本發(fā)明屬于醫(yī)療產(chǎn)品
技術(shù)領(lǐng)域:
,具體而言,涉及一種特異性檢測結(jié)核分枝桿菌感染的蛋白。
背景技術(shù):
:我國體外診斷產(chǎn)業(yè)現(xiàn)正處于快速增長時期。然而巨大的市場需求與我國診斷試劑行業(yè)相對落后的自主研發(fā)能力的存明顯的差距。如何從源頭上開展自主創(chuàng)新,如何在診斷試劑原材料供應(yīng)上不受制于個別境外醫(yī)藥巨頭,如何將現(xiàn)有的生物醫(yī)藥領(lǐng)域的科研成果轉(zhuǎn)化為產(chǎn)品是我國政府、科研院所和醫(yī)藥行業(yè)在近年來都非常關(guān)注的熱點。并且現(xiàn)今市場上對更靈敏、高效的診斷試劑提出了剛性需求,能夠快速準(zhǔn)確的確診結(jié)核病患者對于醫(yī)務(wù)工作者和病人本人都具有重要意義。近年來數(shù)據(jù)調(diào)查結(jié)果顯示,有結(jié)核病癥狀的患者76.6%接受過結(jié)核病病前相關(guān)檢查,但是僅有35.8%被診斷為肺結(jié)核患者,提高病人發(fā)現(xiàn)率仍是當(dāng)前結(jié)核病防治工作的重點也是難點。利用抗原特異性T細(xì)胞的細(xì)胞免疫反應(yīng)進行病原微生物感染的體外診斷,是今年發(fā)展起來的一種新的檢測方法。我們通過分離新鮮全血中的外周血單核細(xì)胞并進行刺激培養(yǎng),然后利用ELISPOT檢測能夠分泌IFN-γ的細(xì)胞的數(shù)量。該方法目前主要應(yīng)用于結(jié)核分枝桿菌感染的診斷。目前臨床普遍采用的結(jié)核診斷主要依賴于臨床癥狀、影響學(xué)診斷和病原學(xué)診斷,對結(jié)核分枝桿菌潛伏性感染的診斷不敏感。同時,在結(jié)核病篩查過程中,直接檢測病原體或檢測結(jié)核分枝桿菌抗體的靈敏度和特異性也不理想。技術(shù)實現(xiàn)要素:針對上述臨床實際工作情況,我們篩選了結(jié)核分枝桿菌來源的蛋白片段,提供了一種檢測結(jié)核病的結(jié)核分枝桿菌標(biāo)識物抗原,通過該抗原來體外檢測特異性T細(xì)胞免疫反應(yīng),可以作為診斷結(jié)核病患者的參照,用于診斷患者是否被結(jié)核分枝桿菌感染。同時,進一步動物實驗表明,該蛋白抗原能夠誘導(dǎo)針對結(jié)核分枝桿菌的免疫反應(yīng),具有制備相應(yīng)的疫苗的功能。具體而言,本發(fā)明首先涉及一種結(jié)核分枝桿菌的特異性蛋白抗原Rv3899c,所述的抗原氨基酸序列如SEQIDNO.1所示,其氨基酸序列結(jié)構(gòu)為:編碼所述蛋白抗原Rv3899c的核苷酸序列如SEQIDNO.2所示,其DNA序列結(jié)構(gòu)為:本發(fā)明還涉及所述的Rv3899c蛋白抗原作為檢測結(jié)核分枝桿菌的免疫原的應(yīng)用,所述的應(yīng)用為,將該Rv3899c蛋白抗原單獨用于檢測結(jié)核分枝桿菌。本發(fā)明還涉及所述的Rv3899c蛋白抗原在制備結(jié)核分枝桿菌檢測試劑盒中的應(yīng)用,所述的應(yīng)用為,將所述的Rv3899c蛋白抗原單獨作為檢測抗原制備檢測試劑盒。所述的現(xiàn)有結(jié)核分枝桿菌檢測抗原為結(jié)核分枝桿菌來源的ESAT-6抗原、CFP10抗原、PPD抗原、BCG抗原、LAM抗原、ES-31抗原。