本發(fā)明涉及基因工程技術(shù)領(lǐng)域，更具體地，涉及一種調(diào)控水稻植株株高的方法。

背景技術(shù)：

水稻是世界上最重要的糧食作物之一，如何提高水稻的產(chǎn)量一直是人們研究的重點，株高是影響作物產(chǎn)量的一個重要性狀。上世紀50年代初，基于基因滲入的半矮稈育種使得栽培農(nóng)作物如小麥和水稻的產(chǎn)量有了巨大的提升。為了進一步提高水稻產(chǎn)量，育種家提出了理想株型育種，雖然針對不同稻作區(qū)有不同的理想株型模式，但普遍要求有適當?shù)闹旮撸皇菃渭兊陌珬U或半矮桿。因此，研究并揭示水稻株高發(fā)育的分子機理對植物株型建成的基礎(chǔ)研究和指導(dǎo)生產(chǎn)育種具有重要的理論和實踐意義。

水稻株高由復(fù)雜的基因調(diào)控網(wǎng)絡(luò)控制。根據(jù)目前的報道，株高主要受激素如赤霉素（Gibberellin，GA）、油菜素內(nèi)酯（Brassinosteroid，BR）、獨腳金內(nèi)酯（Strigolactone，SL）等相關(guān)途徑和極性生長素運輸（Polar Auxin Transport）的調(diào)控，其中GA和BR相關(guān)途徑研究最為深入。多數(shù)矮化突變體的產(chǎn)生都是由于這兩種植物激素的生物合成或響應(yīng)途徑的缺陷；隨著GA受體GID1（GA-INSENSITIVE DWARF1）、GID2（GA-INSENSITIVE DWARF 2）和DELLA等關(guān)鍵蛋白的相繼鑒定，GA控制植物株型建成的信號途徑得以闡明。

在擬南芥（Arabidopsis thaliana）中，已克隆數(shù)個與BR信號響應(yīng)和傳導(dǎo)相關(guān)的基因。如 BRI1（Brassinosteroid-Insensitive 1），編碼一個定位在質(zhì)膜的LRR受體激酶（Receptor-like kinase, RLK）；BAK1（Bri1-associated Receptor Kinase 1）則可與BRI1產(chǎn)生互作；通過篩選及研究BR信號途徑的突變體，人們還鑒定了BRI1下游的抑制因子BKI1 (BRI1 Kinase Inhibitor 1)，BIN2（BR-Insensitive 2），BES1（Bri1-EMS-Suppressor 1）以及BZR1（Brassinazole Resistant 1）。

此外，近年來鑒定了一種新的植物激素SL，其主要功能是調(diào)控植物莖的分枝，同時也控制株高發(fā)育。人們通過對水稻 htd（high tillering dwarf）、D10、D14、D3及D53等矮化突變體的深入研究，逐步揭示了SL調(diào)控側(cè)枝及株高發(fā)育的分子機制。

綜上所述，GA、BR和SL等植物激素調(diào)控植物株高發(fā)育的分子機制已日漸明晰，然而，其他影響株高發(fā)育的因素仍需進一步探究。

技術(shù)實現(xiàn)要素：

本發(fā)明揭示了一種控制植物株高的新的分子機制，并提供兩種培育水稻矮化植株的方法。一種方法通過轉(zhuǎn)基因表達突變型PTD1基因或定點突變了保守半胱氨酸密碼子的ptd1基因?qū)崿F(xiàn)矮化，另一種方法利用基因組靶向編輯內(nèi)源的野生型ptd1基因?qū)崿F(xiàn)矮化。

本發(fā)明的目的是通過以下技術(shù)方案予以實現(xiàn)的：

一種調(diào)控水稻植株株高的方法，包括以下步驟：

S1. 將編碼SEQ ID NO：2所示ptd1蛋白中第56位和/或76位和/或第102位和/或116位半胱氨酸的密碼子定點突變?yōu)榉前腚装彼崦艽a子，得到改造后的基因；

