，每只管中加入100微升中和緩沖液(1M Tris-HCl,pH 9)。加入5毫升洗脫緩沖液，每管收集1毫升洗脫后液體迅速混勻，防止局部pH過低而導(dǎo)致蛋白失去活性。(7)對純化后的抗體通過考馬斯亮藍(lán)染色檢測純度。

免疫熒光染色

(1)脫蠟和水化：二甲苯Ⅰ、二甲苯Ⅱ、二甲苯Ⅲ、二甲苯Ⅳ中各浸泡5分鐘，無水乙醇Ⅰ、無水乙醇Ⅱ、95％乙醇、75％乙醇中各浸泡5分鐘。PBS洗2次各5分鐘。(2)抗原修復(fù)，蒸鍋加熱40min，室溫平衡60分鐘。PBS洗2次各5分鐘。(3)3％H2O2(80％甲醇稀釋)處理，室溫靜置10分鐘。PBS洗2次各5分鐘。(4)滴加10％正常山羊血清封閉液，室溫30分鐘，甩去多余液體。(5)滴加一抗(E2-2抗體，E2-2 2G8),室溫靜置1小時或4℃過夜。PBS洗3次每次5分鐘(如果4℃過夜后需在室溫復(fù)溫30分鐘)。(6)滴加熒光二抗(Alesa Fluor 488標(biāo)記山羊抗小鼠IgG抗體，invitrogen)，37℃30分鐘。PBS洗3次各5分鐘。(7)DAPI染色1min，PBS洗3次各3分鐘。(8)用抗熒光衰減封片劑封片，周圍用指甲油在封一圈。4℃保存或熒光顯微鏡觀察。結(jié)果顯示，克隆E2-2 2G8可以用免疫熒光的方法識別人銀屑病皮膚組織中的pDC細(xì)胞(結(jié)果見圖5)。

實施例3單克隆抗體識別組織中pDCs的研究

利用免疫組化方法，驗證E2-2抗體E2-2 2G8在各種組織中的pDCs細(xì)胞的表達(dá)，方法如前。分別在扁桃體組織、肝癌組織、胰腺癌淋巴結(jié)、乳腺癌淋巴結(jié)、Peyer’s patches(結(jié)腸癌)和BPDCN皮膚組織上鑒定了E2-2陽性pDCs(結(jié)果見圖6)。

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