本發(fā)明還涉及由所述的Rv3899c蛋白抗原制備的單一抗原型結(jié)核分枝桿菌檢測試劑盒,所述試劑盒包含,(1)檢測有效量濃度(優(yōu)選濃度為75ug/ml)的Rv3899c蛋白抗原;(2)必要的檢測試劑及顯色試劑。本發(fā)明還涉及所述的單一型結(jié)核分枝桿菌檢測試劑盒在檢測結(jié)核分枝桿菌中的應(yīng)用,其特征在于,所述的檢測方法為,(1)檢測樣品為由待測患者血樣制備得到的抗凝全血或PBMC細(xì)胞;(2)Rv3899c蛋白抗原作為免疫原與抗凝全血或者PBMC細(xì)胞孵育20-30個小時,優(yōu)選20-24個小時(3)檢測受到Rv3899c蛋白抗原刺激分泌的細(xì)胞因子,與陽性參照對比確定檢測結(jié)果,所述的細(xì)胞因子為IFN-gamma、IFN-alpha、TNF-alpha、IL-2、IL-13、IP-10、IL-1ra、GM-CSF、MIP-1betta、IL-6、IL-8、MCP-1、IL-10和IL-12,優(yōu)選IFN-gamma、TNF-alpha、IL-2、IL-13、 IP-10、IL-1ra、GM-CSF、MIP-1betta,進一步優(yōu)選IFN-gamma、TNF-alpha、IL-2、IL-13,最優(yōu)選IFN-gamma。本發(fā)明還涉及所述Rv3899c抗原在制備抗結(jié)核分枝桿菌的疫苗中的應(yīng)用。附圖說明圖1.Rv3899c蛋白質(zhì)SDS-PAGE檢測圖,左側(cè)為Marker(單位Kd),具體實施方式1、儀器試劑1.1抗生素與IPTG名稱縮寫分子量儲液工作液溶劑卡那霉素Kan58.2830mg/ml30ug/ml水異丙基-β-D-硫代半乳糖苷IPTG238.301M0.05mM水1.2培養(yǎng)基的配制LB培養(yǎng)基:10g蛋白胨、5g酵母膏、10g氯化鈉(1L的量)加單蒸水至1L,檢測PH=6.8-7.2左右。如果PH偏差大于0.5,需要用NaOH或者HCl調(diào)節(jié)。固體的LB培養(yǎng)基多增加15-20%的瓊脂1.3純化bufferlysisbuffer:20mMTris-HCl、500mM氯化鈉、10%甘油、pH7.5Washbuffer:20mMTris-HCl、20mM咪唑、500mM氯化鈉、10%甘油、pH7.5Elutionbuffer:20mMTris-HCl、250mM咪唑、500mM氯化鈉、10%甘油、pH7.5層析緩沖液:PBS、pH7.5。其他試劑固化Ni+層析樹脂(Novagen),Ni-NTAHis,(Cat.NO70691-5,北京華美;2-8度保存);蛋白結(jié)合能力大于5mg/mlresin層析柱(玻璃或者聚丙烯)PMSFsuperdex200:(GE)實施例1.Rv3899c-pDEST17表達(dá)載體構(gòu)建基礎(chǔ)流程以LREnzymemix催化Rv3899c的入門載體(美國CraigVentorInstitute下設(shè)的PFGRC所免費提供)和pDESTTM17載體重組生成Rv3899c的表達(dá)載體。具體方法:A.克隆反應(yīng)體系:Rv3899c的入門載體1.5μL,pDESTTM17載體1μL,BPIIEnzymemix2.5μL;反應(yīng)條件:25℃,過夜反應(yīng)。B.