S2. 將改造后的基因與啟動子連接后轉(zhuǎn)入正常株高的水稻植株，篩選獲得與正常株高的水稻植株相比，株高發(fā)生變化的植株即可。

發(fā)明人前期研究中發(fā)現(xiàn)一個表現(xiàn)為矮化的水稻植株，在該矮化植株的基礎(chǔ)上通過圖位克隆法獲得野生型ptd1基因及矮化植株突變型PTD1基因。

進一步地，發(fā)明人發(fā)現(xiàn)野生型ptd1蛋白具有脂質(zhì)轉(zhuǎn)移蛋白典型的8個半胱氨酸基序，該保守基序是分子內(nèi)形成二硫鍵的關(guān)鍵位點，另外，還發(fā)現(xiàn)ptd1蛋白中第56位與102位半胱氨酸以及76位與116位半胱氨酸能夠分別兩兩形成第3，4位的二硫鍵，這兩個二硫鍵的破壞正是突變基因PTD1調(diào)控株高的關(guān)鍵，因此，若想調(diào)控水稻植株株高，只需要對ptd1蛋白中第56位和/或76位和/或第102位和/或116位半胱氨酸進行突變。

優(yōu)選地，本發(fā)明不對所述改造后的基因序列進行具體的限定，因為只要改造后的基因所編碼的蛋白中第56位和/或76位和/或第102位和/或116位不是半胱氨酸使得它們不形成二硫鍵即可。

作為本發(fā)明的一種具體實施方式，所述改造后的基因可以是ptd1-mC102,116或ptd1-mC56,76，這兩個基因中102位與116位（或56位與76位）編碼的是甘氨酸。

優(yōu)選地，本發(fā)明所述調(diào)控水稻植株株高為使正常株高的水稻植株產(chǎn)生矮化表型。

優(yōu)選地，S1所述啟動子為植物通用組成型啟動子或ptd1基因的自身啟動子。

作為一種具體的實施方案，本發(fā)明所述矮化水稻植株的方法，包括以下步驟：

S1. 將SEQ ID NO：3所述基因轉(zhuǎn)入正常株高的水稻植株，進行超表達，得到轉(zhuǎn)基因植物；

S2. 從S1所得到的轉(zhuǎn)基因植物中篩選得到與正常株高的水稻植株相比，產(chǎn)生矮化表型的轉(zhuǎn)基因植物。

作為另外一種具體的實施方案，本發(fā)明所述矮化水稻植株的方法，包括以下步驟：

S1. 向正常株高的水稻植株中導(dǎo)入由SEQ ID NO：5所述的自身啟動子驅(qū)動的SEQ ID NO：3所述基因，得到表達SEQ ID NO：3所述基因的轉(zhuǎn)基因植物；

S2. 從S1所得到的轉(zhuǎn)基因植物中篩選得到與正常株高的水稻植株相比產(chǎn)生矮化表型的轉(zhuǎn)基因植物。

本發(fā)明還提供一種基于ptd1基因靶向編輯的培育方法，包括以下步驟：

S1. 利用基因組靶向編輯系統(tǒng)將正常株高的水稻植株中SEQ ID NO：1所示ptd1基因進行靶向編輯，使所述基因第56位和/或76位和/或第102位和/或116位半胱氨酸密碼子發(fā)生改變，致使突變后的基因編碼的蛋白喪失第3和/或第4位二硫鍵，得到定點突變的植物；

S2. 從S1所得到的定點突變的植物中篩選得到與正常株高的水稻植株相比株高矮化的植物。

優(yōu)選地，所述基因編輯系統(tǒng)可以是CRISPR/Cas系統(tǒng)。

與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明具有以下有益效果：

本發(fā)明提供了一種調(diào)控水稻植株株高的方法，是將編碼SEQ ID NO：2所示ptd1蛋白中第56位和/或76位和/或第102位和/或116位半胱氨酸的密碼子定點突變?yōu)榉前腚装彼崦艽a子，得到改造后的基因；將改造后的基因與啟動子連接后轉(zhuǎn)入正常株高的水稻植株，篩選獲得與正常株高的水稻植株相比，株高發(fā)生變化的植株。本發(fā)明利用基因工程手段表達突變型PTD1基因或定點突變了保守半胱氨酸密碼子的ptd1基因進行分子育種，在調(diào)節(jié)植物株高、植物理想株型的建成上具有潛在的應(yīng)用價值。

