本發(fā)明涉及農(nóng)業(yè)生物
技術(shù)領(lǐng)域：
，具體的說，是基于基因組SSR標(biāo)記的荷花品種‘?dāng)z山丹葉’的分子鑒定方法。
背景技術(shù)：
：荷花（Nelumbonucifera）也稱蓮花，是多年生挺水植物，我國(guó)十大傳統(tǒng)名花中唯一的水生花卉；在我國(guó)已有兩千多年的栽培歷史，具有極高的觀賞價(jià)值和深厚的文化底蘊(yùn)。荷花的群體花期長(zhǎng)，而且在整個(gè)生長(zhǎng)期都有觀賞價(jià)值,以其美觀的形態(tài)、獨(dú)特的清香而深受人們喜愛，為水景園林布置中的主題植物，是重要的夏季觀賞花卉之一，也可用于插花和盆景。我國(guó)分布的野生荷花資源為中國(guó)蓮，花色包括紅色、粉色及白色，花型多樣，除少瓣花型外，還有重瓣、重臺(tái)、千瓣等；紅色系荷花是廣受消費(fèi)者歡迎的、具極高觀賞價(jià)值的品種，但是顏色鮮紅至深紫紅色的荷花品種亦不多見。江蘇省中科院植物研究所與大學(xué)和企業(yè)聯(lián)合攻關(guān)，培育了一個(gè)優(yōu)異的紅色系荷花新品種——‘?dāng)z山丹葉’?！?dāng)z山丹葉’花色為紫紅色，絢麗奪目；植株高大挺拔，著花密度大，群體花期長(zhǎng)，抗逆性佳、適應(yīng)性廣，廣泛適應(yīng)于長(zhǎng)江中下游地區(qū)種植。該品種于2015年已經(jīng)通過江蘇省農(nóng)委鑒定。攝山丹葉’是典型的營(yíng)養(yǎng)繁殖型荷花新品種，其外部形態(tài)特征易受到環(huán)境條件和管理水平的影響，導(dǎo)致消費(fèi)者難以辨別品種的真實(shí)性，給新品種的開發(fā)利用帶來影響。因此，尋找一種真實(shí)有效、不受環(huán)境影響，能夠準(zhǔn)確區(qū)分不同基因型的簡(jiǎn)單、有效的鑒別技術(shù)十分必要。SSR（簡(jiǎn)單重復(fù)序列）分子標(biāo)記技術(shù)是以PCR為基礎(chǔ)的DNA多態(tài)性檢測(cè)技術(shù)，具有共顯性、穩(wěn)定性好、多態(tài)性高和遺傳信息量大的特點(diǎn)，與其他的分子標(biāo)記相比較有明顯的優(yōu)勢(shì)，是理想的分子標(biāo)記方法。技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：技術(shù)問題：本發(fā)明提供一種基于荷花基因組SSR標(biāo)記的荷花品種‘?dāng)z山丹葉’的分子鑒定方法，克服了僅依據(jù)形態(tài)特征鑒定新品種的不確定性，且檢測(cè)方法更為快速、準(zhǔn)確、高效。技術(shù)方案：上述荷花品種‘?dāng)z山丹葉’的分子鑒定方法，其特征在于：1.用CTAB法提取‘?dāng)z山丹葉’幼嫩葉片的DNA。用熒光標(biāo)記引物SSRD01（正向引物序列5-GACTAATGAAACAGGGGTTAGGGC-3，反向引物序列5-TCTCCAATCTCCCAACGACTCTTA-3）對(duì)上述DNA進(jìn)行擴(kuò)增，擴(kuò)增產(chǎn)物采用毛細(xì)管電泳熒光檢測(cè)法檢測(cè)分析，得到且只能得到該位點(diǎn)的片段大小為148bp和164bp。用熒光標(biāo)記引物SSRD02（正向引物序列5-TAGACCAGGCTAGGATGGGGTAG-3，反向引物序列5-AGTTAATGACATCTGCAGGGTGGT-3）對(duì)上述DNA進(jìn)行擴(kuò)增，擴(kuò)增產(chǎn)物采用毛細(xì)管電泳熒光檢測(cè)法檢測(cè)分析，得到且只能得到該位點(diǎn)的片段大小為233bp和249bp。用熒光標(biāo)記引物SSRD03（正向引物序列5-TTGGATTGAGTAAATGAGGGGAAA-3，反向引物序列5-AGAAACTTCCTCAGGTTTCAAGCA-3）對(duì)上述DNA進(jìn)行擴(kuò)增，擴(kuò)增產(chǎn)物采用毛細(xì)管電泳熒光檢測(cè)法檢測(cè)分析，得到且只能得到該位點(diǎn)的片段大小為268bp和284bp。同時(shí)用以上3對(duì)引物對(duì)荷花某一新品種葉片DNA進(jìn)行SSR熒光擴(kuò)增檢測(cè)，每對(duì)引物得到結(jié)果與上述要求的SSR指紋數(shù)據(jù)完全一致，則表明該品種為‘?dāng)z山丹葉’。否則為其它品種。2.擴(kuò)增及檢測(cè)方法：SSR-PCR采用25ul的反應(yīng)體系，其中包括50ngDNA,2.5μL10×PCRbuffer,0.2mmolL-1dNTPs,1UTaqDNA聚合酶，正反向引物各4μmolL-1；PCR擴(kuò)增程序?yàn)椋?4℃預(yù)變性5min；94℃變性30s，55°C~60℃退火30s，72℃延伸30s，35個(gè)循環(huán)；72℃延伸10min，4℃保存；擴(kuò)增產(chǎn)物用美國(guó)ABI3730進(jìn)行自動(dòng)熒光檢測(cè)，用GeneMapper軟件分析原始數(shù)據(jù)，獲得SSR指紋數(shù)據(jù)。有益效果：1.本發(fā)明通過直接檢測(cè)‘?dāng)z山丹葉’的DNA序列對(duì)其進(jìn)行鑒定，克服了依據(jù)外部形態(tài)特征對(duì)其鑒定的不確定性；2.本發(fā)明為‘?dāng)z山丹葉’新品種保護(hù)提供了科學(xué)的技術(shù)保障；3.本發(fā)明為‘?dāng)z山丹葉’品種推廣應(yīng)用過程中的鑒定提供了實(shí)驗(yàn)證據(jù)。