轉(zhuǎn)化方法:反應(yīng)體系中加入100μL大腸桿菌DH5α感受態(tài)(自制),冰浴30min后,42℃熱激90s,體系冰上放置10min,加入200μLLB培養(yǎng)基復(fù)性后,涂布在含氨芐青霉素(100mg/l)的LB固體培養(yǎng)基上,37℃培養(yǎng)20h。C.質(zhì)粒提?。阂訬96高純度質(zhì)粒小提試劑盒(DP114)提取質(zhì)粒,獲得Rv3899c的表達(dá)載體。D.酶切驗證:以BsrG1酶切試劑盒(R0575SNEB)酶切質(zhì)粒驗證克隆是否完成,結(jié)果顯示,酶切片段大小約為1200bp,質(zhì)粒構(gòu)建成功。實施例2.目標(biāo)蛋白Rv3899c的表達(dá)及復(fù)性1.蛋白表達(dá)a)LB平板劃線活化(加入kan),37℃靜置過夜(16h左右)。b)將轉(zhuǎn)化了實施例1制備獲得的整合了Rv3899c的表達(dá)載體的大腸桿菌宿主細(xì)胞接種于5ml液體LB培養(yǎng)基(加入5ulkan)37℃200rpm,培養(yǎng)至OD大于0.6-0.8(大約3h)。c)按接種量5ml接種于300mlLB液體培養(yǎng)基中,37℃,200rpm培養(yǎng)至OD600≈0.6-0.8(大約2h)。降溫到16℃,加入終濃度0.04mMIPTGd)16℃,200rpm培養(yǎng)培養(yǎng)16h,4℃,4000rpm離心10min收集菌體。2.蛋白純化a)菌體重懸:每1L培養(yǎng)基所收集的菌體用40ml左右lysisbuffer重懸(加入1%蛋白酶抑制劑PMSF,則終濃度為0.5-1mM)b)菌體破碎:超聲6s每次、功率為38%,超聲20min。(懸濁液透亮為標(biāo)準(zhǔn),酌情調(diào)整超聲工作總時間)。c)去除細(xì)菌碎片:4℃,12000g離心30分鐘。d)Ni柱處理:3mlNi柱先用水處理8cv(8倍柱體積),再用8cvlysisbuffer作為平衡液平衡,流速為25cm/h。e)上樣:破菌離心上清以25cm/ml的流速進行上樣,收集流穿峰。f)平衡:樣品上樣后用平衡液平衡5cv。g)洗滌:用washbuffer洗滌5cvh)洗脫:用elutionbuffer洗脫,分管收集。用bradford試劑檢測洗脫液,了解蛋白是否完全洗脫。如含有蛋白,則繼續(xù)洗脫,直至完全。i)透析:洗脫蛋白裝入12KD的透析袋中放入裝有100倍洗脫蛋白體積的離子交換緩沖液A的燒杯中進行透析過夜。離心取上清。j)分子篩層析層析柱:superdex200(根據(jù)樣品的量來確定層析介質(zhì)的體積)流速;30cm/h層析過程:先用水處理5cv,再用0.5MNaOH處理半小時,再用層析緩沖液平衡層析,直至層析柱電導(dǎo)和pH流出液與層析緩沖液一致。透析離心上清作為樣品上樣,收集洗脫峰。檢測:SDS-PAGE檢測目的蛋白是否存在,結(jié)果如圖1所示,SDS-PAGE電泳結(jié)果顯示,提純后的蛋白的分子量約為55KD,純度大于90%,蛋白濃度合格。實施例3.目標(biāo)蛋白Rv3899c的免疫原性測試為了檢測Rv3899c的免疫原性及其對于現(xiàn)有抗原檢測試劑盒的增強效果,對于來自北京胸科醫(yī)院臨床確診的多個病例進行了進一步的抗原檢測篩選。