附圖說明

圖1為水稻矮化突變體PTD1植株及株高相關(guān)基因PTD1/ptd1突變位點和二硫鍵形成模式圖；其中，圖1A顯示突變體PTD1與野生型中花11（ZH11）的植株形態(tài)，右上角小圖是PTD1抽穗時的形態(tài)；圖1B為PTD1和ptd1基因的讀碼框及翻譯蛋白比對圖；圖1C為ptd1二硫鍵形成模式，顯示ptd1蛋白一級序列28～120位氨基酸，1，2，3和4表示半胱氨酸兩兩配對形成4對二硫鍵。

圖2為水稻株高相關(guān)基因PTD1突變重現(xiàn)、超表達及定點突變ptd1基因的轉(zhuǎn)基因植株的鑒定實物圖。ZH11為野生型水稻植株中花11，其中，圖2A中突變重現(xiàn)植株（t PTD1）即為突變型PTD1基因與自身啟動子構(gòu)建的突變重現(xiàn)載體轉(zhuǎn)化ZH11的T₁代轉(zhuǎn)基因植株；圖2B中超表達植株（t Ubi-PTD1）為突變型PTD1基因與超表達啟動子（Ubi）構(gòu)建的載體轉(zhuǎn)化ZH11的T₁代轉(zhuǎn)基因植株；圖2C中標注t ptd1-mC102,116的植株是轉(zhuǎn)化定點突變了第102和116位半胱氨酸密碼子的ptd1基因的T₀代植株，標注ZH11的是同批轉(zhuǎn)化得到的不帶轉(zhuǎn)基因的再生植株，上述突變基因由ptd1自身啟動子驅(qū)動，轉(zhuǎn)化受體為ZH11。

具體實施方式

下面將結(jié)合說明書附圖和具體實施例進一步說明本發(fā)明的內(nèi)容，但不應(yīng)理解為對本發(fā)明的限制。在不背離本發(fā)明精神和實質(zhì)的情況下，對本發(fā)明方法、步驟、條件所作的修改或替換，均屬于本發(fā)明的范圍。若無特別說明，實施例中所用的實驗方法均為本領(lǐng)域技術(shù)人員所熟知的常規(guī)方法和技術(shù)，所使用的試劑或材料均為通過商業(yè)途徑得到。

本發(fā)明前期研究中發(fā)現(xiàn)一矮化表型的水稻植株（圖1A），通過圖位克隆的方法獲得了突變體PTD1基因，其圖位克隆的過程同Characterization and genetic mapping of a Photoperiod-sensitive dwarf1 locus in rice (Oryza sativa L.)，PTD1基因序列如SEQ ID NO：3。

實施例1 PTD1的突變重現(xiàn)載體和超表達載體轉(zhuǎn)化野生型水稻ZH11

根據(jù)日本晴參考序列設(shè)計包括編碼區(qū)約500 bp及其上下游調(diào)控區(qū)各延伸約2.4 kb和2.1 kb的特異性PCR引物PTD1-RM-F和PTD1-RM-R（表1），利用高保真酶KOD-Plus結(jié)合長片段PCR（long-range PCR，LR-PCR）技術(shù)，以突變體PTD1的基因組DNA為模板，擴增約5 kb目的片段，用限制性內(nèi)切酶Eco RI和Bam HI切割后克隆到植物雙元載體pCAMBIA1300（CAMBIA公司，Canberra，Australia）上，獲得突變重現(xiàn)載體。

另外設(shè)計包含候選基因PTD1整個ORF的基因特異性引物PTD1-OE-F和PTD1-OE-R（表1），以突變體PTD1總RNA為模板進行RT-PCR，擴增得到357 bp的cDNA片段，用KpnI/BamHI進行雙酶切后克隆到pOX載體上，利用組成型表達的玉米泛素基因Ubi啟動子驅(qū)動PTD1的表達，即超表達載體。