具體實(shí)施方式1.DNA的提取及鑒定標(biāo)記的獲得選擇生產(chǎn)上常用且具代表性的27種荷花品種，采集這27個(gè)品種以及‘?dāng)z山丹葉’的幼嫩葉片，使用CTAB法提取其基因組DNA。用0.8%瓊脂糖凝膠電泳和OneDrop分光光度計(jì)檢測(cè)DNA質(zhì)量和濃度。用15對(duì)SSR引物對(duì)所提取的DNA進(jìn)行擴(kuò)增。SSR-PCR采用25μL的反應(yīng)體系，其中包括：50ngDNA,2.5μL10×PCRbuffer,0.2mmolL-1dNTPs,1UTaqDNA聚合酶，正反向引物各4μmolL-1。SSR-PCR擴(kuò)增程序?yàn)椋?4℃預(yù)變性5min；94℃變性30s，55°C~60℃退火30s，72℃延伸30s，35個(gè)循環(huán)；72℃延伸10min，4℃保存。擴(kuò)增產(chǎn)物用美國(guó)ABI3730進(jìn)行自動(dòng)熒光檢測(cè)，用GeneMapper軟件分析原始數(shù)據(jù)，獲得各位點(diǎn)等位基因數(shù)據(jù)。擴(kuò)增結(jié)果表明，15對(duì)引物中SSRD01、SSRD02及SSRD03三對(duì)引物的PIC值最大，多態(tài)性最好（表1），用這三對(duì)引物完全可以區(qū)分‘?dāng)z山丹葉’與供試的其它27個(gè)品種，指紋數(shù)據(jù)見表2。表1三對(duì)SSR引物多態(tài)性表228個(gè)品種在3對(duì)SSR引物下的指紋數(shù)據(jù)品種名稱引物SSRD01引物SSRD02引物SSRD03‘?dāng)z山丹葉’148/164233/249268/284金鳳凰158/172233/249266/282碧云164/172229/245266/282粉青蓮172229/245268/284錦衣衛(wèi)168/172229268/284金太陽158/172233/245266/282逸仙蓮148/164237268/284宜良千瓣158233/249266紅臺(tái)蓮158233/249266/282伯里夫人148/172229266/282艾江南148/168233266/282大灑錦158/164233/249266/282友誼牡丹蓮164/172229/245268/284中國(guó)紅瑞金172/178233/245266/282中國(guó)紅井岡山158/164249266/282中國(guó)紅遵義158/164245268/284中國(guó)紅延安148/172229/245268/284俊愉蓮158233/249266/282精彩158245/249268/284星甸紅蓮156/172245266/282友誼蓮164245268/286粉精靈164/174249268/284金陵暢想164/174229/233266/282中國(guó)紅西北坡164/172245266/282中國(guó)紅韶山158/172229/249268/284紅唇164233/245266/282中國(guó)紅嘉興164/172233/245266/282紅纖指158249266/2822.用所篩選的3對(duì)SSR引物對(duì)‘?dāng)z山丹葉’品種鑒定的驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)用上述3對(duì)SSR熒光引物，選擇江蘇省中科院植物所和企業(yè)新選育的16個(gè)荷花新品種，與‘?dāng)z山丹葉’同時(shí)進(jìn)行擴(kuò)增，擴(kuò)增及檢測(cè)方法同上。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，這3對(duì)引物可以將‘?dāng)z山丹葉’與其它品種區(qū)分開，‘?dāng)z山丹葉’與這16個(gè)品種的SSR指紋數(shù)據(jù)見表3。表317個(gè)品種在3對(duì)SSR引物下的指紋數(shù)據(jù)品種引物SSRD01引物SSRD02引物SSRD03‘?dāng)z山丹葉’148/164233/249268/284XY-N-1158/164245/249268/284XY-N-2158/164229/245266/282XY-N-3158203/215266/268XY-N-4158/164215/245268/284XY-N-5158/164229/249266/282XY-N-6164245266/282XY-N-7164/174229/249266/282XY-N-8164/174229/245266/282XY-N-9158229/245266/282XY-N-10158233/249266/282XY-N-11158/164229266/282XY-N-12158/164229/245266/282XY-N-13164245/249268/284XY-N-14158/164233/249266/282XY-N-15164233/245266/282XY-N-16158/164237/245266/282從驗(yàn)證結(jié)果可以看出，僅利用其中1對(duì)或2對(duì)SSR引物就可以區(qū)分‘?dāng)z山丹葉’與其它16個(gè)新品種，但考慮到未來可能會(huì)有更多新品種出現(xiàn)，所以為了鑒定的科學(xué)性，本發(fā)明建議采用以上3對(duì)引物同時(shí)進(jìn)行檢測(cè)，若3對(duì)引物擴(kuò)增得到的結(jié)果與本發(fā)明公布的完全一致，則說明該品種為荷花品種‘?dāng)z山丹葉’。當(dāng)前第1頁1 2 3