測試血樣:來自北京胸科醫(yī)院就診患者陽性對照試劑與耗材:T-SPOT試劑盒(ESAT-6和CFP10雙抗原試劑盒),Oxfordimmunotec(英國)產(chǎn)品,陰性對照:Rv2327蛋白抗原,隨機選取的另一段來源于結(jié)核分枝桿菌的已知蛋白片段Rv2327,其核苷酸序列和氨基酸序列分別如SEQIDNO.3及SEQIDNO.4所示SEQIDNo.3SEQIDNo.4實驗方法及評價方法如下:1)肝素抗凝血,抗凝血樣本按體積1:1與RPMI1640混勻;按2-3:1比例小心將血樣加在Ficoll淋巴細(xì)胞分離液上層;2)1000g離心22分鐘;水平轉(zhuǎn)子,緩升緩降;3)將單核細(xì)胞層(位于離心管中間層,為一層較薄的白膜狀)從Ficoll分離管中轉(zhuǎn)移到已加10mlAIM-V培養(yǎng)液的無菌15ml離心管,輕輕混勻,室溫600g離心7min;4)小心去除上清,加入1mlAIM-V,輕緩重懸細(xì)胞,加入AIM-V培養(yǎng)液至10ml,350g離心7min;5)小心棄上清,加入1mlAIM-V培養(yǎng)液重懸細(xì)胞;6)細(xì)胞計數(shù)及稀釋,取10μl細(xì)胞懸液加入40μl的1%trypanblue,制備1:5細(xì)胞稀 釋液,進行活細(xì)胞計數(shù),計算細(xì)胞稀釋需要的體積并加入相應(yīng)的AIM-V無血清培養(yǎng)液制備細(xì)胞稀釋液,試劑盒檢測要求加入每孔(24孔PVDF膜板)細(xì)胞數(shù)量2.5×105;7)將培養(yǎng)板從鋁封袋中取出,按順序加入:50μlAIMV至陰性對照孔;50μl抗原ESAT-6至抗原A孔;50μl抗原CFP10至抗原B孔;50μl陽性對照至陽性對照孔;在上述4孔中分別加入已制備細(xì)胞稀釋工作液100μl。50μl實施例2制備獲得的Sampleprotein(初始濃度為60ug/ml)加入到樣品孔中,隨后加入培養(yǎng)基和細(xì)胞,樣品孔中Sampleprotein的終濃度為初始濃度的1/3。8)將培養(yǎng)板放入37℃,5%CO2培養(yǎng)箱孵育16-20hrs。9)用無菌PBS按1:200制備新鮮酶標(biāo)抗體工作液。從培養(yǎng)箱取出培養(yǎng)板,棄去孔內(nèi)液體。以200μl/well無菌PBS洗滌4遍。10)加入50μl/well酶標(biāo)抗體工作液,將培養(yǎng)板在2-8℃孵育1小時。用PBS洗滌4遍去除未結(jié)合酶標(biāo)抗體。11)每孔加入室溫平衡過的底物工作液50μl,室溫反應(yīng)7分鐘。以蒸餾水沖洗終止反應(yīng),在37℃2-3hrs或室溫過夜干燥培養(yǎng)板。免疫原測試結(jié)果和分析:免疫原性測試在胸科醫(yī)院分子生物學(xué)實驗室進行,測試選用一定數(shù)量的已臨床確診的結(jié)核病患者,通過使用各種蛋白抗原檢測上述已確診患者的血樣,并由此結(jié)果分析Rv3899c蛋白抗原的免疫原性及應(yīng)用方向,具體的檢測結(jié)果統(tǒng)計見下表1所示,表1.Rv3899c抗原對住院已確診結(jié)核病患者的結(jié)核分枝桿菌檢測結(jié)果由檢測結(jié)果可以看出,Rv3899c抗原篩查結(jié)合分枝桿菌感染的患者的結(jié)果,相比于T-spot的檢測結(jié)果,準(zhǔn)確率相當(dāng),但Rv3899c抗原篩查相比于T-SPOT試劑盒的雙抗篩查,檢測流程相對簡單。最后需要說明的是,以上實施例僅供本領(lǐng)域技術(shù)人員理解本發(fā)明的實質(zhì),并不用作對本法保護范圍的限定。當(dāng)前第1頁1 2 3