然后，通過農(nóng)桿菌EHA105介導(dǎo)的遺傳轉(zhuǎn)化將上述突變重現(xiàn)載體和超表達載體分別導(dǎo)入野生型水稻ZH11植株中，通過潮霉素篩選轉(zhuǎn)基因植株，利用引物HPT-F 和HPT-R（表1）對轉(zhuǎn)基因植株進行潮霉素磷酸轉(zhuǎn)移酶基因（HPT）的PCR鑒定，并對轉(zhuǎn)入的PTD1基因進行測序鑒定。結(jié)果表明，將PTD1突變重現(xiàn)載體導(dǎo)入野生型受體ZH11中，大多數(shù)轉(zhuǎn)化體重現(xiàn)了突變型PTD1的表型，植株表現(xiàn)為矮化（圖2A）；另外，在野生型水稻ZH11中超表達PTD1，經(jīng)鑒定轉(zhuǎn)基因陽性植株中均表現(xiàn)出不同程度的矮化表型（圖2B），綜上所述，多個突變重現(xiàn)以及超表達的獨立轉(zhuǎn)化個體均能再現(xiàn)PTD1的矮化表型，這證明了PTD1基因的生物學(xué)功能與水稻株高調(diào)控相關(guān)。

實施例2 水稻株高相關(guān)基因PTD1/ptd1的核苷酸序列及蛋白結(jié)構(gòu)

通過PCR擴增ptd1和PTD1的基因組序列并進行測序，發(fā)現(xiàn)水稻矮化植株中的PTD1是在野生型ptd1編碼區(qū)第303 bp處發(fā)生了一個G堿基的缺失以及在第305 bp處發(fā)生了一個G→T的替換，導(dǎo)致了其編碼區(qū)從363 bp縮短至357 bp，而其編碼的蛋白質(zhì)從突變點起發(fā)生了移碼突變（圖1B），ptd1和PTD1的核苷酸序列分別如SEQ ID NO：1和SEQ ID NO：3所示。

ptd1和PTD1的蛋白序列分別如SEQ ID NO：2和SEQ ID NO：4所示，ptd1編碼由120個氨基酸殘基組成的蛋白多肽，其前端1～27位氨基酸為信號肽，在蛋白成熟加工后切除，其成熟蛋白分子量約9.5 kDa，等電點為8.69；而PTD1則編碼由118個氨基酸殘基組成的蛋白多肽，其信號肽與野生型相同，因此成熟蛋白分子量約9.1 kDa，等電點為9.06；野生型ptd1蛋白具有脂質(zhì)轉(zhuǎn)移蛋白典型的8個半胱氨酸基序（Eight-cysteine motif, 8 CM），該保守基序是分子內(nèi)形成二硫鍵的關(guān)鍵位點。而突變型PTD1由于100位氨基酸后產(chǎn)生移碼突變，其102和116位半胱氨酸喪失，導(dǎo)致蛋白不能正常形成二硫鍵，這一結(jié)構(gòu)特點是使植株產(chǎn)生矮化表型的關(guān)鍵所在（圖1B，C）。

實施例3 對ptd1中形成第3，4位二硫鍵的關(guān)鍵半胱氨酸密碼子進行突變并轉(zhuǎn)化ZH11

對ptd1蛋白進行分析發(fā)現(xiàn)，其第31，41，55，56，76，78，102，116位氨基酸為半胱氨酸，是形成分子內(nèi)二硫鍵的重要氨基酸，其中56與102位半胱氨酸以及76與116位半光氨酸分別兩兩形成第3，4位二硫鍵（圖1C），研究表明，這兩個二硫鍵的破壞正是突變基因PTD1調(diào)控植物株高的關(guān)鍵，因此可以對ptd1中關(guān)鍵半胱氨酸密碼子進行點突變，以實現(xiàn)與突變基因PTD1相同的功能。

利用Ω-PCR技術(shù)（所述Ω-PCR技術(shù)參考文獻：Robust one-Tube Ω-PCR Strategy Accelerates Precise Sequence Modification of Plasmids for Functional Genomics）對ptd1基因進行點突變，將102與116位（或56與76位）半胱氨酸所在的密碼子點突變?yōu)榉前腚装彼岬拿艽a子（如改為甘氨酸的密碼子），并將改造得到的ptd1-mC102,116（或ptd1-mC56,76）基因與ptd1自身啟動子構(gòu)建到植物雙元載體pCAMBIA1300上（引物序列如表2，下劃線部分為點突變位置）。然后，通過農(nóng)桿菌EHA105介導(dǎo)的遺傳轉(zhuǎn)化將上述載體導(dǎo)入野生型水稻ZH11植株中，通過潮霉素篩選轉(zhuǎn)基因植株，利用PCR對轉(zhuǎn)基因植株進行HPT基因鑒定，并對轉(zhuǎn)入基因的突變點進行測序鑒定。結(jié)果表明，將ptd1點突變載體導(dǎo)入野生型受體ZH11中，有多個獨立的遺傳轉(zhuǎn)化事件重現(xiàn)突變體PTD1的表型（圖2C），表明點突變破壞第3，4位二硫鍵后的ptd1具有調(diào)控植物株高的功能。

SEQUENCE LISTING

<110> 華南農(nóng)業(yè)大學(xué)

<120> 一種調(diào)控水稻植株株高的方法

<130>

<160> 17

<170> PatentIn version 3.3

<210> 1

<211> 363

<212> DNA

<213> 水稻株高相關(guān)基因ptd1的核苷酸序列

<400> 1

atggctccaa ggtgcgcgac gctggcggtg gtggtggtgc tggtggcggc cgtggtggcg 60

ccgccgacgg cggtgcgcgc ggctatctcg tgctcggcgg tgtacaacac gctgatgccg 120

tgcctgccgt acgtgcaggc ggggggcacg gtgcccaggg cgtgctgcgg cggcattcag 180

agcctgctcg ccgccgccaa caacaccccc gatcgccgca ccatctgcgg ctgcctcaag 240

aacgtcgcca acggcgcctc cgggggcccc tacatcaccc gcgccgccgc gctcccctcc 300

aagtgcaacg tctccctccc ttacaagatc agcaccagcg tcaactgcaa cgcgataaac 360

tag 363

<210> 2

<211> 120

<212> PRT

<213> ptd1編碼的氨基酸序列

<400> 2

Met Ala Pro Arg Cys Ala Thr Leu Ala Val Val Val Val Leu Val Ala

1 5 10 15

Ala Val Val Ala Pro Pro Thr Ala Val Arg Ala Ala Ile Ser Cys Ser

20 25 30

Ala Val Tyr Asn Thr Leu Met Pro Cys Leu Pro Tyr Val Gln Ala Gly

35 40 45

Gly Thr Val Pro Arg Ala Cys Cys Gly Gly Ile Gln Ser Leu Leu Ala

50 55 60

Ala Ala Asn Asn Thr Pro Asp Arg Arg Thr Ile Cys Gly Cys Leu Lys

65 70 75 80

Asn Val Ala Asn Gly Ala Ser Gly Gly Pro Tyr Ile Thr Arg Ala Ala

85 90 95

Ala Leu Pro Ser Lys Cys Asn Val Ser Leu Pro Tyr Lys Ile Ser Thr

100 105 110

Ser Val Asn Cys Asn Ala Ile Asn

115 120

<210> 3

<211> 357

<212> DNA

<213> 突變型PTD1的核苷酸序列

<400> 3

atggctccaa ggtgcgcgac gctggcggtg gtggtggtgc tggtggcggc cgtggtggcg 60

ccgccgacgg cggtgcgcgc ggctatctcg tgctcggcgg tgtacaacac gctgatgccg 120

tgcctgccgt acgtgcaggc ggggggcacg gtgcccaggg cgtgctgcgg cggcattcag 180

agcctgctcg ccgccgccaa caacaccccc gatcgccgca ccatctgcgg ctgcctcaag 240

aacgtcgcca acggcgcctc cgggggcccc tacatcaccc gcgccgccgc gctcccctcc 300

aattcaacgt ctccctccct tacaagatca gcaccagcgt caactgcaac gcgataa 357

<210> 4

<211> 118

<212> PRT

<213> PTD1編碼的氨基酸序列

<400> 4

Met Ala Pro Arg Cys Ala Thr Leu Ala Val Val Val Val Leu Val Ala

1 5 10 15

Ala Val Val Ala Pro Pro Thr Ala Val Arg Ala Ala Ile Ser Cys Ser

20 25 30

Ala Val Tyr Asn Thr Leu Met Pro Cys Leu Pro Tyr Val Gln Ala Gly

35 40 45

Gly Thr Val Pro Arg Ala Cys Cys Gly Gly Ile Gln Ser Leu Leu Ala

50 55 60

Ala Ala Asn Asn Thr Pro Asp Arg Arg Thr Ile Cys Gly Cys Leu Lys

65 70 75 80

Asn Val Ala Asn Gly Ala Ser Gly Gly Pro Tyr Ile Thr Arg Ala Ala

85 90 95

Ala Leu Pro Ser Asn Ser Thr Ser Pro Ser Leu Thr Arg Ser Ala Pro

100 105 110

Ala Ser Thr Ala Thr Arg

115

<210> 5

<211> 2358

<212> DNA

<213> ptd1基因自身啟動子的核苷酸序列

<400> 5

ctcctgctgc tggcctcaca gaccggggca gcagcggctg taaatgtaat cagatggctc 60

tcacatggcc gctgctcgta tagcttcata aattcgtcct tgccacctac acaagcagag 120

ccagcaaccc cgtcgtcaga agtgttggca gatctaaatc tgtaaggaag cagcatctga 180

tgaacccgat cgaccagcat ctagctcatc tagctccgcc atttacgctc gatcgcagag 240

gtgcaatggc tttaggcagg ccacgtccgg ggcaagtcat taaatcagag gtactccatg 300

gctccatgca acagtcacgc gttacggact cgctgtcgcc tgtcggtgaa cgaacctgtg 360

caattctgcg tcatattgga cggtctcgaa ttattggccg aacaatctgg agtctgcagg 420

actatacgtc ggtccatgca gaatttgttc gtcgatctga ttattgtagc aaaaaaccga 480

gctagacaca cgataggatt aggatataca tcgacaccca tagtctcttg caacacgtcg 540

gatctcaatt agtatctgca ctaaccatat tgatctaaca aaacatgatt atagtgtaag 600

atcaatgtgt gttttgattc ttattctgtg atgaacaatt gacatatgtg attatcggtt 660

ttgatatttg gagattatcg tcgaagtggt tttggagata atcaattttc aggagatgaa 720

tagggtttac tgatttgtcg ggaccggtca gaccgggcgg ttgttgccgg tcagacagga 780

gctatgtgag cggtcagacc ggcttgcccg cggtctgacc ggccgacgct gtgtcggttt 840

cggtttcggg ttgtttcttt ggatatccgt gattgtttca tggttatggc ttatagatgg 900

atactatacg tatataatac tgttgtttgc tacgaatgag ttaagttgga gatagcttgg 960

tctcgaaata tggtttcttt gtttgtttca tgtataggtg actcgatgcc tcgggagagt 1020

atttgcggtg atggaccggg agtcggctta gtggtaagac gatatccgtg gtggttagat 1080

atcatacgag atactaagac tagagttgat gcacgtggtt ggtgaagatt ccatatggca 1140

tacgatggag gtattgtgtg cgtatgggat gcggagtcga atttggaagg agtccaaatt 1200

tggtacgatt ggttatgttg agtttctttc ttgtactaga gggtttcgta aggtgtttag 1260

gactcttagt atgagtttgg ttcgtggctt taggctgcct acctcatgta taaatagagg 1320

gggagcgtga ggctttccgg tatcgctttt ttatcgcttt tcaaagcgtg gagttgatag 1380

tttagttagg gtttcgagtt tagtcaagat ttttgtaagg aatgctgttg ttgcactttg 1440

taaacacaga gagaagcaat aaagttgtca tctactttga gagttcttcg atttgtgttt 1500

caccaggttt cggcggtcta accggcatct caccggcggt cagaccggcg acctactggc 1560

ggtcagaccg gctaaggcga ggcggtcaga ccggcggcgg cgacaggagc tggcgattga 1620

tctcggcggt tcgaccggtg ttacaacctc ggtcagaccg acgatatcca ggcggtcaga 1680

ccggcgctac tacttcggtc agaccgcgat ccatcgattt cgaggataac ttttattttc 1740

gctaaatttt ttttgttttt gggtatacca accattcact cctctctggt tggtttagtt 1800

cttgtgattt aatcttacat atagtgagtt ctcgcttgct gtttttgctt ctcttccttt 1860

tgctggagct tattggtttc ttagccagcg tttctagttt ctctttcttt tcctgttccc 1920

gaatcccggg cgatggttgt ccggctgccg tgtcgtgtaa aaacttgctt ttgcttattc 1980

taatagaatg acgtgtaatt ccttgtcaca ttcataaaaa aaatgaatta atcatcgctt 2040

caccgtcaaa agttgtatgg ttaatcctac cgaattgtca aatcgagcat ggcatacgtt 2100

aaaaagctca aacagcaagt gcatcttgca gactacacca tcacagagtc cagaattatc 2160

agaacgatca aacgtctggt aaaaatgcat cccccaaaaa accctcctcc tatttcagtc 2220

aaattctgac cacacacacg gccatctgct accagctcgc gttcttaact cctcccctaa 2280

atgcactcaa caaccttagt aaatccaagc taagcttcct ccgctatata aacaccccca 2340

ggaagcccca ttccatcc 2358

<210> 6

<211> 37

<212> DNA

<213> PTD1-RM-F

<400> 6

ttatggatcc gcggcattgt tgctgtcggg ttcgttc 37

<210> 7

<211> 33

<212> DNA

<213> PTD1-RM-R

<400> 7

attagaattc ctcctgctgc tggcctcaca gac 33

<210> 8

<211> 31

<212> DNA

<213> PTD1-OE-F

<400> 8

attaggtacc gctgacatgg ctccaaggtg c 31

<210> 9

<211> 31

<212> DNA

<213> PTD1-OE-R

<400> 9

ttatggatcc cgccctagtt tatcgcgttg c 31

<210> 10

<211> 25

<212> DNA

<213> HPT-F

<400> 10

gtctccgacc tgatgcagct ctcgg 25

<210> 11

<211> 22

<212> DNA

<213> HPT-R

<400> 11

gtccgtcagg acattgttgg ag 22

<210> 12

<211> 56

<212> DNA

<213> 1300-ptd1 C 102G&C116 G-F

<400> 12

gggaacgtct ccctccctta caagatcagc accagcgtca acgggaacgc gtacgt 56

<210> 13

<211> 57

<212> DNA

<213> 1300-ptd1 C102G&C116 G -R

<400> 13

cccgttgacg ctggtgctga tcttgtaagg gagggagacg ttccccttgg aggggag 57

<210> 14

<211> 42

<212> DNA

<213> 1300-ptd1C56G -F

<400> 14

cccagggcgt gcgggggcgg cattcagagc ctgctcgccg cc 42

<210> 15

<211> 42

<212> DNA

<213> 1300-ptd1C56G-R

<400> 15

ctgaatgccg cccccgcacg ccctgggcac cgtgcccccc gc 42

<210> 16

<211> 42

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<213> 1300-ptd1C76G-F

<400> 16

cgccgcacca tcgggggctg cctcaagaac gtcgccaacg gc 42

<210> 17

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<400> 17

cttgaggcag cccccgatgg tgcggcgatc gggggtgttg tt 42